全 文 ：川陈皮素体外对微管蛋白聚合的影响
刘 义，吴科锋，李延平
（广东医学院 广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 ５２４０２３）
［摘要］ 目的：研究川陈皮素对微管蛋白聚合的抑制作用，探讨其抗肿瘤的可能机制。方法：在离体条件下，
将受试化合物加入到微管蛋白聚合解聚反应体系中，于３７℃，３５０ｎｍ下检测反应体系吸光度的变化。结果：川陈
皮素处理后反应体系的吸光度与对照组相比显著降低。在不同终浓度川陈皮素（５０，７５，１００，１２５μｍｏｌ·Ｌ－１）
的反应体系中，其对应的最高吸光度分别为：０１３０，０１０９，００８６，００７１；对微管蛋白聚合的抑制率分别为１６７％，
３０１％，４４９％，５４５％。提示它对微管蛋白聚合具有抑制作用。结论：川陈皮素能抑制体外微管蛋白聚合，这可能
是其发挥抗癌作用的可能机制。
［关键词］ 川陈皮素；微管蛋白；聚合
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１８２１１３０４
［收稿日期］ ２００８０４２０
［通讯作者］ 刘义，Ｔｅｌ：（０７５９）２３８８４０５，Ｅｍａｉｌ：ｐｌｉｕ７８＠ｓｉ
ｎａｃｏｍ
微管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）是存在于所有真核细胞中由
微管蛋白（ｔｕｂｕｌｉｎ）组装成的长管状细胞器结构，通
过其亚单位的组装和去组装能改变其长度，对低温、
高压和秋水仙素敏感，是细胞骨架的主要结构成分
之一。微管在细胞形态结构、细胞分裂和运动中起
着重要作用。某些植物类抗癌药如秋水仙素、紫杉
醇等就是通过影响微管蛋白的聚合解聚活性来破
坏微管组装与去组装的动态平衡，遏制肿瘤细胞的
有丝分裂从而发挥其抗癌作用。
枳实为芸香科酸橙 Ｃｉｔｕｓａｕｍｎｔｉｏｎ及其变种或
甜橙Ｃｓｉｎｅｎｓｉｓ的干燥幼果，具有行气、散结、化痰
等功能。从枳实中提取得到的川陈皮素（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ，
５，６，７，８，３′，４′ｈｅｘａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｃ）是一种多甲氧基
黄酮类物质，研究证明其对肺癌、腹膜肿瘤、肝癌等
有较强的抗癌活性［１４］，但其作用机制尚不明确。本
研究从微管蛋白着手探讨川陈皮素的抗肿瘤机制。
１ 材料与方法
１１ 受试化合物 川陈皮素（纯度９０２２％），购于
成都迪澳植化实业有限公司，使用前川陈皮素以二
甲基亚砜（ＤＭＳＯ）配制成１ｍｍｏｌ·Ｌ－１的原药贮存
液，－２０℃保存，临用时用ＭＥＳ缓冲液稀释。
１２ 试剂 ＭＥＳ，ＧＴＰ，ＥＧＴＡ，秋水仙素、紫杉醇、
考马斯亮蓝Ｒ２５０购自Ｓｉｇｍａ公司；丙三醇、ＭｇＣｌ２等
为国产分析纯。
１３ 微管蛋白的分离纯化 参照文献［５，６］提取
微管蛋白的方法略有改进。把刚屠宰的成年猪脑，
置于冰上去除脑膜、大血管并剪碎，用预冷的 ＭＥＳ
缓冲液（ＭＥＳ０１ｍｏｌ·Ｌ－１，ＥＧＴＡ０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１，
ＡＴＰ１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＭｇＣｌ２０１ｍｏｌ·Ｌ
－１，用ＨＣｌ调
ｐＨ６５）清洗２次，掏碎后制成匀浆。
将脑组织匀浆在４℃，１０５０００×ｇ条件下离心
１ｈ，取上清液，加入等体积的 ＭＥＳ聚合缓冲液
（ＭＥＳ０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＥＧＴＡ１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＡＴＰ
１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＭｇＣｌ２０５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１，丙三醇 ８０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１，用ＨＣｌ调ｐＨ６５），置于３７℃水浴中保
温３０ｍｉｎ，期间微微摇动数次，在２６℃，１０５０００×ｇ
条件下离心１ｈ，弃上清，用约１／１０匀浆体积的预冷
ＭＥＳ缓冲液将沉淀物分散，置于冰水浴中３０ｍｉｎ，
使沉淀物基本溶解。再将溶液按上述高、低温离心
步骤重复进行一次，将离心后获得的沉淀物，用少量
预冷的ＭＥＳ缓冲液在冰水浴中溶解，得到微管蛋白
溶液。
１４ 微管蛋白含量的测定 按Ｌｏｗｒｙ＇ｓ法测定微管
蛋白含量。
１５ 微管蛋白的鉴定 用质量分数为１２％的分离
胶（ｐＨ８８），７５％的浓缩胶（ｐＨ６７）进行 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ电泳，００５％考马斯亮蓝Ｒ２５０染色。
１６ 微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应 在冰浴
的比色杯中加入已纯化的微管蛋白１９０μＬ，然后加
入ＧＴＰ（母液５μＬ），使其终浓度为１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
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在４℃于３５０ｎｍ处迅速调零，放入３７℃水浴中恒
温，每间隔３ｍｉｎ取出测吸光度（Ａ），根据所测得的
Ａ的变化绘制微管蛋白聚合曲线。当聚合曲线逐渐
上升进入稳定高平台期说明微管蛋白聚合解聚反
应趋于平衡，待聚合反应基本结束后（该段聚合解
聚平衡时期大约持续２０ｍｉｎ），将比色杯放入冰水
浴中冰浴 ２０ｍｉｎ，这段时间内每间隔 ３ｍｉｎ测定
Ａ３５０，解聚曲线逐渐下降进入低平台期后，解聚反应
基本结束。
１７ 川陈皮素对微管蛋白聚合解聚活性的影响
在上述微管蛋白聚合解聚的反应系统中实验组加
入不同浓度川陈皮素药液（５μＬ），使其终浓度分别
为５，７５，１０，１２５μｍｏｌ·Ｌ－１；阳性对照组分别加入
秋水仙素、紫杉醇，使其终浓度分别为４，２μｍｏｌ·
Ｌ－１；空白对照加入无菌三蒸水代替上述受试化合
物，按上述测量方法记录Ａ的连续变化。
１８ 结果评价
抑制率（％）＝（１－实验组Ａ３５０／对照组Ａ３５０）×１００％
２ 结果
２１ 微管蛋白的鉴定 Ｌｏｗｒｙ＇ｓ法测定总蛋白含量
为１２ｇ·Ｌ－１；经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果显示总蛋白样
品中的主要组分的相对分子质量介于４３０～６６２
×１０３，这与文献所报道相符，因此图１中出现的主
要条带即为本实验所需的微管蛋白；凝胶成像系统
定量分析，总蛋白样品中微管蛋白的含量在８０％以
上（图１）。
Ｍｍａｋｅｒ；Ａ２μｇ样品；Ｂ４μｇ样品；Ｃ８μｇ样品
图１ 猪脑中提纯的微管蛋白ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图谱
２２ 微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应 在３７℃
条件下聚合（０～２０ｍｉｎ），在４℃条件下解聚（４０～
６０ｍｉｎ），该图平台期反应了微管蛋白在聚合条件下
聚合解聚之间的动态平衡。微管蛋白在正常的生
理条件下处于聚合解聚动态平衡中，从而在细胞形
态结构、细胞分裂和运动中起着重要作用。在体外
下通过对温度的控制能模拟微管蛋白的正常聚合
解聚平衡，从而为进一点实验提供基础（图２）。
图２ 微管蛋白在３７℃（０～２０ｍｉｎ）时的聚合与
４℃（４０～６０ｍｉｎ）的解聚曲线
２３ 紫杉醇、秋水仙素对微管蛋白聚合解聚活性
的影响 参照文献［７，８］提供的秋水仙素和紫杉醇
对微管蛋白聚合解聚反应的影响浓度，在本实验中
它们的终浓度分别为４，２μｍｏｌ·Ｌ－１，其对微管蛋
白聚合解聚活性影响的结果见图３。
图３ 秋水仙素、紫杉醇对微管蛋白的影响
该图平台期反应了在聚合条件下聚合解聚之间
的动态平衡。秋水仙素对微管蛋白聚合存在明显的
抑制效应，在３７℃恒温过程中抑制微管蛋白聚合，对
微管蛋白聚合的抑制率为５６４％，这与秋水仙素能结
合于微管蛋白端部从而抑制微管蛋白聚合作用的机
制相符；紫杉醇在３７℃恒温条件促进微管蛋白聚合，
在４℃下抑制其解聚使其始终保持在聚合的稳定状
态，这与紫杉醇能促使微管蛋白迅速聚集成微管并结
合到微管上抑制微管的解聚的机制相一致。
２４ 川陈皮素对微管蛋白聚合解聚活性的影响
川陈皮素对微管蛋白的聚合有明显的抑制作用，且
与浓度相关。在３７℃聚合条件下能降低 Ａ。加入
到反应体系的川陈皮素终浓度为 ５，７５，１０，１２５
μｍｏｌ·Ｌ－１所对应的最大Ａ分别降为０１３０，０１０９，
００８６，００７１。对微管蛋白聚合的抑制率分别为
１６７％，３０１％，４４９％，５４５％。川陈皮素体外对
微管蛋白聚合的抑制与浓度成正相关（图４）。
川陈皮素对微管蛋白作用区别于紫杉醇而与秋
水仙素相似，提示川陈皮素可能是一种潜在的能抑
制微管蛋白聚合的天然产物（图５）。
３ 讨论
在细胞的有丝分裂过程中，细胞临近分裂前期
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图４ 不同浓度川陈皮素对微管蛋白聚合解聚的影响
图５ 川陈皮素、秋水仙素、紫杉醇对微管蛋白聚合的影响
时细胞质中微管解聚成微管蛋白亚基，细胞进入有
丝分裂早中期后，纺锤体侵入细胞中心区，纺锤体微
管蛋白捕捉动粒。当染色体排列在赤道上后，细胞
进入有丝分裂中期，纺锤体微管通过微管蛋白的聚
合与解聚牵引染色体向两极运动，到分裂后期纺锤
体微管解聚为微管蛋白，因此，作用于细胞有丝分裂
期的各个有关于微管的时相就可能使有丝分裂受阻
而导致细胞凋亡。
微管和微管蛋白的相互作用是靶向性筛选抗肿
瘤化合物的重要模型之一。化合物与微管蛋白的作
用导致２种结果：抑制微管聚合（促解聚）和抑制微
管解聚（促聚合）。许多化合物能与微管蛋白发生
作用，其中大多数是降低微管结构稳定性的，如生物
碱类的长春碱（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ），秋水仙素（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ），
喜树碱（ｃａｍｐｌｏｔｈｅｃｉｎ），ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ，脂类的 ｃｕｒａ
ｃｉｎＡ，大环多醚类的 ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉｎＢ，肽类 ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ
１０等，而目前临床上较为成功的抗瘤化疗药物是促
微管聚合类天然化合物紫杉醇（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｔａｘｅｌ）及
其类似物（ｄｏｃｅｔａｘｅｌｔａｘｏｔｅｒｅ）。
国外学者在进行抗肿瘤有效成分的广泛筛选中
发现，芸香科植物中所含的多甲氧基黄酮类成分具
有抗肿瘤作用，川陈皮素对多种肿瘤细胞有抑制增
殖的作用并能诱导肿瘤细胞的凋亡。本研究发现，
川陈皮素在离体条件下对猪脑微管蛋白聚合解聚
体系存在着影响。它能抑制微管蛋白的聚合，终浓
度为５，７５，１０，１２５μｍｏｌ·Ｌ－１的川陈皮素使微管
蛋白反应体系的最大 Ａ分别降为 ０１３０，０１０９，
００８６，００７１。对微管蛋白聚合的抑制率分别为
１６７％，３０１％，４４９％，５４５％，抑制作用与浓度关系
成正比。川陈皮素这种在体外对微管蛋白动态平衡
体系的影响可能是其引起肿瘤细胞凋亡途径之一。
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ＬＩＵＹｉ，ＷＵＫｅｆｅｎｇ，ＬＩＹａｎｐｉｎｇ
（ＧｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＮａｔｕｒｅＤｒｕｇｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４０２３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｎｏｂｉｌｅｔｉｎｆｏｒａｎｔｉｃａｎｃｅｒｂｙｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｅｃｔｓｏｆ
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ｎｏｂｉｌｅｔｉｎｏｎｔｕｂｕｌｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄ：Ｉｎｖｉｔｒｏｎｏｂｉｌｅｔｉｎｗａｓａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｔｕｂｕｌｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄ
ｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄａｔ３５０ｎｍｕｎｄｅｒ３７℃Ｒｅｓｕｌｔ：Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓ
ｔｅｍｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｎｏｂｉｌｅｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓＷｈｅｎｎｏｂｉｌｅｔｉｎｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅ５０，７５，１００
ａｎｄ１２５μｍｏｌ·Ｌ－１，ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｗｅｒｅ０１３０，０１０９，００８６ａｎｄ００７１ｗｉｔｈ１６７％，３０１％，４４９％ ａｎｄ
５４５％ ｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｎｏｂｉｌｅｔｉｎｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｕｂｕｌｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｉｎ
ｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｅｃｔｏｆｎｏｂｉｌｅｔｉｎｏｎｔｕｂｕｌｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ；ｔｕｂｕｌｉｎ；ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００７１０１５
［基金项目］ 黑龙江省科技计划项目（ＧＣ０３Ｃ６０６１）
［通讯作者］ 赵玲辉，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｌｈ＠１６３ｃｏｍ
人参皂苷 Ｒｈ２对小鼠移植瘤生长及对细胞间连接
黏附分子表达的影响
王 强１，吴美清１，赵玲辉２，杨慧科２，吕晓红２
（１内蒙古林业总医院 普外科，内蒙古 牙克石 ０２２１５０；
２哈尔滨医科大学 基础医学院 解剖教研室，黑龙江 哈尔滨 １５００８１）
［摘要］ 目的：观察人参皂苷Ｒｈ２对小鼠移植瘤生长及其对细胞间连接黏附分子（ＪＡＭ）在癌组织表达的影
响，探讨其抗肿瘤作用。方法：昆明种小鼠４０只，前肢皮下接种Ｓ１８０小鼠癌性腹水０２ｍＬ，成瘤后随机分为２组，
实验组给予人参皂苷Ｒｈ２（２０ｍｇ·ｋｇ
－１）灌服，２ｍＬ／只；对照组给予等量生理盐水，６周后取材。用免疫组化法观
察ＪＡＭ１，ＪＡＭ２在癌细胞、淋巴管及血管的表达。结果：对照组ＪＡＭ１阳性表达的肿瘤细胞吸光度（Ａ）５４９９０，实
验组３４０５５，Ｐ＜００５；ＪＡＭ２阳性表达弱。对照组ＪＡＭ１和ＪＡＭ２阳性表达的血管数密度分别为２３３和１３４，实
验组分别为１０９和０９。对照组 ＪＡＭ１和 ＪＡＭ２阳性表达的淋巴管数密度分别为２２３和１８８，实验组分别为
０９９和０７９；两组间的差异均为Ｐ＜００５。结论：人参皂苷Ｒｈ２通过下调ＪＡＭ在肿瘤细胞的表达，抑制肿瘤组织血
管及淋巴管的生成，进而抑制肿瘤生长。
［关键词］ 人参皂苷Ｒｈ２；移植瘤；细胞间连接黏附分子
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１８２１１６０４
在致力于控制恶性肿瘤的恶性生长和转移的大
量研究中，人参皂苷的作用已逐渐受到广大学者的
关注。曾有报告指出单体人参皂苷Ｒｈ２有抗肿瘤作
用［１］，但其作用机制尚不清楚。连接黏附分子（ｔｈｅ
ｊｕｎｃｔｉｏｎａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｔ，ＪＡＭ）在瘤体癌巢的形
成，肿瘤血管和淋巴管的新生过程中都起重要作
用［２３］，人参皂苷 Ｒｈ２是否与其有相关性，是否通过
这条途径发挥其抑瘤作用，尚未见报道。本研究用
小鼠皮下移植瘤模型，观察 ＪＡＭ１和 ＪＡＭ２在肿瘤
组织中的表达，从而探讨人参皂苷 Ｒｈ２影响肿瘤生
长、转移的机制，为研究人参皂苷在临床实践中的作
用补充一些新的资料。
１ 材料
１１ 动物
昆明种小鼠，４０只，４周龄，清洁级，哈尔滨医科
大学第二临床医学院实验动物中心提供，雌雄兼用，
体重（１８±５）ｇ，许可证号 ＳＣＸＫ（黑）２００２０００２。实
验前于本实验室内饲养１周，以适应环境。
１２ 药物与试剂
单体人参皂苷Ｒｈ２购自吉林省宏久生物科技股
份有限公司，批号０６０３０２，纯度９８７６％，溶媒乙醇；
兔抗小鼠 ＪＡＭ１和 ＪＡＭ２单克隆抗体购自 ＳＡＮＴＡ
公司，批号Ａ３００４，Ｂ１７０４；二抗试剂盒购自北京中杉
试剂公司；Ｓ１８０腹水癌小鼠购自哈尔滨医科大学肿
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