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Study on separation and purification of total alkaloids and mesaconitine with X-5 macroporous resin

X-5大孔树脂纯化新乌头碱和乌头总碱



全 文 :TheconcentrationsofanemonininreceptorcompartmentatspecifiedtimepointsweredeterminedbyHPLC.Thesteadyfluxandthecu
mulativequantityofanemoninthroughskinwerecalculated.Result:Thefluxofanemoninpermeatingthroughhumanskinfrom30%
ethanol,50% ethanolsolutionandacombinationof3% laurocapm5% polysorbate20and30% ethanol3% laurocapm5% poly
sorbate20ofanemoninwas(930±032),(1856±058),(729±035),(1377±016)μg·cm-2·h-1and79,159,
62,118timeshigherthanfromsaturatedwatersolutionrespectively.Conclusion:Ethanolandlaurocapmcanremarkablyimprove
thetransdermalpermeationofanemoninandtheanemoninhavethepotentialtobedevelopedtonewtransdermalpreparation.
[Keywords]  anemonin;transdermalpermeation;permeationenhancer;ethanol;laurocapm
[责任编辑 鲍 雷]
X-5大孔树脂纯化新乌头碱和乌头总碱
李文兰,王艳萍,季宇彬,范玉奇,赵 培
(哈尔滨商业大学 药物研究所 博士后工作站,黑龙江 哈尔滨 150076)
[摘要] 目的:对影响X-5树脂分离纯化乌头总生物碱和新乌头碱的各种因素进行系统的研究,使分离工艺
达到最优化。方法:以川乌总碱和新乌头碱的含量为指标,考察X-5型大孔树脂分离纯化乌头总生物碱和新乌头
碱的最佳吸附及洗脱条件。结果:X-5树脂纯化乌头总生物碱和新乌头碱的最佳工艺为上样液浓度含生药1g·
mL-1,药液pH12,吸附时间为6h,7BVpH8的95%乙醇洗脱效果好。X-5树脂可重复使用5次。经X-5树脂
处理乌头总碱提取率可达80%以上,终产品总生物碱纯度可达30%以上。结论:该方法能明显提高新乌头碱和乌
头总碱的纯度。
[关键词] 大孔树脂;乌头总碱;新乌头碱;纯化
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)05039605
[收稿日期] 20060715
[基金项目] 哈尔滨市科学计划项目(2004AA3CS1732)
[通讯作者] 李文兰,Tel:(0451)84800297,Email:lwldzd@
163.com
  川乌为毛茛科植物乌头 Aconitumcarmichaeli
Dexb.的干燥母根,为常用中药,有毒,具有祛风除
湿,温经止痛功效,临床上主要用于治疗风湿,类风
湿,关节炎等症。川乌发挥药效的主要成分为其所
含的生物碱类物质。现代药理学试验表明,乌头总
生物碱具有明显的镇痛[1]、抗炎[2]、免疫[3]、抗癫痫
及扩张血管[4]等作用。为了提高产品质量,减少服
用剂量,本实验以川乌总碱和新乌头碱的含量为指
标,考察川乌提取液在 X-5型大孔树脂精制工艺
中的静态吸附曲线及最佳洗脱条件,以优选出大孔
树脂分离川乌提取液中乌头总生物碱和新乌头碱的
工艺条件,为其新药研制奠定一定的基础。
1 仪器、原料与试药
Waters高效液相色谱仪(W2695SeparationsMod
ule,W2996PhotodiodeArayDetector);752紫外分光
光度计(上海光谱仪器有限公司);R-201旋转蒸发
仪(上海申生科技有限公司);恒温水浴锅;真空干燥
箱(上海一恒仪器有限公司);电子天平(美国奥好斯
科技有限公司);川乌(哈尔滨世一堂有限责任公司
厂,经鉴定为毛茛科植物乌头 A.carmichaeli的干燥
母根);新乌头碱及乌头碱对照品(中国药品生物制品
检定所,批号分别为110799200404,110720200308);
AB-8,NKA-9和X-5型大孔吸附树脂(南开大学
化工厂);D-101(天津紫环化工厂);乙腈为色谱纯,
水为双蒸水,其他为分析纯。
2 方法与结果
2.1 大孔吸附树脂的预处理和再生[5]
先于吸附柱内加入相当与装填树脂体积04~
05倍的乙醇,然后将丙酮处理好的大孔树脂装在
一个较大的玻璃柱子中,使其液面高于树脂层约
03m处,并浸泡24h。用2BV乙醇,以2BV·h-1
的流速通过树脂层,并浸泡4~5h。用乙醇以2BV
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·h-1的流速通过树脂层,洗至流出液与水(1∶5)无
混浊停止。然后用水以同样的流速洗净乙醇。再用
相同体积的5%HCl以4~6BV·h-1的流速通过树
脂柱,并浸泡2~4h,而后用水以同样流速洗至流出
液呈中性。用相同体积的5%的 NaOH以4~6BV
·h-1的流速通过树脂柱,并浸泡2~4h,而后用水
以同样流速洗至流出液呈中性,然后将大孔树脂倒
出,放入烧杯中备用。
2.2 上柱样品液的制备
取川乌药材800g加95%乙醇回流提取3次,
每次3h,过滤,合并滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩成
稠膏,稀释使其样品含生药135g·mL-1(含新乌
头碱27mg·mL-1,总生物碱675mg·mL-1)。
2.3 含量测定方法
2.3.1 乌头总生物碱的含量测定 标准曲线的制
备:精密称取乌头碱标准品5mg,置25mL量瓶中,
001moL·L-1盐酸溶液添加至刻度,摇匀,即得
02g·L-1的乌头碱对照品溶液。精密量取乌头碱
标准溶液02,04,06,08,10mL,分别置干燥分
液漏斗中(125mL),加乙酸钠缓冲液50mL与溴
甲酚绿指示液20mL,加蒸馏水使总体积达到100
mL,摇匀。再精密加入氯仿 100mL,充分振摇 3
min,静置1h后,分取氯仿层,用干燥滤纸过滤,弃
去初滤液,收集续滤液至已放入05g无水硫酸钠
的试管中,放置05h。用751型紫外分光光度计,
于416nm处测定吸收度,以浓度为横坐标,吸光度
为纵坐标,得线性回归方程 Y=2635X-00002,
r=09997,线性范围40~200μg。
样品测定方法:将洗脱液浓缩至干,残渣以少量
水溶解,用浓氨水调pH9~10,置分液漏斗中,用氯
仿萃取5次,收集氯仿液并浓缩至干,残渣以001
mol·L-1HCl溶解至10mL量瓶中,并加至刻度,混
匀。精密量取此样品液2mL,按标准曲线制备法测
总生物碱含量。
2.3.2 新乌头碱的含量测定 色谱条件:Symmetry
C18柱(39mm×150mm,5μm);流动相
[6,7]02%
的冰醋酸(用三乙胺调 pH625)乙腈(75∶25);检
测波长232nm;流速08mL·min-1;柱温30℃。
标准曲线的绘制:精密称取新乌头碱对照品14
mg,置5mL的量瓶,用乙腈溶解并稀释成028g·
L-1新乌头碱对照品溶液。分别精密量取新乌头碱对
照品溶液2,4,6,8,10μL进样,以进样量为横坐标,
峰面积为纵坐标,得回归方程 Y=506083X-
246722,r=09996,线性范围056~28μg。
样品测定:将洗脱液浓缩至干,残渣以少量水溶
解,用浓氨水调pH9~10,置分液漏斗中,用氯仿萃
取5次,收集氯仿液并浓缩至干,残渣以乙腈溶解至
5mL量瓶中,并加至刻度,微孔滤膜滤过,取10μL
供HPLC分析。
2.4 大孔树脂的筛选
采用静态吸附法,通过测定吸附残液中的乌头
总碱和新乌头碱含量计算静态吸附容量以筛选合适
树脂。量取预处理过的4种型号的湿大孔树脂各1
g,置50mL小烧杯中,加入10mL样品液(新乌头碱
06mg·mL-1,总碱 15mg·mL-1,生药 3g·
mL-1),浸渍72h,滤过,用蒸馏水洗涤树脂,洗涤液
与滤液合并,测定吸附残液中的指标成分含量,分别
计算静态吸附容量。见表1。
表1 4种大孔树脂对生物碱吸附性能比较
mg·g-1
树脂类型 新乌头碱 乌头总碱
D-101 22 49
X-5 427 1011
AB-8 432 10505
NKA-9 335 835
  从表1可见,不同类型的大孔吸附树脂对2个
指标成分的静态吸附效果有较大的差异,4种树脂
中吸附效果较好的为 AB-8和 X-5,其次为 D-
101,NKA-9。因此,选择X-5树脂进行考察。
2.5 吸附因素的考察
2.5.1 静态吸附等温曲线 将上柱样品液分别稀
释成不同含量的溶液,分别取10mL稀释液,加入到
2gX-5型大孔树脂柱上,以2~4BV·h-1的流速
重吸附2次,吸附10h,收集吸附残液,测定吸附残
液中的指标成分含量,计算2种指标的静态吸附容
量。结果见图1,2。
图1 新乌头碱的静态吸附等温曲线
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图2 乌头总碱的静态吸附等温曲线
  从图1,2中可见,随着药液质量浓度的增加,X
-5树脂的吸附容量逐渐增加。试验中发现药液质
量浓度越大,溶液颜色越深,药液上柱时越易结块阻
塞树脂柱,且吸附的杂质含量也逐渐增大,这也可能
使树脂的使用次数降低。此外尽管其含量越大吸附
容量也增大,但是质量浓度增大后其吸附残液中的
两指标含量也增加,因此,本实验选择生药 1g·
mL-1(新乌头碱02mg·mL-1,总碱5mg·mL-1)
的药液含量为最佳含量,大孔树脂对乌头总碱和新
乌头碱吸附率达95%以上。
2.5.2 静态吸附动力学曲线 取生药1g·mL-1
(新乌头碱02mg·mL-1,总碱5mg·mL-1)药液
10mL,加入到2gX-5型大孔树脂柱上,以2~4
BV·h-1的流速重吸附2次,分别计算吸附05,1,
2,3,4,6,8,10h不同时间乌头总碱和新乌头碱的静
态吸附容量,绘制吸附动力学曲线,见图3,4。
图3 新乌头碱的吸附动力学曲线
图4 乌头总碱的吸附动力学曲线
从图3,4中可以看出,随着吸附时间的延长,吸
附容量逐渐增大,当吸附时间达到6h时,2种树脂
吸附容量不再增加。故将 X-5树脂的最佳吸附时
间确定为6h。
2.5.3 药液pH考察 取生药1g·mL-1(新乌头
碱02mg·mL-1,总碱5mg·mL-1)药液10mL,用
1mol·L-1的 HCl或1mol·L-1的 NaOH调 pH分
别为2,4,6,8,10,12,加入到2gX-5型大孔树脂
柱上,以2~4BV·h-1的流速重吸附2次,吸附6
h,计算2种指标的静态吸附容量。结果见图5,6。
图5 药液pH对X-5树脂吸附新乌头碱的影响
图6 药液pH对X-5树脂吸附乌头总碱的影响
从图5,6可以看出药液 pH对 X-5树脂的吸
附容量有一定的影响,随着药液 pH的增加,其对新
乌头碱和乌头总碱的吸附容量均增加,当药液 pH
12时,吸附率分别为 948%和 97%。故确定药液
的pH12。
综上所述,X-5树脂吸附两指标成分的最佳条
件为样品液含量为生药1g·mL-1(新乌头碱02
mg·mL-1,总碱5mg·mL-1),pH12,吸附时间为6
h,树脂质量与样品液的体积比为1∶4。
2.6 洗脱条件的考察
2.6.1 洗脱液浓度的考察 将已吸附好的树脂先
用10BV的蒸馏水以2~4BV·h-1的流速洗脱,再
用 8BV的 15%,25%,35%,45%,55%,65%,
75%,85%,95%乙醇洗脱,收集洗脱液,测定洗脱液
中的指标成分含量,计算洗脱率。结果见图7,8。
从图7,8可以看出随着乙醇体积分数的增加,
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图7 乙醇体积分数对洗脱新乌头碱的影响
图8 乙醇体积分数对洗脱乌头总碱的影响
X-5树脂对新乌头碱和乌头总碱的洗脱率逐渐增
大。故确定洗脱液为95%乙醇。
2.6.2 洗脱液 pH值的考察 将已吸附好的树脂
先用10BV的蒸馏水以2~4BV·h-1的流速洗脱,
再用8BV用 1mol·L-1的 HCl或 1mol·L-1的
NaOH调pH分别为2,4,6,8,10,12的95%乙醇洗
脱,收集洗脱液,测定洗脱液中的指标成分含量,计
算洗脱率。结果见图9,10。
图9 洗脱液pH对洗脱新乌头碱的影响
图10 洗脱液pH对洗脱乌头总碱的影响
从图9,10可以看出当pH8时,95%乙醇洗脱2
个指标成分的洗脱率均最高,故确定洗脱液pH8。
2.6.3 洗脱液体积的考察 将已吸附好的树脂先
用10BV的蒸馏水以2~4BV·h-1的流速洗脱,分
别用4,5,6,7,8,9的pH8的95%乙醇洗脱,收集洗
脱液,测定洗脱液中的指标成分含量。以洗脱液体
积对洗脱液中新乌头碱和乌头总碱量作洗脱曲线,
见图11,12。
图11 新乌头碱的洗脱曲线
图12 乌头总碱的洗脱曲线
由图11,12可以看出,7BV的洗脱液就可以把
X-5树脂柱上93%以上的新乌头碱和73%以上的
乌头总碱洗脱下来。故确定洗脱液用量为7BV。
2.7 X-5树脂的再生周期考察
将装有 X-5树脂的色谱柱反复进行吸附洗
脱,测定树脂对新乌头碱和乌头总碱的重复吸附能
力,结果见表2。
表2 X-5树脂再生对吸附率的影响
次数
吸附率/%
新乌头碱 乌头总碱
1 991 978
2 990 975
3 985 971
4 978 964
5 962 928
6 858 832
  由表2数据可知,随树脂使用次数增多,其对2
个指标成分的吸附能力逐渐减弱,当树脂重复使用
5次后,吸附能力骤然降低,故确定 X-5树脂的再
生周期为5次。
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2.8 验证实验
将已吸附好的X-5树脂柱先用10BV的蒸馏
水以2~4BV·h-1的流速洗脱,再用7BVpH8的
95%乙醇洗脱,收集洗脱液,在水浴锅上浓缩至恒
重,测定2个指标成分含量及总碱占干膏的比例。
结果见表3。
表3 验证试验
成分
未洗脱前
/mg
洗脱后
/mg
洗脱率
/%
产品总碱纯度
/%
新乌头碱 160 157 9813 3530
乌头总碱 4000 3201 8003  
3 讨论与结论
X-5树脂纯化川乌提取液的最佳吸附工艺是
上样液含量生药1g·mL-1,药液 pH12,吸附时间
为6h,树脂质量与样品液的体积比为1∶4,在此吸
附条件下新乌头碱和乌头总碱的吸附率分别为
94%和97%以上。X-5树脂纯化川乌提取液的最
佳洗脱条件是7BV的 pH8的95%乙醇。在此洗
脱条件下新乌头碱和乌头总碱的洗脱率分别为
98%和80%。洗脱液经减压浓缩、真空干燥,最后
得到褐色干膏,其总碱含量为353%,比文献报道
的含量高10%以上[8]。
在大孔树脂吸附药液中2个指标成分时,药液
的浓度对指标成分的吸附分离的影响十分重要。尽
管本实验结果已表明药液浓度越大,吸附容量越高,
但是浓度太大,易阻塞并污染树脂柱,降低树脂的使
用寿命,故选择浓度较低且澄清的药液为好。
川乌有效成分为生物碱,具有一定碱性,在大孔
树脂的吸附及洗脱过程中药液的 pH影响也尤为重
要。根据化合物结构的特点调整原液pH,可以达到
较好的吸附效果。
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Studyonseparationandpurificationoftotalalkaloidsand
mesaconitinewithX-5macroporousresin
LIWenlan,WANGYanping,JIYubin,FANGYuqi,ZHAOPei
(InstituteofMateriaMedica,HarbinUniversity,CommercePostdoctoralProgramme,Harbin150076,China)
[Abstract] Objective:Tostudysystematicalythefactorswhichafectseparationandpurificationofthetotalalkaloidsand
mesaconitinewithX-5macroporousresin.Method:Withthecontentofthetotalalkaloidsandmesaconitineasparameters,theopti
mumconditionofabsorptionandelutionwerestudiedintheprocessofthepurificationwithX-5macroporousresin.Result:TheX-
5macroporousresinyieldedthebestseparatingeficiencywhentheconcentrationoftheextractedsolutionwas1grawmaterialper1mL,
pH120,theabsorptivetimeof6hourandthevolumeof95% ethanol(7BVpH8)astheeluant;X-5macroporousresinswasused
fivetimesinareproducibleway.Therateofextractionandcontentofthetotalalkaloidwere80% and30% respectivelyafterpurifica
tionwithX-5macroprousresin.Conclusion:Themethodcanincreasethepurityofmesaconitineandtotalalkaloids.
[Keywords]  macroporousresins;thetotalalkaloidsinRadixAconiti;mesaconitine;purification
[责任编辑 鲍 雷]
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