全 文 :银杏内酯对 °≤tu细胞缺糖损伤凋亡相关基因的影响
孙丽新 o严 明 o江振洲 o陈 敏 o张陆勇 3
k中国药科大学 新药筛选中心 o江苏 南京 utssv{l
≈摘要 目的 }考察银杏内酯对缺糖引起的 °≤tu细胞损伤的保护作用及对凋亡相关基因表达的影响 o探讨银
杏内酯对中枢神经系统的保护机制 ∀方法 }缺糖培养引起 °≤tu细胞损伤 o分别加入 tssotsotos1t °ª# pt的银杏
内酯 o ××法检测给药前后与正常组的细胞活力变化 o实时荧光定量 °≤ kƒ ∏¯²µ¨¶¦¨±¦¨ ±∏¤±·¬·¤·¬√¨°≤ o ƒ± 2°≤ l
法分析各组抑制凋亡基因 k
¦¯2ulo凋亡诱导基因 k
¤¬l及原癌基因 k¦2°¼¦l的表达情况 ∀结果 }缺糖培养早期 tu «
时 o银杏内酯给药使
¦¯2u表达量增高 o
¤¬和 ¦2°¼¦表达量降低 ~缺糖培养 uw «时 o银杏内酯仅能引起 ¦2°¼¦的表
达量下降 ∀结论 }在细胞缺糖损伤早期 o银杏内酯通过调节凋亡相关基因
¦¯2uo
¤¬和 ¦2°¼¦产生细胞应激保护效
应 o在损伤晚期主要通过调节 ¦2°¼¦的表达量产生应激保护效应 ∀
≈关键词 银杏内酯 ~°≤tu细胞 ~荧光定量 °≤ ~凋亡
≈中图分类号 u{xqx ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukusszlsy2sxvu2sw
≈收稿日期 ussy2sy2su
≈基金项目 国家高技术研究发展计划 k{yv计划 l课题 kussw2
uvwsttl
≈通讯作者 3 张陆勇 }ר¯}ksuxl{vuztxssoƒ¤¬}ksuxl{xvsv2
uyso∞2°¤¬¯}§µ∏ª¶¦µ¨ ±¨ tuyq¦²°
银杏内酯 kª¬±®ª²¯¬§¨ ¶l是银杏叶提取物中的活
性成分 ≈t ∀国内外研究表明 o银杏内酯具有扩张血
管 o改善微循环 o抗血小板活化因子 o抗氧化 o清除自
由基 o抗细胞凋亡等作用 o对脑缺血损伤有保护作
用 o其机制尚未完全清楚 ≈uov o银杏内酯
可保护谷
氨酸盐引起的鼠海马神经元的损伤 ≈w ∀本实验通
过建立缺糖引起的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 k°≤tul
细胞损伤模型 o观察银杏内酯对体外神经细胞凋亡
的保护作用 o并通过荧光定量方法对其参与保护神
经系统的机制进行了探讨 ∀
1 材料
1q1 细胞株 °≤tu细胞株 o引自中国协和医科大
学基础医学细胞中心 ∀
1q2 试剂及药物 高糖合成培养基 k⁄ ∞ l!无糖培
养基 o¬¥¦²公司 ~胎牛血清 o武汉三利生物技术有限公
司 ~胰蛋白酶 !噻唑蓝 o°µ¨¶¦²公司进口分装 ~×µ¬½²¯o
≥∏³¨µ¶¦µ¬³·¶逆转录试剂盒 o±√¬·µ²ª¨±~∞¬·¤´ ⁄ ³²¯2
¼° µ¨¤¶¨oפ¤ ¤公司 ~≥≠
µ¨ ±¨ 荧光染料 o上海开
放科技发展有限公司 ~银杏内酯 o纯度 |sh o批号
svtttso江苏吴中苏药医药开发有限责任公司 ∀
1q3 仪器 ¬≤¼¦¯ µ¨±荧光定量 °≤ 仪 o
¬²p ¤§~
酶联免疫检测仪 o
p ⁄~超净工作台 }吴县市
实验动物器材厂 ~
ty≤u培养箱 o德国 µ¨¤¨ ∏¶∀
2 方法
2q1 °≤tu细胞的复苏和培养 冻存的 °≤tu细胞
复苏 o接种于培养瓶中 o所用 ⁄ ∞ 完全培养基内
含青霉素 tsx # pt o链霉素 tss °ª# pt otsh
胎牛血清 ovz ε oxh ≤u静置培养 ∀待细胞 {sh汇
合或接近汇合成片后 s1uxh胰蛋白酶消化传代 ∀
2q2 °≤tu细胞缺糖损伤模型的建立和药物处理
传代 °≤tu细胞接种于 |y孔塑料培养板中 ovz ε o
xh ≤u培养至长满 zsh o弃去原培养基 o加入 °
≥
洗 u次 o再加入无糖培养液 ovz ε oxh ≤u培养 ux
°¬±o给药组分别加入 tssotsotos1t °ª# pt的银
杏内酯 o模型组不加药 o正常组用 ⁄ ∞ 完全培养
基培养 ∀培养 uw «∀
2q3 ××法检测细胞活力 参照文献方法 ≈x 略
做改动 ∀加入终含量为 s1x ª# pt噻唑蓝 k ××l溶
液温育 w «o吸去培养液 o附着于培养孔壁上的氧化
态 ××紫色结晶以二甲基亚砜充分溶解 o振摇 ts
°¬±o然后用酶标仪 wxs ±°测定吸光度值 kΑl∀
2q4 细胞 抽提 传代 °≤tu细胞接种于 y ¦°
塑料培养皿中 o培养至长满 zsh o弃去原培养液 o加入
°
≥洗 u次 o再加入无糖培养液 o继续培养 ux °¬±o给
药组培养液中加入 tss °ª# pt银杏内酯 o分别培养
tuouw «∀收集细胞 o按 ×µ¬½²¯说明书操作提取 ∀
#uvx#
第 vu卷第 y期
ussz年 v月
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ y
¤µ¦«o ussz
用 th琼脂糖电泳检测质量 o随后 uysru{s ±°吸光度
值测定 浓度和纯度 o置 pzs ε 冰箱备用 ∀
2q5 逆转录 按照 ≥∏³¨ µ¶¦µ¬³·¶反转录试剂说明
书操作过程 o将给药组和对照组的总 反转录成
单链 ¦⁄∀
2q6 引物设计 参考文献 ≈y 设计引物 o见表 t∀
表 t 荧光定量 °≤ 的引物
基因名称 编号 引物序列
¦¯2u 2sty||v1t 上游引物 }xχ2≤≤≤≤≤×≤×≤××≤×≤≤×2vχ
下游引物 }xχ2××≤≤×≤≤≤≤≤≤≤
¤¬ 2stzsx| 上游引物 }xχ2××≤≤≤×≤××≤×≤×××
下游引物 }xχ2××≤≤××≤×≤≤×
¦2°¼¦ 2stuysv2t 上游引物 }xχ2≤××≤×≤×≤≤≤
下游引物 }xχ2≤≤×≤×××≤××≤≤××
2q7 荧光定量 °≤ xs Λ反应体系中含有 s1|
Λ≥≠
µ¨ ±¨ ot Λ单链 ¦⁄模板 ox Λ∞¬·¤´
⁄ ³²¯¼° µ¨¤¶¨ ¥∏©©¨µow Λux °°²¯ # pt ª≤ u¯ ot
Λts °°²¯# pt §×°ots Λ°²¯# pt引物各 t Λo
t1ux ∞¬·¤´ ⁄ ³²¯¼° µ¨¤¶¨∀同时设定无模板对
照 !无 ×对照 ∀ |x ε ov °¬±o|x ε ovs ¶oxv ∗ yu ε
之间退火 vs ¶k不同的引物退火温度不同 lozu ε o
vs ¶o共 ws个循环 ∀ zu ε 延伸时检测荧光 ∀扩增完
毕后 o进行融解曲线测定 o|x ε ot °¬±oxx ε ot
°¬±o以 s1x ε # ts ¶pt的速率上升到 |x ε o共 {s个
步骤 o采集荧光信号 Χτo并测其融解曲线 ∀
2q8 相对表达量计算 以甘油醛 v2磷酸脱氢酶基
因 k°⁄ l为内参基因 o计算给药组目的基因
° 相对正常组的表达量 o最终结果以相对正常
组的表达量倍数表示 ∀ ° 相对表达量利用下述
公式进行计算 ∀
相对表达量 ukΧτ正常组 p Χτ给药组 l目的基因 rukΧτ正常组 p Χτ给药组 l内参基因
2q9 统计学处理 所有数据均以 cξ ? σ表示 o采用 τ
检验 ∀
3 结果
3q1 对细胞活力的影响 °≤tu细胞经缺糖处理
后 oΑ值显著下降 o与正常组相比有非常显著性差异
kΠ s1stlo表示细胞活力显著下降 ~银杏内酯 s1to
tots °ª# pt组与模型组相比 Α值升高 o但无显著
意义 ~tss °ª# pt组 Α值显著高于模型组 kΠ
s1stlo表示可以显著地改善细胞的活力 o见表 u∀
表 u 银杏内酯对细胞活力的影响 kcξ ? σ, ν yl
组别 剂量 r °ª# pt Α
正常 p t1zw ? s1tt
模型 p s1{| ? s1sztl
银杏内酯 s1t s1|u ? s1sy
t s1|w ? s1sy
ts t1st ? s1sz
tss t1v| ? s1s{ul
注 }与正常组相比 tl Π s1st~与模型组相比 ul Π s1st
3q2 荧光定量 °≤ 产物的融解曲线 ≥≠
µ¨ ±¨
荧光染料分子同样也会掺入引物二聚体 !单链二
级结构 !非特异性产物都会发出荧光信号 o因此在实
验中必须避免引物二聚体 !单链二级结构 !非特异性
产物的存在 ∀需要测定产物的融解曲线来分析产物
的均一性 o若产物中只含有特异性产物 o则其融解曲
线表现为单一的峰值 o结果表明 ov个凋亡相关基因
°≤ 产物只有单峰 o无引物二聚体或非特异性产物
的存在 ∀
3q3 凋亡相关基因相对表达量的变化 实验结果
表明 o缺糖培养早期 tu «时 o模型组的
¦¯2uo
¤¬o
¦2°¼¦表达量均比正常组高 ~与模型组相比 o银杏内
酯给药使
¦¯2u表达量增高 o
¤¬和 ¦2°¼¦表达量降
低 o其中 ¦2°¼¦表达量显著降低 o从模型组的 x1tz
倍降至 v1{w倍 ∀随着缺糖培养时间延长 o在 uw «
时 o给药组和模型组
¦¯2uo
¤¬o¦2°¼¦的表达均下
降 o其中
¦¯2u和
¤¬与正常组无显著性差异 ~¦2°¼¦
的表达量虽然下降 o但仍然显著高于正常组 o相对正
常组而言 o银杏内酯给药使 ¦2°¼¦表达量从对照组
的 w1vu倍降至 u1{z倍 o见表 v∀
表 v 凋亡相关基因 ° 相对表达量 kcξ ? σ, ν vl
组别
给药时间
r«
¦¯2u
r倍
¤¬
r倍
¦2°¼¦
r倍
正常 p t1ss ? s1sx t1ss ? s1sy t1ss ? s1sv
模型 tu t1xu ? s1sxtl t1vx ? s1tztl x1tz ? s1yxtl
uw t1tx ? s1ts t1s| ? s1sz w1vu ? s1uxtl
给药 tu t1{v ? s1tuul t1uw ? s1tv v1{w ? s1twul
uw t1ts ? s1sz t1t| ? s1s| u1{z ? s1t|ul
注 }≠模型组与给药组结果以相对正常组表达量的变化倍数表
示 ~与正常组相比 tl Π s1st~与模型组相比 ul Π s1st
4 讨论
脑缺血损伤机制的基础研究及其可能的临床干
预措施一直是该领域内的研究热点 o细胞缺糖损伤
是神经损伤的重要病理基础 ∀大鼠肾上腺嗜铬细胞
#vvx#
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∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ y
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瘤 k°≤tul细胞由于能够合成并储存儿茶酚胺类的
神经递质 o本实验选用 °≤tu细胞 o建立细胞缺糖模
型 o模拟神经细胞的能量代谢障碍 ≈z ∀结果显示 o
银杏内酯对 °≤tu细胞的缺糖损伤具有保护作用 o
给药 tss °ª# pt可以显著地改善细胞的活力 ∀
ƒ± 2°≤ 可实现对目的基因的定量 !半定量 o较之以
前的终点法定量技术具有明显的优势 o操作简便 !快
速 !高效 o特异性更强 o自动化程度高 ≈{ ∀
本实验发现 o缺糖培养通过上调
¦¯2uo
¤¬o
¦2°¼¦蛋白的表达引起细胞凋亡 o而银杏内酯通过在
不同时期调节 v个蛋白的表达而对细胞产生保护作
用 ∀在损伤早期银杏内酯通过促进抗凋亡基因
¦¯2
u表达 !抑制促凋亡基因
¤¬的表达而抑制凋亡 ∀
随着损伤进程的推进 o银杏内酯对它们表达水平的
影响逐渐降低 o保护作用逐渐下降 ∀
¦¯2u和
¤¬可
相互作用为二聚体 o
¤¬增高 o促进细胞凋亡并抑制
¦¯2u的抗凋亡作用 o该基因所编码的膜相关蛋白是
一种强有力的细胞死亡促进因子 ∀
¦¯2u主要定位
于线粒体膜内外侧 o另外在核膜 !内质网上也有存
在 ≈| ∀有研究表明 o
¦¯2u可能通过调节离子转移 !
抑制线粒体通透性 !阻止线粒体膜电位下降而起到
抑制细胞凋亡的作用 ≈ts ∀ ¦2°¼¦是细胞原癌基因
¦2°¼¦的表达产物 o作为原癌蛋白 o存在促进增殖因
子时其表达异常可促进肿瘤转化 !增殖 ≈tt ~当生长
因子缺乏 !抑癌因子存在时能诱导细胞的凋亡 ≈tu ∀
近来还发现 ¦2°¼¦与脑损伤有关 o可能在脑损伤的
分子机制中起到重要作用 ≈tv ∀本研究发现 o缺糖培
养 tuouw «后 o¦2°¼¦的表达量均远远高于正常细
胞 o可能与
¤¬有协同效应 o引起细胞凋亡 ~而银杏
内酯能使 ¦2°¼¦的表达有所降低 o从而保护缺糖损
伤细胞 o在损伤晚期主要通过调节 ¦2°¼¦的表达量
产生应激保护效应 ∀它的变化与机制有待于进一步
研究 ∀
≈参考文献
≈t 叶 敏 o果德安 q银杏萜内酯的研究概况 ≈ q世界科学技
术 ) 中医药现代化 oussvo xktl}vvq
≈u ·¬¯× o ∞µ¤¯³∞o«° §¨o ·¨¤¯q ׫¨ ³«¤µ°¤¦²¯²ª¬¦¤¯ ©¨©¨¦·²©
¬±®ª²¥¬¯²¥¤o ¤³¯¤±·¨ ¬·µ¤¦·o ²± ·«¨ ¥µ¤¬± ²©§¨ ° ±¨·¬¤³¤·¬¨±·¶
± ¦²°³¤µ¬¶²± º¬·«·¤¦µ¬±¨≈ q °¶¼¦«²³«¤µ°¤¦²¯
∏¯ o¯ t||{ovw
kvl}v|tq
≈v 李玉梅 o郭世杰 o饶明俐 q凋亡基因在缺氧缺血新生大鼠脑组
织中的动态变化及银杏叶提取物的保护效应 ≈ q中风与神
经疾病杂志 ousswoutktl}wuq
≈w ⁄ ƒ¨ ∏¨§¬¶ƒ ∂ o ⁄µ¬¨∏q ¬±®ª² ¥¬¯²¥¤ ¬¨·µ¤¦·k∞¥zytl ¤±§
≤≥ ©∏±¦·¬²±¶} ¥¤¶¬¦¶·∏§¬¨¶¤±§ ¦¯¬±¬¦¤¯ ¤³³¯¬¦¤·¬²±¶≈ q ≤∏µµ
⁄µ∏ª×¤µª¨·¶o usssotktl}uxq
≈x 司徒镇强 o吴军正 q细胞培养 ≈ q西安 }世界图书出版社 o
t||y}t{yq
≈y 张 q荧光实时定量 °≤ 技术初探 ≈ q生命科学趋势 o
ussvotkwl}tq
≈z
¨¯ ¬¯¨µ°o ≥¤¦¦«¨ ·²±¬≥o °µ²§q ²± ≤o ·¨¤¯q ∏¯·¤°¬¦¤¦¬§
§¨ ¦¤µ¥²¬¼¯ ¤¶¨ 2¨ ¬³µ¨¶¶¬±ª ¤¶·µ²¦¼·¨¶ ¬¨«¬¥¬· ±¨«¤±¦¨§ ±¨ µ¨ª¨ ·¬¦
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°¤o ussuot|kvl}vz|q
Εφφεχτιϖε οφ γινκγολιδεσ ον εξπρεσσιον οφ αποπτοσισ ρελατεδ
γενε δυρινγ ΠΧtu χελλσ γλυχοσε δεπριϖατιον
≥¬2¬¬±o ≠ ¬±ªo «¨ ±2½«²∏o ≤∞ ¬±o ∏2¼²±ª
(Νατιοναλ∆ρυγ Σχρεενινγ Λαβορατορψ, Χηινα Πηαρµ αχευτιχαλΥνιϖερσιτψ, Νανϕινγ utssv{, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨ ·«¨ ³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨¦·¶²©ª¬±®ª²¯¬§¨ ¶²± ª¯∏¦²¶¨ §¨ ³µ¬√¤·¬²±2¬±§∏¦¨§ ¤³²³·²¶¬¶¬± °≤tu
#wvx#
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ y
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¦¨ ¯¯¶¤±§·«¨ ° ¦¨«¤±¬¶° ∏±§¨ µ¯¼¬±ª·«¨ ³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨¦·q Μετηοδ : °≤tu ¦¨ ¯¯¶º µ¨¨ ·µ¨¤·¨§∏±§¨ µª¯∏¦²¶¨ §¨ ³µ¬√¤·¬²±o ¤±§·«¨ ³µ²¯¬©¨µ2
¤·¬²± º¤¶§¨ ·¨µ°¬± §¨¥¼ ·¨·µ¤½²¯¬∏° k ××l ¤¶¶¤¼q ƒ∏µ·«¨ µ°²µ¨o ·«¨ ° ¯¨ √¨¯¶²©
¦¯2uo
¤¬o ¦2°¼¦º µ¨¨ ° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ ƒ ∏¯²µ¨¶2
¦¨±¦¨ ±∏¤±·¬·¤·¬√¨°≤ kƒ± 2°≤ lq Ρ εσυλτ: ¬±®ª²¯¬§¨ ¶¦²∏¯§ °¤µ®¨ §¯¼ ¬±«¬¥¬··«¨ ¬±∏µ¼ ²©ª¯∏¦²¶¨ §¨ ³µ¬√¤·¬²± ²± ·«¨ °≤tu ¦¨ ¯¯¶
¤±§¬±¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ¦¨¯¯ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ¦²°³¤µ¨§º¬·«·«¨ °²§¨ ¯ªµ²∏³¶kΠ sqstlq ¬±®ª²¯¬§¨ ¶¦²∏¯§∏³2µ¨ª∏¯¤·¨
¦¯2u ¤±§§²º±2µ¨ª∏¯¤·¨
¤¬¤±§¦2°¼¦¤·tu «o µ¨¶³¨ ¦·¬√¨¯¼q ׫¨ µ¨ º µ¨¨ ±² ¶¬ª±¬©¬¦¤±·§¬©©¨µ¨±¦¨¶¬± ·«¨
¦¯2u ¤±§
¤¬ ¯¨ √¨¯¶¬± ¥²·« ªµ²∏³¶¤·uw «o ¤±§
ª¬±®ª²¯¬§¨ ¶²± ¼¯ µ¨§∏¦¨§·«¨ ¨¯ √¨¤·¬²± ²©¦2°¼¦©µ²° w1vu2©²¯§·²u1{z2©²¯§¤··«¬¶·¬° q¨ Χονχλυσιον: ¬±®ª²¯¬§¨ ¶¤µ¨ ¤¥¯¨·² ³µ²·¨¦·
·«¨ ¬±∏µ¨§°≤tu ¦¨¯¯¶¤ª¤¬±¶·¦¨¯¯ ¤³²³·²¶¬¶q ⁄∏µ¬±ª·«¨ ¤¨µ¯¼ ³¨ µ¬²§²©ª¯∏¦²¶¨ §¨ ³µ¬√¤·¬²±o
¦¯2uo
¤¬ ¤±§¦2°¼¦º µ¨¨ µ¨ª∏¯¤·¨§·²
¬±«¬¥¬·¦¨¯¯ ¤³²³·²¶¬¶¥¼ ª¬±®ª²¯¬§¨ ¶q ©·¨µ·«¤·o ª¬±®ª²¯¬§¨ ¶¶¨ °¨¶¬±«¬¥¬··«¨ ¤³²³·²¶¬¶·«µ²∏ª«¤·¨±∏¤·¬±ª·«¨ ¨¯ √¨¤·¬²± ²©¦2°¼¦q
[ Κεψ ωορδσ] ª¬±®ª²¯¬§¨ ¶~ °≤tu ¦¨ ¯¯ ¬¯± ¶¨~ ƒ± 2°≤ ~ ¤³²³·²¶¬¶
≈责任编辑 古云侠
第七届 /德彪 2≤≤ ƒ0中国奖 kussz年度 l
/德彪 2≤≤ ƒ0中国奖由瑞士德彪集团和中国癌症基金会于 t||w年 |月共同创办 ∀瑞士德彪集团是一
家专门从事新药研开的科研投资公司 ∀其经营策略是与科学家合作 o把他们的研究成果开发成药品 o然后进
行全球销售 ∀
/德彪 2≤≤ ƒ0中国奖旨在为中国科学家和国际制药工业间搭起一座桥梁 o鼓励在癌症 !老年性痴呆 !糖
尿病 !心血管等领域的中国新药开发事业 o包括生物制剂 !天然提取物 !合成分子等 ∀主要面向国内所有从事
高科技项目和从天然产物中提取新分子的中国科学家 !实验室 !研究所 !大学和制药工业等 ∀德彪奖已成功
举办了 y届 o中外评委本着 /实事求是 o公正透明 0的原则 o嘉奖了一批既有相当学术水平又有一定开发应用
前景的项目 o并对一些项目提供了开发建议 ∀其中第三届一等奖项目 5石杉碱甲衍生物 ×2t的抗老年性痴
呆作用 6o正是通过参评德彪奖 o被德彪集团确认立项 o投入大量资金进行国际合作开发 o目前已完成国际多
中心的 期临床研究 ∀
德彪奖目前已在中国新药开发领域特别是肿瘤药方面树立了较高的信誉 o成为向欧洲乃至世界展示中
国医药科学进步的窗口 ∀
/德彪奖 2≤≤ ƒ0中国奖根据申报项目的科研价值和新颖性颁发一 !二 !三等奖各 t名 o鼓励奖若干名 }一
等奖 { sss瑞士法郎 k约 x万人民币 lo二等奖 y sss瑞士法郎 k约 v1z万人民币 lo三等奖 w sss瑞士法郎 k约
u1x万人民币 lo鼓励奖人民币若干及精美纪念品 ∀
热忱欢迎对德彪奖有兴趣的个人和单位申请 ∀可致函秘书处报名领取申请表 o然后将申请文件挂号寄
给新一届秘书长 }/德彪 2≤≤ ƒ中国奖 0秘书处 陈凯先院士 k信封上请注明 }参评德彪奖 l∀上海浦东祖冲之
路 xxx号 o中国科学院上海药物研究所陈凯先院士 o邮编 }ustusv∀
具体事项可直接致电德彪公司中国联络站的徐晓雁女士咨询详情或领取报名表 ∀
电话 } sut2x{vvu|wz k|«2t|«l
传真 }sut2x{vvwwvt
手机 }tv|st{tztws
∞2°¤¬¯}½«¤²¬∏§ ²± ¬¯± q¨¶«q¦±∀
受理截止日为 ussz年 w月 ux日 ∀
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