全 文 :[8] LeeKY,ParkJA,ChungE,etalGinsenosideRh2blocksthecel
cycleofSKHEP1celsattheG1/Sboundarybyselectivelyinducing
theproteinexpressionofp27kip1CancerLet,1996,110(12):193
[9] FarleyJ,SmithLM,DarcyKM,etalCyclinEexpressionisasig
nificantpredictorofsurvivalinadvanced,suboptimalydebulkedovari
anepithelialcancers:AgynecologiconcologygroupstudyCancerRes,
2003,63(6):1235
EfectsofginsenosideRh2(GSRh2)oncelcycleof
Eca109esophagealcarcinomacelline
LILi,QIFengying,LIUJunru,ZUOLianfu
(DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectsofginsenosideRh2(GSRh2)ongrowthinhibitionandcelcycleofEca109
esophagealcarcinomacellineincultureMethod:TheefectsofGSRh2oncelgrowthinhibitionwasdetectedbyMTTassayCelcyclewas
analyzedbyflowcytometry(FCM)CelmorphologywasobservedbyalightmicroscopeafterHEstainingTheproteinexpressionofcelcycle
components(cyclinE,CDK2,p21WAF1)wereexaminedbyimmunocytochemistryandWesternblotThemRNAexpressionwereexaminedby
semiquantitativeRTPCRResult:GSRh2inhibitedtheproliferationofEca109celsindoseandtimedependentmannersTheinhibitionrate
wasabout50%after1daytreatmentwith20μg·mL
-1GSRh220μg·mL
-1GSRh2inducedthematurediferentiationandmorphologicalre
versionWithincreasingdoseofGSRh2treatment,thecelnumberofG0/G1phasewasincreased,whereasitdecreasedatSandG2/Mphase
Therewassignificantdiferencebetween10,20μg·mL
-1GSRh2groupsandthecorespondinggroupwithoutGSRh2treatementAftertreat
ingcelsby20μg·mL
-1GSRh2for1,2,3daysindividualy,theproteinandmRNAexpressionofbothcyclinEandCDK2reduced,whilethe
expressionofp21WAF1enhancedgradualyConclusion:GSRh2couldarestEca109celsatG0/G1phaseandinduceceldiferentiationtend
ingtonormalFurthermore,GSRh2hadanefectonexpressionofcelcyclecomponents(cyclinE,CDK2andp21WAF1)toinhibitEca109
celproliferation
[Keywords] ginsenosideRh2;Esophagealcarcinoma;celcycle;cyclinE;CDK2;p21WAF1
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20050222
[通讯作者] 郑树,Tel:(0571)87214404,Fax:(0571)87214404,Email:zhengshu@zjueducn
康莱特注射液对肺癌 A549细胞环氧化酶
作用的研究
董庆华,钟 献,郑 树
(浙江大学 医学院 附属第二医院 肿瘤研究所,浙江 杭州 310009)
[摘要] 目的:研究康莱特注射液对 IL1β刺激后 A549肺癌细胞环氧化酶(COX)表达的抑制作用。方法:用
RTPCR方法检测100~300μL·mL
-1不同含量康莱特注射液作用前后 A549肺癌细胞 COX1,COX2mRNA表达变
化,同时用Westernblot检测COX2蛋白表达变化。结果:A549细胞在康莱特注射液作用前后 COX1的 mRNA表达
无明显变化,但COX2的mRNA和蛋白表达随着药物作用浓度增加而逐渐降低。结论:康莱特注射液能选择性抑
制A549肺癌细胞COX2表达。
[关键词] 康莱特注射液;环氧化酶;肺癌
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[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)20162103
近年来,肺癌的发病率和死亡率已跃居恶性肿
瘤首位。Hasturk等比较了 101例非小细胞肺癌
(NSCLC)肿瘤组织标本和72例健康人肺活检标本,
在正常支气管上皮细胞环氧化酶 2(COX2)全部阴
性表达,在肿瘤组织中 COX2表达比率为 30%[1]。
田锋等用免疫组化染色79例非小细胞肺癌组织石
蜡切片,肺腺癌和鳞癌 COX2阳性表达率分别为
85%和57%,认为COX2的增强表达与非小细胞肺
癌的浸润性发展密切相关,是非小细胞肺癌患者预
后不良的风险因素之一[2]。康莱特注射液是从传统
中药薏苡仁中提取分离的中性油脂、附加天然乳剂
制备而成,其主要抗癌活性成分为甘油三酯[3]。康
莱特注射液(KLT)在临床应用治疗肺癌具有较明显
的作用,本研究进一步探讨 KLT对肺癌细胞环氧化
酶表达的作用。
1 材料与方法
11 材料
111 药物及试剂 白细胞介素1β(Interleukinβ,
IL1β),proteaseinhibitorcocktail为 Sigma公司产品;
RPMI1640、胎牛血清、TrizolRNA抽提液为美国 Gib
co公 司 产 品;MPermammalianproteinextraction
reagent为 Pierce公司产品;蛋白浓度测定试剂盒为
BioRad公司产品;兔抗人单抗 COX2(H62)单抗、
兔抗Actin(H196)及鼠抗兔 IgGAP(碱性磷酸酶)
二抗为 SantCruz公司产品;RT及 PCR试剂盒为
Promega公司产品;康莱特注射液由康莱特药业公司
提供(批号04040111,含量10%)。
112 细胞株及培养 A549肺癌细胞购自上海细
胞所,10%胎牛血清,5%CO2,37℃孵箱中常规培
养。
12 方法
121 药物处理 实验时将对数生长期细胞传入
6孔板中,加入终含量为10ng·mL-1的IL1β作用24
h后,细胞换液,分别加入终含量为100,200,300μL·
mL-1的康莱特注射液作用24h后收获细胞,同时以
空白乳剂300μL·mL
-1作为对照。
122 细胞 RNA提取及逆转录 到预定收获时
间,弃培养液,用预冷的 1×PBS液洗 2次,加入 1
mLTrizolRNA提取液,反复吹打约10min,加02mL
氯仿,用力振荡混匀,冰浴 10min后,4℃ 离心
12000×g,15min,吸取上清液置另一 eppendorf管
中,加05mL异丙醇混匀,冰浴沉淀10min,离心12
000×g,10min,弃上清,沉淀加75%乙醇1mL洗涤
1次,气干后溶于适量01%DEPC水中,分光光度仪
检测及定量。取2μgRNA进行逆转录,按试剂说明
操作获得cDNA。
123 RTPCR法检测细胞 COX表达 COX1基
因上游引物为 5’CCTTCAATGAGTACCGCAAGAG
3’,下游引物为 5’GTGTGGCCGTCTTGACAATGT3’,
扩增片段大小为306bp,COX2基因上游引物为 5’
CAGCACTTCACGCATCAGTT3’,下 游 引 物 为 5’
TCTGGTCAATGGAAGCCTGT3’,扩增片段大小为755
bp,逆转录后PCR总体积为50μL,反应条件为95℃
5min,95℃ 30s;55℃ 20s;72℃ 20s;72℃ 10
min共30个循环;βactin上游引物为5’TTCCAGCCT
TCCTTCCTGGG3’,下游引物为5’TTGCGCTCAGGAG
GAGCAAT3’,扩增片段为223bp,逆转录后 PCR反
应条件为95℃ 5min,95℃ 30s;60℃ 45s;72℃
45s;72℃5min共29个循环。15%琼脂糖凝胶电
泳,紫外凝胶成像系统拍照。
124 Westernblot法检测细胞 COX2表达 按试
剂说明提取细胞总蛋白,加入蛋白酶抑制剂,蛋白浓
度测定按试剂说明操作,测 A750值,以牛血清白蛋白
(BSA)为标准样品绘制标准曲线。电泳上样蛋白总
量为30μg,250mA2h转膜,转膜后凝胶染色证实
转膜完全,一抗二抗反应后显色。
2 结果
21 KLT对A549细胞COX1mRNA表达的影响
RTPCR结果如图 1所示,KLT对 IL1β刺激状
态下的A549细胞作用24h后,细胞COX1mRNA表
达无明显抑制作用,随着药物作用浓度由 100μL·
mL-1增加到300μL·mL
-1,其抑制作用无明显变化。
22 KLT对A549细胞COX2mRNA表达的影响
RTPCR结果如图 2所示,KLT对 IL1β刺激状
态下的A549细胞作用24h后,细胞COX2mRNA表
达有明显抑制作用,随着药物作用剂量由 100μL·
mL-1增加到300μL·mL
-1,其抑制作用明显增强。
23 KLT对A549细胞COX2蛋白表达的影响
Westernblot结果如图3所示,KLT对 IL1β刺激
状态下的A549细胞作用24h后,COX2蛋白表达具
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图1 KLT对A549细胞COX1mRNA表达的影响
MDL2000标识物;1300μL·mL
-1KLT;
2200μL·mL
-1KLT;3100μL·mL
-1KLT;
4300μL·mL
-1乳剂;Aβactin;BCOX1
图2 KLT对A549细胞COX2mRNA表达的影响
MDL2000标识物;1300μL·mL
-1KLT;2200μL·mL
-1KLT;
3100μL·mL
-1KLT;4300μL·mL
-1乳剂
图3 KLT对A549细胞COX2蛋白表达的影响
Aβactin;BCOX2;1300μL·mL
-1乳剂;2300μL·mL
-1KLT;
3200μL·mL
-1KLT;4100μL·mL
-1KLT
有较明显的抑制作用。随着 KLT药物作用浓度由
100μL·mL
-1增加到300μL·mL
-1,其抑制作用逐渐
增强。
3 讨论
环氧化酶(COX)是催化花生四烯酸产生前列
腺素H2(PGH2)的关键酶,PGH2的分解产物中 PGE2
与肺癌的关系密切,非小细胞肺癌患者支气管灌洗
液中的PGE2水平明显增高,可诱导局部免疫抑制,
对恶性肿瘤进展有重要作用。流行病学和动物实验
结果表明环氧化酶抑制剂非甾体类消炎药(NSAIDs)
可以明显降低多种肿瘤的发生率[4,5]。
COX有 2种异构体:COX1和 COX2[6,7]。
COX1结构性表达于很多组织中,参与维持细胞正
常的生理功能,如维护胃肠道黏膜的完整和调控
肾血流。
COX2在正常组织中几乎检测不到,只在细胞
受到各种因素刺激时诱导性表达,最多见于炎症组
织和肿瘤组织中[7,8]。但现在应用于临床的大多数
NASIDs存在2个主要问题:一是选择性不高,能同
时抑制COX1和 COX2,从而带来胃肠道溃疡等副
作用;二是要求长时间连续服用。因此开发新的
COX2选择性抑制剂具有重要意义。
肺癌细胞株 A549正常表达 COX1而不表达
COX2,在用 IL1β刺激后大量表达 COX2。用康莱
特注射液作用后,A549细胞COX1表达在 mRNA水
平没有明显变化,COX2表达在 mRNA水平和蛋白
水平上均随药物作用浓度增加而下降。研究表明康
莱特注射液能选择性抑制 A549肺癌细胞 COX2的
表达。提示康莱特注射液在临床应用治疗肺癌具有
较明显的作用,与其能选择性抑制 COX2的表达有
关。
[参考文献]
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(下转第1633页)
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表5 参芪五味子胶囊对小鼠网状内皮细胞
吞噬碳粒和溶血素水平(HC50)的影响(珋x±s,n=10)
组别 剂量/g·kg-1 吞噬指数/10-3 HC50
正常对照组 - 33.0±23.7 123±100
参芪五味子胶囊 0.5 48.2±24.8 227±1041)
参芪五味子胶囊 1.0 55.6±18.11) 322±1292)
参芪五味子胶囊 2.0 59.4±21.71) 230±961)
参芪五味子片 1.0 76.9±30.52) 315±1542)
注:与正常对照组相比较1)P<005,2)P<001
仁(炒)组成的中草药制剂。五味子具有润肺、滋肾、
止汗、止泻,涩精之功效,可以增强机体免疫功能,抑
制中枢神经系统,抑制呼吸系统,还有抗应激作用。
黄芪是临床上常用的中药,具有补气、固表、利尿、生
肌的作用。党参有补中益气,生津养血之功效,主治
气短心悸、体倦无力、食少便溏。酸枣仁有安心养
神、益阴敛汗、补中益肝等功能。
本实验发现,参芪五味子胶囊能明显缩短入睡
潜伏期,延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间,增加戊巴比
妥钠阈下睡眠剂量引起入睡的小鼠数,即对小鼠睡
眠的影响与戊巴比妥钠有协同作用;同时,还有减少
小鼠自主活动次数的趋势。结果提示参芪五味子胶
囊有镇静、催眠作用,因此可用于阴虚火旺之失眠患
者,起到定悸安神作用。
应激反应是机体受到各种有害刺激后产生的一
种非特异性紧张反应,长期在应激状态下生活可引
起人体气机紊乱,脏腑阴阳气血失调,导致机体免疫
力下降。疲劳、寒冷、缺氧均是应激原,因此抗疲劳、
耐寒、耐缺氧三项实验是反应机体抗应激功能的重
要指标,而抗应激功能的优劣可直接体现机体对外
界抵抗力的强弱。本实验发现,参芪五味子胶囊能
延长小鼠游泳时间,延长小鼠耐组织缺氧时间,增强
小鼠耐低温能力,表明此制剂具有增强体质的功能。
巨噬细胞的吞噬活性是机体非特异性免疫功能
的重要指标,参芪五味子胶囊能明显增强小鼠网状
内皮系统巨噬细胞的吞噬功能。另外,参芪五味子
胶囊还能使小鼠血清溶血素水平明显升高,使小鼠
分泌抗体功能增强。结果提示参芪五味子胶囊具有
增强非特异性免疫功能和体液免疫功能的作用。
总之,参芪五味子胶囊有明显的镇静作用、抗应
激作用,并能显著增强机体免疫功能。其作用与原
剂型参芪五味子片相当。
[参考文献]
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[责任编辑 古云侠]
(上接第1623页)
EfectofKanglaiteinjectiononcyclooxygenaseactivity
inlungcarcinomaA549cel
DONGQinghua,ZHONGXian,ZHENGShu
(The2ndAfiliatedHospitalofZhejiangUniversity,CancerInstitute,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectofKanglaiteinjectiononcyclooxygenaseactivityinlungcarcinomaA549celsMethods:
TheexpressionofmRNAofCOX1andCOX2weremeasuredbyRTPCRTheexpressionofCOX2proteinwasmeasuredbyWesternblot
Result:KanglaiteinjectioncouldselectivelydecreasedCOX2mRNAexpressionandproteinexpressionwhileCOX1mRNAexpressionwas
unchangedConclusion:KanglaiteinjectionisselectivelyinhibitoryagentofCOX2,andpossessinhibitoryefectsoncyclooxygenase2
[Keywords] Kanglaiteinjection;cyclooxygenase;lungcancer
[责任编辑 古云侠]
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