全 文 ：[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ¬±©¯∏¨ ±¦¨ ²©§µ∏ª³µ²³¨µ·¬¨¶²±·«¨ ±¨¦¤³¶∏¯¤·¬²± ©¨©¬¨±¦¼ k∞∞l ¤±§§µ∏ªµ¨¯¨ ¤¶¨ ²©·µ¤±¶©¨µ2
¶²° ¶¨©²µ¤³µ²³¨µ·µ¤±¶©¨µ¶²°¨³µ¨³¤µ¤·¬²±1 Μετηοδ : ײ³µ¨³¤µ¨ ·«¨ ·µ¤±¶©¨µ¶²° ¶¨²©¦²¯¦«¬¦¬±¨ ¶k≤≤l o√¬±¦µ¬¶·¬±¨ ¶∏¯©¤·¨ k∂ ≤• l ¤±§°¬2
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ϖιτροo¤±§¦²°³¤µ¨ ·«¨¬µ§¬©©¨µ¨±¦¨¶1 Ρεσυλτ : ∂ ≤• ¤±§ ⁄‹„⁄ ¤µ¨ ¬¯³²³«¬¯¬¦²µ«¼§µ²³«¬¯¬¦o ²º¬±ª ³²¶¬·¬√¨ ¦«¤µª¨¶¤±§ ¤¯µª¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ
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[ Κεψ ωορδσ] ·µ¤±¶©¨µ¶²° ¶¨~²¯¦«¬¦¬±¨ ~√¬±¦µ¬¶·¬±¨ ¶∏¯©¤·¨ ~ °¬·²¬¤±·µ²±¨ «¼§µ²¦«¯²µ¬§¨ ~ ±¨¦¤³¶∏¯¤·¬²± ©¨©¬¨±¦¼~§µ∏ªµ¨¯¨ ¤¶¨ ιν ϖιτρο
≈责任编辑 鲍 雷 
≈收稿日期  ussx2sv2tt
≈基金项目  国家自然科学基金项目kvsvztz{vl ~中国博士后
科学基金项目kusswsvyw|wl
≈通讯作者  3 周莉玲 oר¯ }ksusl vyx{xuuv o{yvyssst o ∞2°¤¬¯}
½«²∏¯¬¯¬±ªztz ƒ ¶¬±¤q¦²°
青藤碱脂质体包封率的测定
周莉玲t 3 o王 岩t o刘清飞u o凌家俊t
kt1 广州中医药大学 o广东 广州 xtswsx ~u1 清华大学 药物研究所 o北京 tsss{wl
≈摘要  目的 }建立青藤碱脂质体包封率的测定方法 ∀方法 }分别采用凝胶过滤法 !微柱离心法 !透析法分离
脂质体和游离药物 o并进行方法学考察 o优化包封率测定条件 ∀结果 }凝胶过滤法能有效地将青藤碱脂质体与游离
青藤碱分离 o柱回收率测定结果为 |{1{ h ov次包封率测定的平均值为 yw1| h o• ≥⁄为 u1yz h ∀结论 }凝胶过滤法较
为简便 o结果重复性好 o适于青藤碱脂质体包封率的测定 ∀
≈关键词  青藤碱脂质体 ~包封率 ~凝胶过滤法 ~微柱离心法 ~透析法
≈中图分类号  • |ww1u ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyls|2szvt2sw
青藤碱k¶¬±²°¨ ±¬±¨ l是从防己科植物 Σινοµενι2
υµ αχυτυµ k׫∏±¥l • «¨§ ·¨º¬¯¶的藤茎中提取的一种
生物碱单体 o为治疗风湿及类风湿性关节炎的常用
药物 ∀由于其生物半衰期短 o大鼠体内的 τtru仅为
w{1xs °¬±≈t  o因此代谢较快 ∀基础研究还发现 o青藤
碱在大鼠体内的口服生物利用度较低 o仅为
tx h ≈u  o因此口服制剂不利于其发挥疗效 ∀将青藤
碱包封于脂质体内 o再制成经皮给药制剂 o能增加药
物在局部组织的积累并起到持续释药的作用 o相对
减少全身吸收以避免不良反应 o有效地弥补上述缺
陷 o提高临床疗效 ∀本实验应用薄膜分散法制备的
青藤碱脂质体 o分别对凝胶过滤法 !微柱离心法 !透
析法等 v种包封率测定方法进行了比较研究 o并进
行方法学考察 o优化了包封率测定条件 ∀
1 仪器与材料
≥∏°°¬·°y{s型高效液相色谱仪 o°⁄„ p tss型
二极管阵列检测器 o„≥Œp tss型自动进样器k德国
⁄¬²±¨ ¬公司l ~• ∞xu„ 型旋转薄膜蒸发器k上海亚荣
生化仪器厂l ~青藤碱对照品k中国药品生物制品检
定所 o批号 szzw2||sw o含量测定用l ~青藤碱结晶k自
制 o制备工艺用l ~大豆卵磷脂k上海伯奥生物科技有
限公司 o批号 stsytxl ~胆固醇k上海源聚生物科技有
限公司 o批号 susutxl ~维生素 ∞k广州市万利隆化工
有限公司 o批号 susvuul ∀
2 方法与结果
211 青藤碱脂质体的制备
采用薄膜蒸发法制备 ∀取青藤碱 o豆磷脂 o胆固
醇 o维生素 ∞o置茄形瓶中 o加入氯仿 o振摇使完全溶
解 o即得类脂溶液 ∀将茄形瓶置旋转蒸发器上 o加入
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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数粒直径 v ∗ w °°左右的玻璃珠 o于 wx ε 减压蒸发
溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜 o通入氮气 ts
°¬±使溶剂除尽 ~加入磷酸盐缓冲液k°…≥ o³‹ z1w o
以下同l常压旋转洗膜 o转移至锥形瓶瓶中 o超声乳
化 o即得青藤碱脂质体混悬液 ∀
212 脂质体的显微形态观察
采用透射电镜法 o用磷钨酸负染法制样 o对脂质
体进行了显微形态观察 ∀取 t滴青藤碱脂质体混悬
液滴于点滴反应瓷板的凹槽内 o将喷碳铜网置于试
液上k膜面向下l ot ∗ u °¬±后取出铜网 o用滤纸从铜
网边缘吸干多余液体 ~按上述同样方法 o将该铜网放
在染液滴上kw h磷钨酸溶液 o³‹ y1xl约 vs ¶o用滤
纸从铜网边缘吸干多余染液 o自然挥干 o用透射电子
显微镜观察并拍摄照片 o结果见图 t ∀可见青藤碱
脂质体在结构上均属于单室脂质体 o其主要粒径大
小约 xs ±°∀
图 t 薄膜分散法制备的青藤碱脂质体照片
213 青藤碱含量测定方法的建立
21311 破乳溶剂的选择 破坏脂质体双分子乳化
层 o使被包封药物完全溶出 o是测定脂质体包封率和
药物含量的关键一步 ∀脂质体乳化层的破坏是否彻
底 o直接影响到测定结果的准确性 ∀故在包封率测
定之前 o根据脂质体膜材和青藤碱的溶解性质 o选择
不同含量的乙醇溶液进行破乳溶剂的筛选 ∀
21312 液相色谱条件与系统适用性试验 ‹¼³¨µ¶¬¯
≤t{反相色谱柱kw1y °° ≅ uxs °° ox Λ°l o流动相甲
醇2水2乙二胺 kxsΒxsΒs1uxl o柱温室温 o检测波长
uyx ±° o流速 t1s °#°¬±pt ∀理论塔板数按青藤峰
计算不应低于 u sss ∀在此条件下与其他成分达到
良好的分离 o且阴性对照液对测定无干扰 ∀
21313 对照品溶液的制备 精密称取 ys ε 减压干
燥至恒重的青藤碱对照品 y1{u °ªo置 ux °量瓶
中 o加甲醇溶解并稀释至刻度 o摇匀 o配成含青藤碱
s1uzu { °ª#°pt的对照品溶液 ∀
21314 线性范围考察 精密吸取上述对照品溶液
u ow oy o{ ots otu oty ous ˏo进样 o测定峰面积 ∀以对
照品峰面积kΨl对样品量k Ξ oΛªl进行线性回归 o回
归方程 Ψ€ z1{tv Ξ , ρ€ s1||| v o为一条通过原点的
直线 o因此用外标一点法定量 o青藤碱在 s1xwx y ∗
x1wxy Λª线性关系良好 ∀
21315 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液 ts
ˏo连续进样 x次 o分别测定青藤碱的峰面积 ∀结果
• ≥⁄t1xw h o表明精密度良好 ∀
21316 供试品溶液的测定 精密量取脂质体 s1x
°o分别置 t ou ox ots oux °量瓶中 o加无水乙醇定
容至刻度k即溶液中乙醇含量为 xs h ozx h o|s h o
|x h o|{ h l o摇匀 o以 s1wx Λ°微孔滤膜滤过 o以外
标一点法测定青藤碱的含量 ∀结果见表 t o可见当
溶液中乙醇含量在 |s h以下时青藤碱破乳不完全 ~
|s h以上含量时脂质体乳化层即可被完全破坏 o乙
醇含量为 |s h o|x h o|{ h时结果差异不大 ∀因此破
乳溶液中含乙醇含量应大于 |s h ∀
表 t 脂质体破乳溶剂选择结果kcξ ? σ, ν € vl
乙醇含量r h 青藤碱含量r°ª#°pt
xs t qxx ? s qtt
zx t q{w ? s qsx
|s t q|y ? s qsy
|x t q|v ? s qsx
|{ t q|x ? s qsv
214 凝胶过滤法测定包封率
21411 凝胶柱的装填 取一根底部装有筛板的玻
璃柱kts °° ≅ tss °°l o在不断搅拌下缓缓加入用
°…≥溶液溶胀 tu «的 ≥¨ ³«¤§¨¬ Š2xs凝胶 x ªo排除气
泡 o以缓冲液不断冲洗使柱装紧 o平衡后备用 ∀
21412 洗脱曲线的考察 精密吸取青藤碱脂质体
混悬液 s1x °o加于 ≥¨ ³«¤§¨¬ Š2xs凝胶柱顶部 o以
°…≥溶液洗脱 o流速 t °#°¬±pt o收集洗脱液 o每份
t °o分别用无水乙醇定容至 ts °o摇匀k此时溶
液中乙醇含量为 |s h l o采用紫外分光光度法 o以
|s h乙醇溶液作为空白 o于 uyx ±°下测定溶液的吸
光度 o以洗脱体积为横坐标 o溶液吸光度为纵坐标 o
制备洗脱曲线 o结果见图 u ∀
其中 o最先流出的 w °洗脱液为 °…≥溶液 ow ∗
tt °洗脱液为青藤碱脂质体混悬液 ott ∗ ty °洗
脱液为 °…≥溶液 oty ∗ uw °洗脱液为游离青藤碱
溶液 ∀
21413 包封率的测定 精密吸取青藤碱脂质体混
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图 u 凝胶过滤法测定青藤碱脂质体洗脱曲线k ν € vl
悬液 s1x °o加于 ≥¨ ³«¤§¨¬ Š2xs 凝胶柱顶部 o以
°…≥溶液洗脱 o流速 t °#°¬±pt o收集 w ∗ tt °洗
脱液 o用氮气吹至体积约 s1x °o加无水乙醇定容
至 ts °o摇匀 ∀精密吸取 ts ˏ溶液 o进样 o测定峰
面积 o用外标一点法计算青藤碱的含量 o计为 Μ¯¬³~
另精密吸取青藤碱脂质体混悬液 s1x °o用无水乙
醇定容至 ts °o摇匀 ∀精密吸取 ts ˏ溶液 o同法
测定 o计为 Μ·²·∀按下式计算包封率 }
包封率k h l € k Μ¯¬³r Μ·²·l ≅ tss h
Μ¯¬³为脂质体中所包封青藤碱的量 ~Μ·²·为脂质
体混悬液中所含的青藤碱总量 ∀结果见表 u ∀
表 u v种方法的包封率
测定方法 包封率r h 平均值r h • ≥⁄r h
凝胶过滤 yv qw yw q| u qyz
yy q{
yw qx
微柱离心 y| qv yw qw z qwx
x| qz
yw qv
透析 yt q{ x| q| u q{w
x{ qy
x| qu
21414 柱回收率试验 精密量取已知含量的游离
青藤碱 °…≥溶液 s1x °o加于 ≥¨ ³«¤§¨¬ Š2xs凝胶柱
顶部 o以 °…≥溶液洗脱 o流速 t °#°¬±pt o收集 vu ∗
w{ °洗脱液 o用氮气吹至体积约 s1x °o用无水乙
醇定容至 ts °o摇匀 ∀精密吸取 ts ˏ溶液 o按上
述色谱条件进样 o测定过柱后青藤碱的含量 o计算柱
回收率 ∀结果平均回收率为 |{1{ h k ν € xl o表明该
方法可行 ∀
215 微型柱离心法测定包封率
21511 微型柱的制备 取一 x °注射针筒 o底部
放一略小于其内径的圆形带孔滤膜 o加入 x ª经 °…≥
溶液浸泡饱和过的葡聚糖凝胶kŠ2xs oxs ∗ tss目l ∀
将装好的注射器放入离心管内 xss µ#°¬±pt慢速离
心 x °¬±o除去多余的缓冲液 o备用 ∀
21512 洗脱曲线的考察 精密吸取青藤碱脂质体
混悬液 s1x °o缓缓加于柱顶部 o注意勿滴入柱床
边缘 oxss µ#°¬±pt离心 x °¬±o使青藤碱进入凝胶柱
中 ∀由柱顶部加入相同体积的 °…≥溶液 ot xss µ#
°¬±pt离心 x °¬±o收集滤过液 o再于柱顶部加入相同
体积的 °…≥溶液 o重复以上操作 o滤过液用无水乙
醇定容至 ts °k此时溶液中乙醇含量为 |x h l o采
用紫外分光光度法 o以相应溶剂作为空白 o于 uyx
±°处测定每一份滤过液的吸收度 o制备洗脱曲线 o
结果见图 v ∀
图 v 微柱离心法测定青藤碱脂质体洗脱曲线k ν € vl
其中 ot ∗ v管滤过液为青藤碱脂质体混悬液 o
v ∗ {管滤过液为游离青藤碱溶液 ∀但 u个组分之间
不存在空白间隔 ou个组分有交叉 ∀
21513 包封率的测定 精密吸取青藤碱脂质体混
悬液 s1x °o缓缓加于柱顶部 oxss µ#°¬±pt离心 x
°¬±∀由柱顶部加入相同体积的 °…≥溶液 ot xss µ#
°¬±pt离心 x °¬±o收集滤过液 o再于柱顶部加入相同
体积的 °…≥溶液 o重复以上操作 o合并 t ∗ v管滤过
液 o用氮气吹至体积约 s1x °o加无水乙醇稀释并
定容至 ts °o摇匀 ∀精密吸取 ts ˏ溶液 o进样 o测
定峰面积 o用外标一点法计算青藤碱的含量 o同凝胶
过滤法计算脂质体的包封率 o结果见表 u ∀
216 透析法测定包封率
精密量取青藤碱脂质体混悬液 ts °o置透析
袋中封口 o在室温下以 °…≥溶液 t sss °作为外液
进行透析 o同时用磁力搅拌器搅拌 otu «后更换透析
液 o继续透析 tu «∀将透析袋内溶液取出 o用氮气室
温浓缩至 ts °o定容 ∀精密量取已除去游离青藤
碱的脂质体混悬液 s1x °o用无水乙醇稀释并定容
至 ts °o摇匀k此时溶液中乙醇含量为 |x h l ∀精
密吸取 ts ˏ溶液 o进样 o测定峰面积 o用外标一点
法计算青藤碱的含量 o同凝胶过滤法计算脂质体的
包封率 o结果见表 u ∀
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比较以上 v种方法 o包封率接近 o其中以凝胶过
滤法较为简便 o结果准确 o重复性好 o确定用于测定
青藤碱脂质体的包封率 ∀
3 讨论
脂质体包封率的测定方法对于脂质体的质量评
价至关重要 ∀所包封药物不同 o脂质体的种类及所
用膜材不同 o适宜采用的测定方法亦不相同 ∀为了
使被包封药物与游离药物得到有效地分离 o本研究
考察了 v种常用的包封率测定方法 ∀
311 微柱离心法是一种快速 !简便地分离脂质体内
外相中小分子药物的方法 o适用于样品量小 !小分子
渗漏较快时的包封率测定及药物从脂质体内渗漏的
研究 o其优点是脂质体混悬液几乎没有被稀释 o可避
免脂质体的渗漏 ∀在本试验中脂质体组分与游离青
藤碱组分之间分离度不佳 o存在组分交叉现象 o重复
测出的结果偏差较大 o• ≥⁄超过 x h o可能与在长时
间高速离心的条件下 o部分含药脂质体被破坏导致
药物渗漏有关 ∀
312 透析法是设备要求最简便的分离方法 o将脂质
体混悬液注入适当的透析袋内 o外面为基本等渗的
介质k避免因渗透压差引起脂质体包封率的变化l o
利用游离药物可透过半透膜而脂质体不能透过而分
离 o其缺点是耗时较长 ∀本试验中测出的结果虽然
也具有良好的重复性 o但数值较凝胶过滤法测出的
结果偏低 o可能是被包封的药物在长时间的膜平衡
中有部分渗漏的缘故 ∀
313 凝胶过滤法是利用分子筛的原理 o使混合组分
依据分子的大小不同而得到分离 ∀脂质体由于其分
子比游离药物大 o不易进入凝胶内部而先被洗脱 o游
离药物后被洗脱 ∀该法操作简便 o减少了误差传递 o
避免了微柱离心法在离心过程中可能发生的脂质体
变形与破裂现象以及透析法费时 !被包封药物在长
时间的膜平衡中渗漏造成结果偏低的缺点 ∀在本试
验中 o凝胶过滤法能有效地将青藤碱脂质体与游离
青藤碱分离开 o且 v次测出的包封率结果接近 o重复
性好 o柱回收率高 o适于青藤碱脂质体包封率的测
定 ∀
≈参考文献 
≈t  周莉玲 o李 锐 o周 华 q青藤碱制剂药动学试验中药物累积
法与血药浓度法的相关性研究 q中成药 ot||y ot{k|l }t1
≈u  朱春燕 o阮金秀 q盐酸青藤碱经皮和口服给药后局部药物浓度
与血药浓度的研究 q中国药理学会通讯 ot||z otwkvl }tv1
Στυδψ ον δετερµινατιον οφ εντραπ µεντ εφφιχιενχψ οφ
σινοµενινελιποσοµεσ
‹’˜ ¬2¯¬±ªt o • „‘Š ≠¤±t oŒ˜ ±¬±ª2©¨¬u oŒ‘Š ¬¤2­∏±t
(t . Γυανγζηου Υνιϖερσιτψ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Γυανγζηου xtswsx , Χηινα ;
u . Ινστιτυτε οφ Ματερια Μεδιχα οφ Τσινγηυα Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsss{w , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ¶¨·¤¥¯¬¶«¤± ‹°≤ ° ·¨«²§©²µ·«¨ §¨·¨µ°¬±¤·¬²± ²© ±¨·µ¤³° ±¨·¨©©¬¦¬¨±¦¼ ²©¶¬±²° ±¨¬±¨ ¬¯³²¶²° ¶¨q Μετηοδ :
׫¨ ¬¯³²¶²° ¶¨¤±§§¬¶¶²¦¬¤·¨§§µ∏ª¶º µ¨¨ ¶¨³¤µ¤·¨§¥¼ ¶¨³«¤§¨¬©¬¯·µ¤·¬²±o°¬±¬2¦²¯∏°± ¦¨±·µ¬©∏ª¤·¬²± ¤±§§¬¤¯¼¶¬¶q׫¨ ° ·¨«²§²¯²ª¼¶·∏§¼ ¤±§
·«¨ ²³·¬°¬½¤·¬²± ²©§¨·¨µ°¬±¬±ª¦²±§¬·¬²± º µ¨¨ ¦¤µµ¬¨§²∏·¤··«¨ ¶¤°¨·¬°¨q Ρεσυλτ : ≥¨ ³«¤§¨¬©¬¯·µ¤·¬²± ¦²∏¯§ ©¨©¨¦·¬√¨¯¼ ¶¨³¤µ¤·¨·«¨ ¶¬±²° 2¨
±¬±¨ ¬¯³²¶²° ¶¨©µ²° §¬¶¶²¦¬¤·¨§¶¬±²° ±¨¬±¨ q׫¨ ¦²¯∏°± µ¨¦²√ µ¨¼ º¤¶|{1{ h o·«¨ ¤√ µ¨¤ª¨ ±¨·µ¤³° ±¨·¨ ©©¬¦¬¨±¦¼ ²©·«µ¨¨·¨¶·¶º¤¶yw1| h o
• ≥⁄u1yz h q Χονχλυσιον : ׫¨ ° ·¨«²§º¤¶¶¬°³¯¨o ¬¨¤¦·o¤±§«¤§¤ª²²§µ¨¤³³¨ ¤µ¤±¦¨ qŒ·¦¤± ¥¨ ∏¶¨§·² ¬¨¤°¬±¨ ·«¨ ±¨·µ¤³° ±¨·¨©©¬¦¬¨±¦¼
²©¶¬±²° ±¨¬±¨ ¬¯³²¶²° ¶¨q
[ Κεψ ωορδσ] ¶¬±²° ±¨¬±¨ ¬¯³²¶²° ¶¨~ ±¨·µ¤³° ±¨·¨ ©©¬¦¬¨±¦¼~¶¨³«¤§¨¬©¬¯·µ¤·¬²±~ °¬±¬2¦²¯∏°± ¦¨±·µ¬©∏ª¤·¬²±~§¬¤¯¼¶¬¶
≈责任编辑 刘  
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