全 文 ：ＨＰＬＣＭＳ与 ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ联用鉴定土茯苓中的
二氢黄酮醇苷异构体
王映红１，李 磊２，张宏桂２，乔延江２
（１．中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 １０００５０；
２．北京中医药大学 中药学院，北京 １００１０２）
［摘要］ 目的：鉴定土茯苓中的二氢黄酮醇苷异构体。方法：采用高效液相色谱质谱法（ＨＰＬＣＭＳ）与高效液
相色谱核磁共振氢谱法（ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ）对土茯苓提取液中的二氢黄酮醇苷类成分进行分析鉴定。结果：从土茯
苓中鉴定出４个二氢黄酮醇苷异构体，分别为落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷和新异落新妇苷。结论：该法能
简单、快速地鉴别土茯苓中的二氢黄酮醇苷类成分。
［关键词］ 土茯苓；二氢黄酮醇苷；ＨＰＬＣＭＳ；ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１１１２８１０４
［收稿日期］ ２００７１１０８
［通讯作者］ 乔延江，Ｔｅｌ：（０１０）８４７３８６０１，Ｅｍａｉｌ：ｙｊｑｉａｏ＠
２６３．ｎｅｔ
天然药物的开发是２１世纪新药研究的热点之
一。天然资源活性成分的分离和结构鉴定是新药研
究的重大课题。近些年来，在天然产物的研发上，尽
量减少对已知结构的重新分析鉴定是现代药物分析
鉴定研发过程中很重要的一个原则，因此，ＨＰＬＣ
ＮＭＲ在天然产物结构分析及构效关系研究中的应
用受到关注［１］，其不仅可用于天然产物混合物结构
的鉴定，而且在生物合成、化学分类学、天然产物代
谢物、酶研究等领域的天然产物分析中成为极为有
用的工具［２］。
土茯苓为百合科植物光叶菝葜 Ｓｍｉｌａｘｇｌａｂｒａ
Ｒｏｘｂ．的干燥根茎［３］。有除湿，解毒，通利关节之功
效。临床用于湿热淋浊，带下，痈肿，瘰疬，疥癣，梅
毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛。文献报道
其主要化学成分为黄酮类、有机酸类、甾醇类及酚苷
类［４，５］等。为有效控制土茯苓药材的质量，本研究
对其进行了指纹图谱研究［６］，在此实验研究基础
上，采用ＨＰＬＣＭＳ和ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ联用技术鉴定
了土茯苓中４种互为同分异构体的二氢黄酮醇苷化
合物，简化了分离和纯化过程，为中药化学成分的分
析鉴定提供了１种方法。
１ 仪器与试药
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣＭＳＤＴＲＡＰＸＣＴＰＬＵＳ系统，含
在线真空脱气机、高压二元梯度泵、自动进样器、柱温
箱、二极管阵列检测器、电喷雾（ＥＳＩ）接口，ＨＰＣｈｅｍ
ｓｔａｔｉｏｎＲｅｖＡ０８０３色谱工作站（美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；
美国ＶａｒｉａｎＩＮＯＶＡ５００ＨＰＬＣＮＭＲ联用系统。
乙腈为色谱纯，水为娃哈哈饮用纯净水，其他试
剂均为分析纯。落新妇苷为本实验室自制（本实验室
从土茯苓中提取、精制，经１ＨＮＭＲ和１３ＣＮＭＲ确定
为落新妇苷，归一化法测定含量大于９８％）；土茯苓
药材采自湖南沅陵，经北京中医药大学阎玉凝教授鉴
定为百合科植物光叶菝葜Ｓ．ｇｌａｂｒａ的干燥根茎。
２ 方法
２．１ ＨＰＬＣＭＳ色谱条件 供试品溶液的制备取干
燥的土茯苓药材粉末（过 ４０目筛）约 １ｇ，精密称
定，置５０ｍＬ具塞锥形瓶中，加７０％乙醇２５ｍＬ，密
塞，称定质量，超声处理２０ｍｉｎ，补足失重，经０４５
μｍ滤膜滤过，作为供试品溶液。
色谱条件 ＹＭＣＰａｃｋＯＤＳＡ色谱柱（４６
ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相乙腈（Ａ）００５％甲酸
水溶液（Ｂ），梯度洗脱程序 ０～１０ｍｉｎ５％ ～２０％
Ａ，１０～４５ｍｉｎ２０％ ～５５％ Ａ，４５～５５ｍｉｎ５５％ ～
９０％ Ａ。流速０８ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长２９０ｎｍ；柱
温２５℃；进样量２０μＬ。
质谱条件 检测方式 ＥＳＩ（－）；干燥气流速为
１０Ｌ·ｍｉｎ－１，雾化室压强２７５８４ｋＰａ，干燥气温度
３５０℃，分流比１∶４，毛细管电压４０００ｅＶ，扫描范围
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ｍ／ｚ１００～１０００。
２．２ ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ色谱条件 供试品溶液的制
备：将土茯苓药材粉碎，用７０％的乙醇回流提取 ３
次，减压回收溶剂，将所得浸膏用水混悬后，用醋酸
乙酯萃取，所得醋酸乙酯萃取物浓缩后进行硅胶柱
色谱（２００～３００目），用二氯甲烷、醋酸乙酯和甲酸
混合液进行洗脱，薄层色谱检测跟踪，合并洗脱液，
浓缩得到二氢黄酮醇苷混合组分（含３～６号色谱
峰）。取该混合组分约５ｍｇ，用２００μＬ甲醇溶解，
作为供试品溶液。
色谱条件 流动相乙腈（Ａ）００５％甲酸的Ｄ２Ｏ
溶液（Ｂ）。其余液相色谱条件同２．１项下条件。
核磁条件 用停止流动的方法分别采集 ＨＰＬＣ
１ＨＮＭＲ谱，用 ＷＥＴ方式压制溶剂峰。谱宽 ７５００
Ｈｚ，采样时间１５ｓ，驰豫时间１ｓ，采样数据点１６Ｋ，
累加次数２５６。
３ 结果
３．１ ＨＰＬＣＭＳ分析 按照２．１色谱条件，取土茯
苓样品溶液进样分析，分别得到土茯苓样品的
ＨＰＬＣ图（图１）、质谱总离子流图（图２）和一级质谱
图。由图１可见土茯苓样品的ＨＰＬＣ色谱图主含１０
个色谱峰，各色谱峰之间实现了较好的分离。在此
液相色谱条件下，４号峰与落新妇苷对照品的保留
时间相同，紫外光谱也相同，并且在供试品溶液中加
入落新妇苷对照品溶液后，该组分得到了相应的色
谱峰增益，由此判断４号峰为落新妇苷。通过比较
二极管阵列检测器给出的各色谱峰的紫外光谱图，
发现３，５，６号峰的紫外光谱图与４号峰非常类似，
为典型的二氢黄酮醇类化合物。３～６号色谱峰相
应的一级质谱图（图 ３～６）给出的准分子离子峰
（［Ｍ－Ｈ］－）的ｍ／ｚ分别为４５０４，４４９６，４５００和
４５０２，由此推断３～６号色谱峰所代表的化合物为
二氢黄酮醇苷类异构体。
图１ 土茯苓样品的ＨＰＬＣ图
图２ 土茯苓样品的ＨＰＬＣＭＳ总离子流图
图３ ３号峰的质谱图
图４ ４号峰的质谱图
图５ ５号峰的质谱图
图６ ６号峰的质谱图
３．２ ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ分析 为得到更多的相关化合
物的结构信息，进一步明确３，５，６号色谱峰所代表
的化合物的结构，作者对土茯苓供试品溶液进行了
ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ分析，得到了３～６号色谱峰相应的
核磁共振氢谱数据（表１）。数据结果显示该４种化
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合物Ｈ２和Ｈ３的化学位移与其偶合常数以及糖的
端基质子的化学位移存在较大的差异。结合落新妇
苷（４号峰）的结构，并与文献［７］对照，确定３号峰
为新落新妇苷，４号峰为落新妇苷，５号峰为新异落
新妇苷，６号峰为异落新妇苷。３～６号色谱峰所代
表的化合物的结构见图７。
表１ ３～６号色谱峰相应的１ＨＮＭＲ数据（ＤＭＳＯｄ６，５００ＭＨｚ）
Ｎｏ． ３ ４ ５ ６
２ ５２８（ｄ，９８） ５３４（ｄ，１００） ５６９（ｄ，２１） ５５７（ｄ，２４）
３ ４７７（ｄ，９８） ４６３（ｄ，１００） ４２０（ｄ，２１） ４２２（ｄ，２４）
６ ６１１（ｓ） ６１１（ｓ） ６２１（ｓ） ６１１（ｄ，１５）
８ ６０６（ｓ） ６１０（ｓ） ６１９（ｓ） ６０６（ｄ，１５）
２′ ７１１（ｓ） ７０８（ｓ） ７１６（ｓ） ６９８（ｓ）
５′ ６９７（ｓ） ６９９（ｓ） ７０４（ｓ） ６９２（ｓ）
６′ ６９７（ｓ） ６９９（ｓ） ７０５（ｓ） ６９２（ｓ）
１″ ４９９（ｓ） ４１６（ｓ） ４２７（ｓ） ４８９（ｓ）
２″ ３６３（ｂｒｓ） ３６２（ｓ） ３７９（ｂｒｓ） ３７１（ｓ）
３″ ３３４（ｍ） ３６８（ｄｄ，９５，３５） ３４８（ｍ） ３３９（ｄｄ，９５，３５）
４″ ３２０（ｍ） ３３５（ｍ） ３３８（ｍ） ３１８（ｍ）
５″ ２４５（ｍ） ４００（ｍ） ３６７（ｍ） ２３９（ｍ）
６″ ０８７（ｄ，６０） １１９（ｄ，６５） １１６（ｄ，５５） ０８７（ｄ，６０）
图７ 新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷和
异落新妇苷结构
４ 讨论
ＨＰＬＣＭＳ技术集色谱分离与质谱定性于一体，
在分析过程中，利用二极管阵列检测器，可初步判断
化合物的结构类型；利用一级质谱给出的化合物的
准分子离子峰，结合色谱保留时间并与文献对照从
而能够对化合物的结构进行预测。但是，当化合物
结构非常相似（如本实验中的３～６号色谱峰），它
们的多级质谱裂解规律相同时，质谱提供的信息不
足以确定化合物的结构，表明质谱在同分异构体鉴
定中存在一定的缺陷。
本研究在对土茯苓样品进行 ＨＰＬＣＭＳ分析的
基础上，又对其进行了ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ分析，利用核
磁共振氢谱中各氢质子之间化学位移及偶合常数的
不同，对具有相同分子质量的３～６号色谱峰的结构
进行推断，弥补了质谱在同分异构体鉴定中的不足。
本研究采用 ＨＰＬＣＭＳ与 ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ对土
茯苓中的二氢黄酮醇苷类化合物进行了鉴定，避免
了传统的分离单体成分再做结构鉴定的繁琐过程，
从而能提高效率，减少资源浪费，同时可以简便快速
的获得各化合物的分子结构信息，进行定性分析。
［参考文献］
［１］ ＷｉｌｉａｍＮＳ，ＢｅｒｎｈａｒｄＶＨＰＬＣＮＭＲ／ＨＰＬＣＭＳａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ
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合杂志，１９９８，１１（７）：６４３．
［５］ 袁久志，窦德强，陈英杰，等．土茯苓酚苷类类成分研究［Ｊ］．中
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［６］ 李 磊，张宏桂，孙毅坤，等．土茯苓药材 ＨＰＬＣ指纹图谱研究
［Ｊ］．中华中医药杂志，２００７，２２（４）：２０６．
［７］ 袁久志，窦德强，陈英杰，等．土茯苓二氢黄酮醇类成分研究
［Ｊ］．中国中药杂志，２００４，２９（９）：８６７．
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Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｉｓｏｍｅｒｓｉｎ
ＳｍｉｌａｘｇｌａｂｒａｂｙＨＰＬＣＭＳａｎｄＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ
ＷＡＮＧＹｉｎｇｈｏｎｇ１，ＬＩＬｅｉ２，ＺＨＡＮＧＨｏｎｇｇｕｉ２，ＱＩＡＯＹａｎｊｉａｎｇ２
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅＢｅｉｊｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｄｅｎｔｉｆｙｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｉｓｏｍｅｒｓｉｎＳｍｉｌａｘｇｌａｂｒａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙ
ＨＰＬＣＭＳｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｆｏｕｒｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｉｓｏｍｅｒｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｓｔｉｌｂｉｎ，ｎｅｏａｓｔｉｌ
ｂｉｎ，ｉｓｏａｓｔｉｌｂｉｎ，ｎｅｏｉｓｏａｓｔｉｌｂｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｒａｐｉｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎＳ．
ｇｌａｂｒａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓｍｉｌａｘｇｌａｂｒａ；ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ；ＨＰＬＣＭＳ；ＨＰＬＣ１ＨＮＭＲ
［责任编辑 王亚君］
［收稿日期］ ２００７０５１６
［基金项目］ 辽宁省教育厅科研基金项目（０２２００９５３）
［通讯作者］ 李发胜，Ｔｅｌ：（０４１１）８６１１０３９１，Ｅｍａｉｌ：ｌｆｓ９２０＠
ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
漏芦多糖的提取、单糖组分分析及含量测定
李发胜，徐恒瑰，燕小梅，李明阳，刘 辉
（大连医科大学 检验医学院，辽宁 大连 １１６０４４）
［摘要］ 目的：提取漏芦多糖，分析其单糖组分并测定其质量分数，为以后漏芦多糖研究提供参考。方法：水
提醇沉法提取粗多糖，Ｓｅｖａｇ法除蛋白，高效阴离子交换色谱脉冲安培检测（ＨＰＡＥＣＰＡＤ）法测定其单糖组成，苯
酚硫酸法测定多糖质量分数。结果：漏芦多糖的单糖组成为葡萄糖、阿拉伯糖和果糖，其摩尔比为１∶１６１∶２２１。
以单糖混合物为对照品测得漏芦多糖中总糖的质量分数为９５７８％。结论：ＨＰＡＥＣＰＡＤ法具有样品不用衍生、灵敏
度高、精密度好等优点，适合多糖类样品中单糖的分析；苯酚硫酸法实验操作简便，准确可靠，可用于多糖含量测定。
［关键词］ 漏芦；多糖；高效阴离子交换色谱；脉冲安培检测；苯酚硫酸法
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１１１２８４０３
漏芦为菊科植物Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍｕｎｉｆｏｒｕｍ（Ｌ．）ＤＣ
的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品。味苦、
咸，性寒，入胃、大肠经。具有清热解毒、消痈排脓、
通乳的功效。药理研究表明，漏芦提取液具有较好
的抗动脉粥样硬化［１］、抗缺氧和益智作用［２，３］。作
者对漏芦免疫调节的有效成分研究表明，漏芦多糖
有很好的免疫上调作用［４］，并采用高效阴离子交换
色谱脉冲安培检测（ＨＰＡＥＣＰＡＤ）法测定其单糖
组成，苯酚硫酸法测定多糖质量分数，为漏芦的综
合利用和质量评价提供科学的依据。
１ 仪器、试剂与药材
ＨＰＬＣ，５８２型泵、５４２型自动进样器、Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ
Ⅱ安培脉冲检测器及 ＣｏｕｌＡａｒｙｆｏｒｗｉｎｄｏｗｓ色谱工
作站；ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１０色谱柱（２ｍｍ×２５０ｍｍ，Ｄｉ
ｏｎｅｘ公司，美国）；ＵＶ－７５４型分光光计（上海第三
分析仪器厂）。单糖对照品：Ｄ葡萄糖、Ｌ阿拉伯糖、
Ｄ果糖（Ｍｅｒｃｋ公司，美国），ＮａＯＨ（Ａｃｒｏｓ公司，比利
时）；其他试剂均为国产分析纯。试验用水为超纯
水（ＷａｔｅｒＰｒｏＰｓ９０００６０２型，美国 Ｌａｂｃｏｎｃｏ公司）。
漏芦Ｒ．ｕｎｉｆｏｒｕｍ购于大连国药大药房，经大连药品
检验所郭月秋主任药师鉴定。
２ 方法与结果
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
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