全 文 ：长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究
孙 敏t 3 o曾建军t ou
kt1 西南师范大学 生命科学学院 o重庆 wssztx ~
u1 井冈山师范学院 生命科学系 o江西 吉安 vwvss|l
≈摘要  目的 }建立长春花毛状根转化体系 o从毛状根中获得生物碱 ∀方法 }用发根农杆菌 „w 和 • tsss菌株分
别感染长春花的不同外植体获得毛状根 o并对毛状根的培养条件进行优化 ∀结果 }采用 „w感染叶片 o分别预 !共培
养 u §及添加 tss °ª#p t的乙酰丁香酮k„¶l可得到最佳转化效果 o毛状根的诱导率达 {y1ux h ∀以蔗糖为碳源及
以水解乳蛋白为氮源的 tru  ≥培养基为毛状根的最佳生长条件 ∀检测结果表明 o毛状根中的总生物碱含量高于
长春花的原植株和愈伤组织 ∀结论 }可通过毛状根的培养来获得抗癌生物碱长春碱和长春新碱等 ∀
≈关键词  长春花 ~毛状根 ~生物碱
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxlts2szwt2sw
≈收稿日期  ussv2tt2ut
≈基金项目  重庆市科委攻关项目kzxs{l
≈通讯作者  3孙敏 oר¯ }ksuvly{uxwsyu
长春花 Χατηαραντηυσ ροσευσ是夹竹桃科长春花
属的一种重要的药用植物 o含长春碱 !长春新碱 !阿
吗碱等 tss多种吲哚生物碱 ∀其中长春碱和长春新
碱是目前应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物 o但它
们在天然植物中含量极其微小 o仅为百万分之几到
十万分之几≈t  ∀
发根农杆菌 Αγροβαχτεριυ µ ρηιζογενεσ感染植
物后 o通过所含的致根质粒k•¬l的一部分k×2⁄‘„l
在植物基因组中的整合和表达 o导致毛状根的产生 o
利用毛状根筛选有利的变异性质的克隆可以提高次
生代谢物的含量 ∀近年来 o营养环境因子对长春花
细胞生长和生物碱合成的影响已经有许多报告 o但
对长春花发根的报道相对较少 ∀ °¤µµ等人≈u 通过
‹°≤ 及放射免疫检测到长春花毛状根中含有长春
碱 o但其含量相当低 o也有报道认为长春花毛状根不
能合成长春碱≈v  o ²µ¨±²等人≈w 研究表明不同培养
条件影响发根生长与长春花碱积累 ∀因此关于 •¬
质粒转化技术生产长春花生物碱 o还有待于科技工
作者进一步研究 ∀本研究用发根农杆菌感染长春
花 o诱导出毛状根 o通过离体培养 !株系筛选 o提取出
抗癌生物碱长春碱和长春新碱 o为长春花生物碱的
工业化生产和产业化开发奠定基础 o同时也为应用
转化毛状根技术获得药用植物次生代谢产物开辟一
条新的有效途径 ∀
1 材料和方法
111 菌种和培养基 发根农杆菌 „w 和 • tsss菌株
在 ≠ ∞…固体培养基中暗培养 os ∗ w ε 保存 ∀接种
前将发根农杆菌置于kux ? tl ε 下 o活化 u §o转至
≠ ∞…n us °ª#ptŽ¤±k®¤±¤°¼¦¬±l液体培养基中于
黑暗 !tss µ#°¬±p t震荡培养 o将处于对数生长期的
菌液稀释至 ’⁄yss为 s1xk³‹x1{l时 o用于接种感染
长春花外植体 ∀
112 无菌植株的获得 将长春花种子用 zx h的乙
醇浸泡 vs ¶后用无菌水冲洗 t次 o再用 s1t h升汞
消毒 ts °¬±o无菌水冲洗 v次后 o将种子播种到  ≥
固体培养基上 o置于 v sss ¬¯o光照 ty «#§p t okux ?
tl ε 条件下萌发并长成无菌植株 ∀
113 毛状根的诱导 无菌条件下 o将无菌苗的真
叶 !叶柄 !根及由叶片诱导而来的愈伤组织切成 s1x
¦°u的小块 o于黑暗条件下 okux ? tl ε o ≥培养基
或者附加 tss °ª#p t的乙酰丁香酮k„¶l预培养 s
∗ z §后 o浸入已活化好的菌液中 s ∗ tx °¬±o取出
后用滤纸吸干菌液 o置于  ≥培养基或者附加 tss
°ª#pt„¶上共培养 s ∗ x §后取出 o用无菌水冲洗
v ∗ x次后转移至含不同浓度头孢噻腭钠的  ≥培
养基上培养 o反复继代除菌至无菌 o再转入  ≥培养
基上 o诱导毛状根的产生 ∀
114 毛状根的培养和优良无性系的选择 用 Ž¤±
#twz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
vs °ª#pt对毛状根进行抗性筛选 o确认为具有抗
性的转化毛状根后 o再转入不含激素的  ≥固体或
液体培养基中继续培养 o选择性状保持稳定且生长
迅速的毛状根进行继代培养 ∀多次继代培养后用纸
电泳进行甘露碱和农杆碱的检测 ∀
115 总生物碱的提取和检测 生物碱的提取和检
测参照王宁宁等≈x 的方法 o并作适当修改 ∀将长春
花的根 !茎 !叶 !毛状根和愈伤组织在 xs ε 干燥至恒
重 o于研钵中研碎并过 ws目筛网后 o用超声波在甲
醇中提取 w «o过滤后取甲醇提取液 xs ε 减压蒸干 o
残渣用水溶解 o并用 ‹≤¯调节 ³‹ 至 v1s o再以石油
醚萃取 ∀水相用 t °²¯ #pt ‘¤’ ‹ 调节 ³‹ 至 {1x
后用 ≤ ‹u≤ u¯萃取 o减压蒸干 ≤ ‹u≤ u¯提取液并称重即
为长春花各材料中总生物碱含量 ∀
116 长春碱和长春新碱含量测定 用 ‹°≤ 对长
春花不同组织中长春碱和长春新碱进行含量测定 ∀
将长春花的根 !茎 !叶 !毛状根和愈伤组织在 xs ε 烘
至恒重 o与研钵中碾碎并过 ws目筛网后 o用超声波
在甲醇中提取 v次 o每次 t «∀过滤后取甲醇提取液
xs ε 减压蒸干 o残渣用 u1x h的硫酸溶解后用等体
积的醋酸乙酯萃取 u 次 ~去掉有机相 o水相用
u{1x h氨水调 ³‹ 至 ts1{ o再用等体积的醋酸乙酯
萃取 v次 o合并所有的醋酸乙酯提取液于 xs ε 减压
蒸干 o残渣用 t °甲醇溶解 ∀最后溶液过 s1uu Λ°
的微孔滤膜并超声波脱气备用 o上样量均为 ts ˏ∀
‹°≤ 在室温下进行 o流速 t1s °# °¬±p t o
…¨ ¦®°¤± ’⁄≥ ≤t{色谱柱kw1y °° ≅ uxs °°l ∀流
动相为甲醇2乙腈2s1sux °²¯ # °p t醋酸铵2三乙胺
ktxΒwsΒwxΒs1tl ∀
2 结果与分析
211 毛状根的诱导 选用的外植体经感染 o在 t
个月后均诱导出毛状根 o但诱导频率不同k见图 tl ∀
这可能是不同的外植体其生理状态不同所致 o或者
是对不同的外植体应有不同的筛选条件 ∀不同的菌
种其致根能力也不同 o实验发现 „w的致根能力优于
• tsss ∀该实验还观察到外植体预培养及与细菌共
培养的时间对诱导频率也有较大的影响k见图 ul ∀
212 毛状根生长条件优化 t个月后统计毛状根
的生长速率 o结果见表 t ou ov ∀毛状根在不同条件
下生长速率不同 o这可能是不同培养基中的不同成
分对毛状根的生长有有利或不利的一面 o从而导致
毛状根的生长速率不同 ∀结果表明在 tru  ≥培养

图 t 不同外植体部位对转化频率的影响
图 u 预 !共培养时间对转化频率的影响
表 t 不同培养基对毛状根生长的影响khξ ? σ, ν € usl
培养基 鲜重增长量rªr瓶 干重增长量rªr瓶
 ≥ z1v{ ? s1{{ s1wx ? s1swu
tru  ≥ {1wx ? s1zy s1wvv ? s1svt
…x z1ty ? s1|| s1v{t ? s1sxs
tru …x x1wv ? t1su s1vu| ? s1sxt
• «¬·¨ y1su ? s1w{ s1wty ? s1sus
tru • «¬·¨ y1wx ? s1zv s1wux ? s1svv
表 u 不同碳源对毛状根生长的影响khξ ? σ, ν € usl
碳源 鲜重增长量rªr瓶 干重增长量rªr瓶
蔗糖 {1wtv ? s1yx s1wty ? s1sv{
葡萄糖 w1yxs ? s1wz s1uxw ? s1su|
果糖 v1xvw ? s1{w s1t|t ? s1sxt
半乳糖 t1tsu ? s1uv s1syv ? s1ssz
乳糖 s1swy ? s1sz s1ssx ? s1sst
表 v 不同氮源对毛状根生长的影响khξ ? σ, ν € usl
氮源
鲜重增长量
rªr瓶
干重增长量
rªr瓶
牛肉浸膏 t1u{ ? s1uy s1syv ? s1sts
酵母粉 u1|t ? s1vv s1t|w ? s1stv
蛋白胨 v1ty ? s1wz s1usx ? s1sut
水解乳蛋白 tv1u{ ? t1ws s1y|{ ? s1szy
tru≥浓度k‘‹w‘’v n Ž‘’vl {1vx ? s1xy s1xu{ ? s1svx
基上以蔗糖为碳源以及以水解乳蛋白为氮源对毛状
根的生长优于其他物质 ∀
213 毛状根中总生物碱含量的测定 转化毛状根
培养 ys §后 o将毛状根收获 o冷冻干燥后作总生物
碱提取 ∀对长春花不同组织中总生物碱含量进行了
测定 o结果见表 w ∀实验结果表明不同组织中生物
#uwz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
碱的含量不同 o其中以毛状根的含量最高 o达 vv1xz
°ª#ªp t⁄• o分别是原植株根 !茎 !叶 !愈伤组织的
vu1zx倍 ow|1st倍 ouw1xs倍 ovx1vw倍 ∀由此可见 o
转化毛状根中长春花总生物碱含量比其他组织高 ∀
表 w 长春花不同组织中总生物碱含量
样品
样品重量
rª
总生物碱重
r°ª
总生物碱含量
r°ª#ªp t
根 u1ss u1sx t1sux
茎 u1ss t1vz s1y{x
叶 u1ss u1zw t1vz
毛状根 t1ss vv1xz vv1xz
愈伤组织 u1ss t1|s s1|x
214 毛状根中长春碱和长春新碱含量测定 按照
’1 „1 ²µ¨±²2∂ ¤¯ ±¨½∏¨ ¤¯等的方法用 • °2‹°≤ 制
作标准曲线 o长春碱保留时间为 uw1{z °¬±o回归方
程为 } Ψ € wt uzv1{y Ξ p t x{z1vt oρ€ s1||z y ~长
春新碱保留时间为 uz1zt °¬±o回归方程为 }Ψ € wv
|{x1zt Ξ p t wxv1wu oρ € s1||x | ∀用 ‹°≤ 对长
春花不同组织中长春碱和长春新碱含量测定结果见
表 x ∀
表 x 长春花不同组织中长春碱和长春新碱含量
样品
重量
rª
长春碱
r°ª#ªp t
长春新碱
r°ª#ªp t
根 ts s1stx { s1sus w
茎 ts p p
叶 ts s1st{ u s1suv w
毛状根 t s1wuz s1wz{
愈伤组织 ts p p
注 }/ p 0表示没有产量 ~样品进样量均为 ts ˏ
3 讨论
利用 •¬质粒诱导长春花毛状根生产抗癌生物
碱 o首先要筛选毛状根优良株系 ∀本实验发现乙酰
丁香酮k„¶l对转化频率有促进作用 o其中尤以同时
加入预 !共培养条件为佳 o诱导频率达 {y1ux h o比
只加入预 !共培养的频率kwz1vz h oxz1wz h l都要高
得多 o且得到的毛状根粗壮 !生长迅速 o这与前人的
研究结果相同≈y  ∀不同的培养条件影响发根的生
长 otru  ≥培养基 !蔗糖为碳源 !水解乳蛋白为氮源
对毛状根的生长优于其他物质 ∀
筛选到的毛状根优良无性系中长春花总生物碱
含量比其他组织高 o并且在长春花茎和愈伤组织中
都没有检测到长春碱和长春新碱 o而在转化毛状根
中检测到长春碱和长春新碱 ∀毛状根中长春碱含量
比根和叶中的含量分别高 uz1w倍和 uv1x倍 o长春
新碱的含量分别高 uv1x 倍和 s1x 倍 o与 °¤µµ等
人≈u 检测到长春花毛状根中长春碱含量仅有 s1sx
Λª#ªp t⁄• 相比 o极显著的提高了长春碱和长春新
碱的含量 ∀因此作者认为 o得到高产抗癌生物碱的
关键之一是得到优良毛状根无性系 ∀本试验研究表
明 o毛状根可以用于生产提取长春花抗癌生物碱 ∀
≈参考文献 
≈t  季宇彬 1 中药有效成分药理与应用 1 哈尔滨 }黑农江科学技
术出版社 1 t||x1tt{1
≈u  °¤µµ„ o °¨¨µ·¨¶¶o ‹¤°¬¯¯  ⁄o ετ αλ1 „ ®¯¤¯²¬§³µ²§∏¦·¬²± ¥¼
·µ¤±¶©²µ° §¨ µ²²·¦∏¯·∏µ¨ ²© Χατηαραντηυσ ροσευσ1 Πλαντ Χελλ
Ρεπ , t|{{ oz }vs|1
≈v  ײ¬√²±¨ ± 1 …¤¯¶¨√¬¦«oŽ∏µ½ • Š • 1 Œ±§²¯ ¤¨¯®¤¯²¬§³µ²§∏¦·¬²±
¥¼ «¤¬µ¼ µ²²·¦∏¯·∏µ¨¶²© Χατηαραντηυσ ροσευσ1 Πλαντ Χελλ, Τισ2
συε Οργαν Χυλτ , t|{| ot{ }z|1
≈w   ²µ¨±² ’ „ o ∂ ¤¯ ±¨½∏¨ ¤¯o Š¤¯¤½2„√¤¯²¶ •  o ετ αλ1 ∞©©¨¦·²©
§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ²± ·«¨ µ¨ª∏¯¤·¬²± ²© ¬±§²¯ ¤¨¯®¤¯²¬§ ³µ²§∏¦·¬²± ¬±
Χατηαραντηυσροσευσ «¤¬µ¼µ²²·¶1 Πλαντ Χελλ Ρεπορτσot||{ ot{ }
||1
≈x  王宁宁 o王淑芳 o田俊英 o等 1 土壤农杆菌转化的长春花冠瘿细
胞培养 1 生物工程学报 ot||w otskvl }uww1
≈y  张艳馥 o刘伟华 o姜 静 o等 1 质粒诱导的植物发根培养系及
其应用 1 生物技术 ot||z ozkvl }w1
Α στυδψ ον τηε ηαιρψ ροοτ χυλτυρε ανδ αντιτυµ ορ αλκαλοιδσ
προδυχτιον οφ Χατηαραντηυσροσευσ
≥˜‘ ¬±t o∞‘Š ¬¤±2­∏±t ou
(t1 Σχηοολ οφ Λιφε Σχιενχε , Σουτηωεστ Νορµ αλ Υνιϖερσιτψ, Χηονγθινγ wssztx , Χηινα ;
u1 ∆επαρτµεντ οφ Βιολογψ, ϑινγ Γανγ Μουταιν Νορµ αλ Χολλεγε , ϑιαν vwvss| , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶¨·¤¥¯¬¶«·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±¶¼¶·¨° ¤±§²¥·¤¬± ¤¯®¤¯²¬§¶©µ²°·«¨ «¤¬µ¼µ²²·²© Χατηαραντηυσροσευσ1 Μετηοδ :
k下转第 zxx页l
#vwz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
类成分提出过多 o生产成本也会增加 o所以选择
ys h乙醇提取 ~提取时间 !溶媒用量均为不显著因
素 o可结合生产实际进行选择 o最终确定最佳提取工
艺为 Αu Βv Χv ∆u o即乙醇含量为 ys h o提取 v次 o每
次回流 u «o加 {倍量溶剂 ∀
215 验证试验
为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性 o取
v份药材按上述最佳提取工艺进行验证试验 o操作
方法同前述 o测定结果见表 x ∀
表 x 验证试验结果
样品
总皂苷量
r°ª
皂苷 „ o…总含量
k ≅ ts p ulr h
总黄酮含量
k ≅ ts p ulr h
t v|s1t tt1ut xw1v|
u v{x1y ts1{| xs1yv
v v|y1t tt1|z x|1tz
结合表 v ox可看出 o该优选工艺可靠且稳定 ∀
3 讨论
311 在进行提取方法选择的试验中 o水煮液较黏
稠 o使得浓缩定容和萃取均不易操作 o且萃取中乳化
现象严重 o造成了一定的测量误差 o与水煮醇沉工艺
的测定结果产生了一定的偏差 o因此说水煮和水煮
醇沉 u种工艺之间相差不大 ∀
312 在用乙醇回流提取酸枣仁有效成分皂苷类和
黄酮类成分时 o乙醇含量和回流次数对二者均有显
著影响 ∀但用 ys h的醇提取皂苷类最佳 o{s h的醇
提取黄酮类最佳 o为避免脂类成分过多和降低生产
成本 o所以选择用 ys h的醇提取 ∀
≈参考文献 
≈t  中国药典 1 一部 1 usss1 vss1
≈u  王 建 o林 晓 1 酸枣仁中酸枣仁皂苷 „ 和 …的含量测定 1
中草药 ot||y ouzkvl }txw1
≈v  丁慎德 1 枣仁有效成分的研究 1 淄博师专学报 ot||x okwl }xy1
Οπτιµιζατιον στυδψ ον εξτραχτιον τεχηνολογψ οφ τηεσεεδ οφ
Ζιζιπηυσϕυϕυβα ϖαρ1 σπινοσα βψ ορτηογοναλ δεσιγν ωιτη µ υλτι2ταργετσ
• „‘Š ÷¬¤²2¯¬¤±ªo ‹ „‘Š ≠∏2­¬¨ o≤ ‹∞‘ ¬±ª2¬¬¤o • „‘Š  2¨©¨ ±ª
( ∆επαρτµεντ οφ Χηινεσε Πηαρµ αχψ , Βειϕινγ Υνιϖερσιτψ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Βειϕινγ tsstsu , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ²³·¬°¬½¨ ¬¨·µ¤¦·¬²± ·¨¦«±²¯²ª¼ ²©·«¨ ¶¨ §¨²© Ζιζιπηυσϕυϕυβα √¤µ1 σπινοσα º¬·«·«¨ ·¤µª¨·¶²©·«¨
·²·¤¯ ¶¤³²±¬±o·²·¤¯ ­∏­∏¥²¶¬§¨ „ ¤±§…¤±§·²·¤¯ ©¯¤√²±²¬§¶1 Μετηοδ : Œ±·«¨ ° ·¨«²§²©²±¨ 2º¤¼ ¤±§²µ·«²ª²±¤¯ ·¨¶·¶o ·¨«¤±²¯ ¦²±¦¨±2
·µ¤·¬²± o¤°²∏±·²© ·¨«¤±²¯ o ¬¨·µ¤¦·¬²±·¬°¨¤±§ ¬¨·µ¤¦·¬²±·¬° ¶¨º µ¨¨ ·«¨ ©¤¦·²µ¶¬± ²µ·«²ª²±¤¯ ·¨¶·o¤±§ ¤¨¦«©¤¦·²µº¬·«·«µ¨¨¯¨ √¨¯¶1
Ρεσυλτ : ∞·«¤±²¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ¤±§ ¬¨·µ¤¦·¬²±·¬° ¶¨«¤§¶¬ª±¬©¬¦¤±·¨ ©©¨ ¦·²± ¤¯¯·«¨ ·¤µª¨·¶o²·«¨µ©¤¦·²µ¶¶«²∏¯§¥¨ ¶¨¯¨ ¦·¨§¬± ¤¦¦²µ2
§¤±¦¨ º¬·«³µ²§∏¦·¬²± ³µ¤¦·¬¦¨1 Χονχλυσιον : × «¨ ¥¨¶·¨ ¬·µ¤¦·¬²± ·¨¦«±²¯²ª¼¬¶·² ¬¨·µ¤¦·©²µ·«µ¨¨·¬° ¶¨ º¬·«{ ©²¯§ ·¨«¤±²¯ ¶²¯∏·¬²±
kys h l o¤±§t1x « ¤¨¦«·¬° 1¨
[ Κεψ ωορδσ] ¶¨ §¨²© Ζιζιπηυσϕυϕυβα √¤µ1 σπινοσα~ °∏¯·¬·¤µª¨·~¶¤³²±¬±¶~­∏­∏¥²¶¬§¨¶„ ¤±§…~©¯¤√²±²¬§¶
≈责任编辑 刘  
k上接第 zwv页l
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·²¶¼µ¬±ª²±¨ l tss °ª#p t1 × «¨ ¬±§∏¦¬±ªµ¤·¨ ²© «¤¬µ¼ µ²²·º¤¶∏³·² {y1ux h 1 × «¨ ¥¨¶·¦²±§¬·¬²± ²© «¤¬µ¼ µ²²·¦∏¯·∏µ¨ º¤¶  ≥
° §¨¬∏° º¬·«¶∏¦µ²¶¨ ¤¶¦¤µ¥²± °¤·¨µ¬¤¯ ¤±§ ¤¯¦·¤¯¥∏°¬± ¤¶±¬·µ²± °¤·¨µ¬¤¯1 × «¨ ¤±¤¯¼¶¬¶µ¨¶∏¯·¶«²º §¨·«¤··«¨ ¦²±·¨±·¶²©·²·¤¯ ¤¯®¤2
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¦²°³²±¨ ±·¶¬± Χ1 ροσευσ1
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≈责任编辑 王康正 
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第 vs卷第 ts期
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