全 文 ：·研究论文·
何首乌毛状根生物转化对苯二酚生产熊果苷的研究
严春艳１，２，张 章２，于荣敏２，孔令义１
（１．中国药科大学 中药学院，江苏 南京 ２１０００９；
２．暨南大学 药学院，广东 广州 ５１０６３２）
［摘要］ 目的：利用何首乌毛状根悬浮培养体系生物合成熊果苷，并对转化条件进行考察。方法：利用何首乌
毛状根培养体系对底物对苯二酚进行生物转化，通过ＨＰＬＣ制定熊果苷标准曲线，以转化产物熊果苷的产量和转
化率为指标，研究了共培养时间、底物加入浓度、培养瓶体积对生物合成熊果苷的影响。同时考察了产物在培养基
中的分泌情况。结果：产物在培养物和培养基中同时存在。熊果苷标准曲线Ｙ＝４４０７４０Ｘ
１４７３（ｒ＝０９９９７）。
当底物加入质量浓度为１１００ｍｇ·Ｌ－１，共培养７２ｈ时，熊果苷的产量（２２２ｇ·Ｌ－１）和转化率（８１４５％）达到最
优。３Ｌ大瓶培养获得成功。结论：本研究大大提高了以生物转化方法生产熊果苷的产量和转化率，并达到了３Ｌ
大瓶培养规模。此外，本研究也为利用生物技术方法大规模生产熊果苷提供了有价值的参考资料。
［关键词］ 何首乌；毛状根；生物转化；熊果苷
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０３０１９２０４
［收稿日期］ ２００６０１１９
［基金项目］ 广东省自然科学基金资助项目（０４０１０４６１）
［通讯作者］ 于荣敏，Ｔｅｌ：（０２０）８５２２３７８４，Ｅｍａｉｌ：ｔｙｒｍ＠ｊｎｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ
植物培养系统内含有许多微生物所不具备的酶
系统，可以生物催化一些在微生物中很难完成的特
殊的反应类型，例如糖基化反应。糖基化反应在众
多的生物转化反应类型中有其独特的应用价值，因
为通过糖基化可以增加药物的水溶性、延长药物的
半衰期和提高药物的生物利用度［１］。国外文献报
道了利用植物培养系统对阿魏酸、水杨酸、鬼臼毒
素、水飞蓟素等药用成分的糖基化研究［２］。
熊果苷，即４羟基苯βＤ吡喃葡萄糖苷，作为美
白剂广泛用于化妆品中［３］。１９９６年Ｄａｅｄａ［４］报道了
熊果苷具有抑制黑色素细胞的酪氨酸酶活性，从而阐
明了熊果苷的美白作用机理。２００３年，我国学者又证
明了该成分具有显著的镇咳、祛痰和平喘作用［５］，有
希望研制开发成为一种新的呼吸系统治疗药物。
何首乌毛状根系于荣敏教授研究组诱导获得并
反复继代４年以上，从７个克隆中优选出适宜悬浮
培养的 Ｎｏ．３毛状根，该毛状根体系不需要加入外
源激素培养，性状稳定，生长旺盛，其继代周期仅９
ｄ，远低于大多数文献中转化系统的继代周期（约３
周左右），显示了良好的应用前景。本试验在前期
研究［６，７］基础上，首次报道利用何首乌毛状根培养
体系生物合成熊果苷的研究。作者以对苯二酚为底
物，以转化产物熊果苷的产量和转化率为指标，通过
ＨＰＬＣ制定熊果苷标准曲线，研究了共培养时间、底
物加入浓度、培养瓶体积对生物合成熊果苷的影响。
此外，还考察了产物在培养基中的分泌情况。
１ 材料与试剂
１．１ 仪器与试剂
ＨＺＴＺ双层震荡器，哈尔滨市东联电子技术开
发有限公司；Ｗ－ＣＪ－ＩＦ型净化工作台，苏州净化设
备厂；梅特勒３２０型ｐＨ计，梅特勒托利多仪器上海
有限公司；ＬＤＸ－４０ＢＩ型立式自动蒸气灭菌器，上
海申安医疗器械厂。Ａｇｉｌｅｎｔ１１００Ｓｅｒｉｅｓ高效液相色
谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ１１００色谱工作站，ＺＯＲＢＡ×ＳＢＣ１８色
谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；薄层色谱（ＴＬＣ）采
用ＧＦ２５４硅胶，青岛海洋化工厂生产。
１．２ 对照品和底物
对苯二酚（杭州市华东医药有限公司，分析
纯）；熊果苷对照品（中国药品生物制品检定所）。
２ 方法
２．１ 何首乌毛状根的培养
何首乌毛状根的诱导及鉴定见文献［６］。本试
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验选用适宜液体培养的 Ｎｏ．３何首乌毛状根克隆。
何首乌毛状根培养于装有１００ｍＬＭＳ基本培养基
（不含激素）的２５０ｍＬ三角瓶中，于黑暗条件下２５
℃震荡培养，摇床转速为１１０ｒ·ｍｉｎ－１。培养基 ｐＨ
５７，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。每９ｄ继代１次，每瓶接种
毛状根鲜重５ｇ。
２．２ 转化产物的检测
取转化后何首乌毛状根培养物５０℃条件下烘
干至恒重，乳钵捻细成粉末状，称取００１ｇ培养物
用５ｍＬ甲醇室温冷浸提取４８ｈ，提取液微孔滤膜过
滤（０４５μｍ）后即可用于ＨＰＬＣ检测。
２．３ 产量、转化率及分泌率的计算
产量＝每瓶毛状根培养物中熊果苷的含量 ＋每瓶培养
基中熊果苷的含量
转化率＝［（转化后毛状根中所含熊果苷的摩尔数 ＋培
养基中熊果苷的摩尔数）／加入培养基中的对苯二酚总摩尔
数］×１００％
分泌率＝培养基中熊果苷的含量／产量×１００％
２．４ 熊果苷生物合成条件的考察
２．４．１ 共培养时间的考察 精确控制接种量，往２１
瓶预培养了９ｄ的何首乌毛状根培养瓶中分别加入
６０ｍｇ·ｍＬ－１的对苯二酚甲醇溶液０５ｍＬ。培养条
件同上。分别于加入底物后１２，２４，３６，４８，７２，９６，１２０
ｈ各取出３瓶终止转化。抽滤获得培养物和培养基，
培养物用少量蒸馏水冲洗干净，洗液与培养基合并。
培养物处理同２２。培养基用蒸馏水定容至１００ｍＬ，
取出１０ｍＬ，－４℃保存备ＨＰＬＣ定量分析。
２．４．２ 底物加入浓度的考察 精确控制接种量，往
２７瓶预培养了８ｄ的何首乌毛状根培养瓶中分别加
入０５ｍＬ的对苯二酚甲醇溶液，使培养瓶中底物的
质量浓度分别达到 １００，２００，３００，５００，７００，９００，
１１００，１５００，２０００ｍｇ·Ｌ－１，每个浓度３瓶。共培
养７２ｈ后终止转化。培养物和培养基的处理同
２．４．１。
２．４．３ 不同体积培养瓶的考察 向 ２５０，１０００，
２０００，３０００ｍＬ的三角瓶中分别装入１００，３００，７００，
１０００ｍＬ的ＭＳ培养基，各瓶分别接种５，１５，３５，５０
ｇ毛状根（鲜重）；培养条件同２．１。预培养８ｄ，各
瓶分别加入对苯二酚的甲醇溶液，使培养基中底物
的质量浓度达到３００ｍｇ·Ｌ－１。共培养７２ｈ后，终
止转化。培养物和培养基的处理同２．４．１（培养基
分别定容至１００，３００，７００，１０００ｍＬ）。
２．５ ＨＰＬＣ测定生物转化毛状根中熊果苷的含量
２．５．１ 色谱条件 流动相乙腈水（２∶９８）；流速
０８ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温３０℃；检测波长２８０ｎｍ；进样
量０５～１５μＬ。
２．５．２ 供试品溶液的制备 各条件下生物转化终
止后，抽滤，得培养物和培养基，培养物的处理同
２．２，得培养物供试液；培养基分别抽滤至澄清后定
容，然后取１０ｍＬ于 －４℃保存，解冻后微孔滤膜
（０４５μｍ）过滤即得培养基供试液。
２．５．３ 标准曲线的制备 精密称取熊果苷标准品
１０ｍｇ，置５０ｍＬ量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，
摇匀即得０２ｍｇ·ｍＬ－１的对照品溶液。在上述色
谱条件下分别进样该对照品溶液０５，１，２，３，４μＬ；
记录峰面积，以标准品进样量为横坐标，峰面积积
分值为纵坐标制作标准曲线。其回归方程为 Ｙ＝
４４０７４０Ｘ－１４７３（ｒ＝０９９９７）。结果表明熊果苷
在０１～０８μｇ线性良好。
２．５．４ 精密度试验 精密吸取同一份样品溶液２
μＬ，重复进样 ６次，熊果苷峰面积积分值的 ＲＳＤ
０６８％。
２．５．５ 重复性试验 取同一批号的样品５份，测定
样品中熊果苷的含量，其ＲＳＤ１７％。
２．５．６ 加样回收率试验 精密称取已知熊果苷含
量的样品（ＨＲＰＰ３０）１０ｍｇ５份，分别置于５ｍＬ量
瓶中，各加入适量的熊果苷标准品溶液进行回收率
试验。结果见表１。
表１ 熊果苷加样回收率
测得量／ｍｇ 回收率／％ 平均值／％ ＲＳＤ／％
０９０ １０４２０
０８９ １０２１９
０８５ ９８７３ １０１８８ ２０８
０８７ １０１２１
０８９ １０３０９
注：样品中含量和加入量均为０４３ｍｇ
２．５．７ 样品测定 分别取不同转化条件下培养物
和培养基供试液进样。培养物供试液进样 １～５
μＬ；培养基供试液进样１０～１５μＬ。分别读取峰面
积，代入上述标准曲线，即得熊果苷含量。
３ 结果
３．１ 转化产物的检测
ＨＰＬＣ检测结果见图１。在实验组培养物中出
现１个新峰，保留时间为８４１６ｍｉｎ，与熊果苷对照
品保留时间相同。
３．２ 共培养时间的考察
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图１ 何首乌毛状根生物合成熊果苷的ＨＰＬＣ图
Ａ．实验培养物甲醇提取物；Ｂ．对照培养物甲醇提取物；
Ｃ．熊果苷标准品；１．熊果苷
不同共培养时间对何首乌毛状根生物合成熊果
苷的影响结果见表２。从表中可以看出，在１２ｈ时，
生物转化已经开始；随着共培养时间的增加，转化率
逐渐升高，当共培养时间达到７２ｈ时，转化率达到
最高（８１９１％），培养物（每瓶５８９８ｍｇ）和培养基
（每瓶１７８ｍｇ）中的产物量均达到最高，同时分泌
率也达到最高（２３１％）。故确定共培养７２ｈ为最
佳共培养时间。
表２ 不同共培养时间对何首乌毛状根生物
合成熊果苷的影响
时间
／ｈ
每瓶产物含量／ｍｇ
培养物 培养基
产量
／ｍｇ
分泌率
／％
转化率
／％
１２ ４３８８ ０５１ ４４３９ １４１ ５９８５
２４ ５０２９ ０８７ ５１１６ １９９ ６８９７
３６ ５０６３ ０９３ ５１５５ １９５ ６９５０
４８ ５１９８ １００ ５２９８ １９４ ７１４３
７２ ５８９８ １７８ ６０７６ ２３１ ８１９１
９６ ５５１７ ０８１ ５５９８ １４９ ７５４７
１２０ ５３６８ ０４５ ５４１３ ０８３ ７２９８
１４４ ５３２４ － ５３２４ － ７１７８
３．３ 底物加入浓度的考察
不同底物浓度对何首乌毛状根生物合成熊果苷
的影响结果见表３，从表中可以看出：每１００ｍＬ培
养基中加入底物 ５０ｍｇ时，转化率（８３０７％）达到
最高；加入底物１５０ｍｇ时，产量（每瓶２４６８３ｍｇ）
达到最高；加入底物２００ｍｇ时，分泌率（１７９８％）以
及培养基中产物量（每瓶２６７６ｍｇ）达到最高。综
合评价，每瓶１１０ｍｇ为最佳底物加入量。
表３ 不同底物浓度对何首乌毛状根生物合成熊果苷的影响
底物加入量
／ｍｇ
底物质量浓度
／ｍｇ·Ｌ－１
每瓶产物含量／ｍｇ
培养物 培养基
每瓶产量
／ｍｇ
分泌率
／％
转化率
／％
１０ １００ １８２０ ０ １８２０ ０ ７３５９
２０ ２００ ３７６３ ０３３ ３７９６ １１２ ７６７６
３０ ３００ ５７６１ ０４７ ５８０８ ０９６ ７８２９
５０ ５００ １００３１ ２４０ １０２７１ ２８２ ８３０７
７０ ７００ １２４０５ ４６１ １２８６６ ４５２ ７４３３
９０ ９００ １７５９０ ６４０ １８２３０ ４４１ ８１９２
１１０ １１００ ２１１７４ ９８１ ２２１５５ ５６５ ８１４５
１５０ １５００ ２２０３５ ２６４８ ２４６８３ １０７３ ７３５９
２００ ２０００ １２２０９ ２６７６ １４８８５ １７９８ ７６７７
注：２５０ｍＬ培养瓶中装入１００ｍＬ培养基
３．４ 不同培养瓶的考察
培养瓶大小对何首乌生物合成熊果苷的影响结
果见表４，从表中可以看出，大小不同培养瓶转化率
没有太大差异。
表４ 不同培养瓶对何首乌生物合成熊果苷的影响
培养基／培养瓶
／ｍＬ
每瓶产物含量／ｍｇ
培养物 培养基
产量
／ｍｇ
分泌率
／％
转化率
／％
１００／２５０ ５８９８ １７８ ６０７６ ２３１ ８１９１
３００／１０００ １７１４７ ８２５ １７９７３ ４８１ ８０７６
７００／２０００ ４１８３９ １７１４ ４３５５３ ４１０ ８３８７
１０００／３０００ ５７１６１ １９７８ ５９１４０ ３４６ ７９７２
注：底物加入质量浓度为３００ｍｇ·Ｌ－１
４ 结论
本试验在固定底物加入时间的前提下，选择了
２个对产量和转化率影响较大的转化条件进行了考
察，进而确定了最佳的共培养时间为７２ｈ，最佳的底
物加入质量浓度为１１００ｍｇ·Ｌ－１。在此条件下熊
果苷的产量达到２２２ｇ·Ｌ－１，是文献［６］报道（４２９
ｍｇ·Ｌ－１）的５１７倍，转化率也较文献高出２４％。
生物转化产物的分布可能存在于培养物或培养
基，也可能两者同时存在。作者首次考察了生物转
化产物熊果苷在培养基中的分泌情况。
本研究还初步尝试了较大规模（１，２，３Ｌ培养
瓶）培养。结果表明：在给定条件下，较大规模培养
是可能实现的。本实验直到３Ｌ的培养瓶时，转化
率仅有少许下降，故本研究为利用生物技术方法大
规模生产熊果苷提供了有价值的参考资料。
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Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ
ＹＡＮＣｈｕｎｙａｎ１，２，ＺＨＡＮＧＺｈａｎｇ２，ＹＵＲｏｎｇｍｉｎ２，ＫＯＮＧＬｉｎｇｙｉ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｓ，ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｒｂｕｔｉｎｂｙ４ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｌｉｎｈａｉｒｙｒｏｏｔｏｆＰｏｌｙｇｏｎｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ．
Ｍｅｔｈｏｄ：４ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｌｗａｓｕｓｅｄａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｗａｓｍａｄｅｂｙＨＰＬＣ，ａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｃｏｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ，
ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅａｄｄｅｄａｎｄｔｈｅｖｏｌｕｍｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅｆｌａｓｋｓｏｎｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｒｂｕｔｉｎｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｔｈｅｉｎｄｅｘｏｆｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｒａｔｅｏｆａｒｂｕｔｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａｒｂｕｔｉｎｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｆｒｏｍｂｏｔｈｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｓａｎｄｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｃｏｒｅｌａ
ｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆａｒｂｕｔｉｎ：Ｙ＝４４０７４０Ｘ－１４７３（ｒ＝０９９９７）．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄ（２２２ｇ·Ｌ－１）ａｎｄｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｉｏ（８１４５％）ｏｆ
ａｒｂｕｔｉｎｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｍｏｕｎｔａｓｃｏｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅａｔ７２ｈ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅａｄｄｅｄｉｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ１１００ｍｇ·Ｌ－１．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅａｌａｒｇｅ
ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆ３Ｌｗａｓａｌｓｏｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｉｎｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩｔｗａｓｆｉｒｓｔｌｙｔｏｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｒｂｕｔｉｎｉｎｈａｉｒｙｒｏｏｔｏｆＰ．ｍｕｌｔｉ
ｆｌｏｒｕｍ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｔｒａｓｆｅｒｒａｔｅｏｆａｒｂｕｔｉｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｌａｒｇｅｌｙ．Ａｎｄｌａｒｇｅｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（３Ｌｃｕｌｔｕｒｅｆｌａｓｋ）ｏｆａｒｂｕ
ｔｉｎｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｉｔｗｏｕｌｄｂｅｖａｌｕａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｒｂｕｔｉｎｂｙｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｉｎｔｈｅｆｕ
ｔｕｒｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ；ｈａｉｒｙｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｓ；ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ａｒｂｕｔｉｎ
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００６０２１０
［基金项目］ 国家科技攻关项目（２００１ＢＡ７０１Ａ５９）
［通讯作者］ 黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１２９５６，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ＠２６３．ｎｅｔ
大黄果实形态和种子发芽特性的初步研究
肖苏萍，陈 敏，黄璐琦，高 峰
（中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：初步了解掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄３种大黄果实形态和发芽特性的差异。方法：收集
不同产地的３种大黄的栽培和野生种种子，观察其果实外观形态，检测其种子净度、千粒重、含水量、生活力和发芽
率，考察不同温度、不同激素对掌叶大黄种子发芽率的影响。结果：３种大黄果实的外观形态和种子的各种物理特
性指标都存在差异，其中药用大黄果实和种子均最大，千粒重也最重，甘肃岷县栽培的掌叶大黄的生活力与发芽率
均较高，分别为９５７％和９４％，其他种大黄的生活力与发芽率基本保持一致；温度对掌叶大黄种子萌发的影响作用
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第３２卷第３期
２００７年２月
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
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