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¤¬~·¨¯²° µ¨¤¶¨ ≈责任编辑 古云侠
≈收稿日期 ussy2st2ts
≈通讯作者 3 吴小候 oר¯}ksuvl{|stttuu
红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤
的疗效及机制研究
高 飞 t o吴小候 u3 o罗春丽 v o何云峰 u o张良锁 u o杨 美 w
kt1重庆市第五人民医院泌尿外科 o重庆 wsssyu~ u1重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 o重庆 wsssty~
v1重庆医科大学 检验系 o重庆 wsssty~ w1重庆医科大学 解剖教研室 o重庆 wssstyl
≈摘要 目的 }探讨红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤的疗效及机制 ∀方法 }将 zx只 ≥⁄大鼠分为正常对
照组 !缺血再灌注组 !红花注射液低剂量 kyu1x °ª# ®ªpt l!中剂量 ktux °ª# ®ªpt l和高剂量治疗组 kuxs °ª#
®ªpt lo建立肾缺血再灌注损伤模型 o采用血清肌酐 !尿素氮和血尿渗透压值评价肾功能 o×∞检测肾组织细胞凋
亡率 o免疫组化检测肾组织 ¦¤¶³¤¶¨2v蛋白表达的变化 ∀结果 }缺血再灌注损伤后 o肾功能明显减退 o细胞凋亡率和
¦¤¶³¤¶¨2v表达显著升高 kΠ s1stl~运用红花注射液治疗后 o肾功能显著改善 o细胞凋亡率和 ¦¤¶³¤¶¨2v表达显著降
低 kΠ s1stl∀结论 }红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤所致的肾功能损害具有显著的保护作用 o该作用可能
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第 vt卷第 ut期
ussy年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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²√ °¨¥¨ µo ussy
与红花抑制细胞凋亡及 ¦¤¶³¤¶¨2v表达有关 ∀
≈关键词 红花注射液 ~缺血再灌注 ~肾功能 ~凋亡 ~¦¤¶³¤¶¨2v
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussylut2t{tw2sx
肾移植术 !体外冲击波碎石术和休克等众多情
况下均可导致肾缺血再灌注损伤 ∀尽管重症监护和
血液净化等医疗技术的应用 o使患者的预后有一定
改善 o但高额的医疗费仍给实际应用带来巨大困难 o
寻求更为经济 !实用的防治手段实属必要 ∀近年来 o
中药红花对缺血再灌注损伤的保护作用被逐步重
视 o红花对心 !脑等脏器的缺血再灌注损伤均有显著
保护作用 o但其对肾缺血再灌注损伤的疗效及可能
机制尚不清楚 ≈tou ∀本实验研究红花注射液对大鼠
肾缺血再灌注损伤的疗效及初步机制 ∀
1 材料和方法
111 药品与试剂
红花注射液 kxs °ª# °pt o山西康意制药有限
公司 o批号 usssutuuyl∀肌酐检测试剂盒 k北京北
化 lo尿素氮检测试剂盒 k南京建成公司 lo ×∞
试剂盒 k ²¦«¨公司 lo兔抗大鼠 ¦¤¶³¤¶¨2v单克隆抗
体 k≥¤±·¤≤µ∏½公司 lo兔二步法免疫组化试剂盒及
二氨基联苯胺 k⁄
l显色液 k北京中杉 l∀
112 主要仪器
冰点渗透压测定仪 k≥≥o日本 lo石蜡
切片机 k¨¬¦¤o µ¨°¤±¼lo离心机 o生物照相显微镜
k ¼¯³∏°¶p wxo日本 lo北京航天航空大学 ≤ p
usss
型生物医学图像分析系统 ∀
113 动物模型的建立及用药
清洁级健康 ≥⁄大鼠 zx只 o雌雄不限 o同批龄
y ∗ {周 o体重 t{s ∗ uss ªo由重庆医科大学动物实验
中心提供 ∀随机分成正常对照组 o缺血再灌注组 o红
花注射液高 !中 !低剂量治疗组共 x组 o每组 tx只 ∀
参照以往方法建立肾缺血再灌注损伤模型 ≈v o方法如
下 o于术前 tu «禁食禁饮 o采用 v1xh水合氯醛 s1st
°# ªpt腹腔麻醉后 o腹横切口入腹腔 o首先切除右
肾 o继而显露左肾蒂 o用无创伤血管夹夹闭左肾蒂 wx
°¬±o造成肾缺血 o然后松开血管夹 o数分钟内肾脏颜
色由缺血时的暗红色逐渐转变为淡红色 o表示肾缺血
再灌模型建立成功 ∀实验各组动物处理及用药如下 o
缺血再灌注组 }采用上述方法建模 o并于术前 v §每
天 t次 o共 v次及术后每 { «t次 o共 v次 o经尾静脉
注射生理盐水 v °# ®ªpt ∀小剂量 !中剂量和大剂
量治疗组 }建模方法及术前术后用药方法同缺血再灌
注组 o采用红花注射液替换生理盐水注射 o红花注射
液低 !中 !高剂量组分别为 yu1xotuxouxs °ª# ®ªpt ∀
正常对照组 }进入腹腔后不作处理 wx °¬±后关腹 o术
前术后处理同缺血再灌注组 ∀实验各组均于术后 tu
«始禁水至 uw «处死动物 ∀
114 检测项目
11411 尿素氮 k
l和肌酐 k≥¦µl的测定 术后于
再灌注 uw «经下腔静脉取血 u °ot sss µ# °¬±pt
离心 u °¬±后取血清 o每次各组采 t只共 x只 o同批
次二乙酰 2肟法测定血清尿素氮值 o碱性苦味酸法
检测血清肌酐值 ∀
11412 血尿渗透压测定 术后于再灌注 uw «经下
腔静脉取血 s1x °o膀胱穿刺取尿 s1x °∀每次各
组采 t只共 x只 o同批次采用冰点渗透压测定仪测
定血 !尿渗透压值 o并算出尿渗透压 r血渗透压值 ∀
11413 细胞凋亡率测定 制作石蜡切片 o常规用二
甲苯脱蜡 o采用末端脱氧核苷酸转移酶 kק×l介导
的原位末端标记法 k×∞l测定凋亡率 o按检测试
剂盒说明书进行 ∀最后脱水 !透明 !封片 ∀光镜下观
察 o细胞核呈棕黄色为凋亡细胞 o同一部位 ∞染色
组织切片在同一放大倍数下随机选取 {个视野计算
出细胞总数 o采用肾组织凋亡细胞总数 r细胞总数计
算出细胞平均凋亡率 ∀
11414 免疫组化检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋
白酶 2vk¦¤¶³¤¶¨2vl的表达 术后 uw «取左肾制作
石蜡切片 o石蜡切片常规脱蜡至水 ∀按兔二步法免
疫组化试剂盒操作 ovh过氧化氢孵育 tx °¬±o×
≥
洗 v次 o各 x °¬±∀置 s1st °²¯ # pt柠檬酸盐缓冲
液 k³ y1sl中 o微波热修复法行抗原修复 ts °¬±∀
正常山羊血清封闭 vs °¬±o滴加一抗 ¦¤¶³¤¶¨2vo w
ε 冰箱过夜 ~ ×
≥洗 v次 o各 x °¬±后 o滴加山羊抗
兔 2 °k二抗 lovz ε 孵育 vs °¬±o⁄
显色 o苏木
素复染 o甘油明胶封片 ∀每张切片随机采集 x个高
倍视野 o输入医学图像分析系统进行图像处理 o检测
¦¤¶³¤¶¨2v表达的平均吸收度 kΑl∀
115 统计学处理
计量资料用 cξ ? σ表示 o多组间均数比较采用单
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第 vt卷第 ut期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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因素方差分析 k¶³¶¶tv1ss软件 l∀
2 结果
211 红花注射液对肾功能的影响
见表 to与正常对照组相比 o缺血再灌注损伤后
血清肌酐及尿素氮值显著升高 kΠ s1stlo尿渗透
压和尿渗透压 r血渗透压值明显降低 kΠ s1stl~运
用红花注射液治疗后 o与缺血再灌注组相比 o各治疗
组血清肌酐及尿素氮值明显降低 o尿渗透压和尿渗
透压 r血渗透压值明显升高 kΠ s1stlo且高剂量治
疗组与中 !低剂量治疗组相比 o血清肌酐及尿素氮值
显著降低 o而尿渗透压和尿渗透压 r血渗透压值显著
升高 kΠ s1stl∀
表 t 各组肌酐 !尿素氮 !尿渗透压和尿渗透压 r血渗透压 kcξ ? σ, ν txl
分组 剂量 r°ª# ®ªpt
r°°²¯# pt ≥¦µrΛ°²¯# pt 尿渗透压 r°¶°# ®ªpt # u 尿 r血渗透压
正常对照 s zqy ? tqwx wuqx ? uqw{ t xzw ? |zquw xqtu ? sqyv
模型 s xtq| ? wqsztl uszqt ? yqsztl yxt ? x|q{ytl uqt{ ? squ{tl
红花注射液 yu1x wzqu ? uqvutoul tyzq{ ? uq|ytoul t t{z ? tvtqvwtoul vq{x ? sqvytoul
tux wyq{ ? tq{{toul tyxqx ? sq|ytoul t uys ? tuwq|stoul wqtw ? sqvvtoul
uxs wvqw ? tqzytouovl tw|qw ? wqvstouovl t wsu ? |{qyytouovl wqyz ? sqv{touovl
注 }与正常对照组比较 tl Π s. st;与缺血再灌注组比较 u) Π s. st;与低剂量组比较 v) Π sqstk表 u同 l
212 ×∞检测凋亡率的结果
×∞阳性细胞表现为细胞核呈黄褐色 o细胞
质无染色 o均位于肾小管 o肾小球无表达 o见图 t∀
图像分析后 o结果见表 u∀缺血再灌注损伤后 o与正
常对照组相比 o缺血再灌注组细胞凋亡率明显增加
kΠ s1stl~运用红花注射液治疗后 o与缺血再灌注
组相比 o各治疗组细胞凋亡率显著下降 kΠ s1stl~
高剂量治疗组较中 !低剂量治疗组细胞凋亡率显著
下降 kΠ s1stl~低剂量治疗组与中剂量治疗组相
比细胞凋亡率无统计学差异 ∀
表 u 各组凋亡率和 ¦¤¶³¤¶¨2v Αkcξ ? σ, ν txl
分 组
剂量
r°ª# ®ªpt
凋亡率
rh Α
正常对照 s uqz ? sq| sqstw ? sqssy
模型 s wvqx ? yqstl squtv ? sqsuvtl
红花注射液 yu1x vtq{ ? xqstoul sqtzu ? sqstxtoul
tux vsqu ? wqytoul sqtyy ? sqststoul
uxs uyqw ? vqxtouovl sqtx{ ? sqstutoul
图 t 肾组织细胞凋亡情况 k ≅ wssl
/ η 0示肾小球 o/d 0阳性细胞 ~¤1正常对照组 ~¥1缺血再灌注组 ~¦1低剂量治疗组 ~§1中剂量治疗组 ~ 1¨高剂量治疗组 k图 u同 l
213 红花注射液对 ¦¤¶³¤¶¨2v蛋白表达的影响
¦¤¶³¤¶¨2v阳性细胞表现为细胞质呈棕黄色 o细
胞核无着色 o图中细胞核呈深蓝色系苏木素复染的
结果 ∀阳性细胞位于肾小管 o主要以近曲小管为主 o
肾小球未见表达 k见图 ul∀图像分析后 o结果见表
uo与正常对照组相比 o缺血再灌注组 ¦¤¶³¤¶¨2v Α明
显增强 o运用红花注射液治疗后 o与缺血再灌注组相
比 o各治疗组 ¦¤¶³¤¶¨2v Α显著降低 kΠ s1stl~低 !
中和高剂量治疗组间比较 ¦¤¶³¤¶¨2v Α无显著性差
异 ∀
图 u 肾组织 ¦¤¶³¤¶¨2v蛋白表达 k ≅ wssl
3 讨论 红花性辛温 o归心肝经 o具有活血通经 o祛瘀止
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto ¶¶∏¨ ut
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痛的功效 ∀红花注射液由红花提取有效成分精制而
成 o主要含有查耳酮类 !漆树黄酮 !山柰酚 !桑色素 !
槲皮素和杨梅素等成分 ≈w ∀有报道 o红花具有抗凋
亡 !抗凝 !防止血栓形成及扩张血管等功效 ≈tox ∀
本研究表明 o缺血再灌注损伤后 o肾小球滤过功
能及肾小管浓缩功能明显减退 ∀运用红花注射液治
疗后 o与缺血再灌注组相比 o各治疗组血清肌酐及尿
素氮值明显降低 o尿渗透压和尿渗透压 r血渗透压值
明显升高 kΠ s1stlo且大剂量治疗组较中小剂量
治疗组上述肾功能检测指标显著改善 kΠ s1stl∀
这一结果提示 o红花注射液对缺血再灌注损伤所致
肾小球滤过功能及肾小管浓缩功能损害具有显著的
保护作用 o且在本实验的用药范围内 o用药剂量越大
保护作用越强 ∀
缺血再灌注损伤可通过炎症 !活性氧 !内皮素和
细胞凋亡等多种途径导致肾损害 ≈y2{ ∀越来越多的
研究表明 o细胞凋亡是缺血再灌注致肾损伤的重要
环节之一 ≈| ∀有报道 ≈uots o红花对心 !脑等脏器缺血
再灌注损伤的保护作用与其抗细胞凋亡有关 ∀本研
究检测细胞凋亡率的结果显示 o各治疗组与缺血再
灌注组相比 o细胞凋亡率显著下降 ~且大剂量治疗组
较中 !小剂量治疗组细胞凋亡率明显下降 kΠ
s1stl∀首次证实 o红花注射液具有抑制肾缺血再
灌注损伤引起细胞凋亡的作用 ∀
¦¤¶³¤¶¨2v是 ¦¤¶³¤¶¨级联反应中最关键的效应
蛋白酶 o处于细胞凋亡的核心地位 ∀ ¦¤¶³¤¶¨2v主要
通过 ƒ¤¶rƒ¤¶系统和粒酶
r穿孔素系统导致细胞
凋亡 ≈ttotu ∀本实验结果表明 o与正常对照组相比 o
缺血再灌注组 ¦¤¶³¤¶¨2v Α值明显增强 o运用红花注
射液治疗后 o与缺血再灌注组相比 o各治疗组
¦¤¶³¤¶¨2v Α值均显著降低 kΠ s1stl∀提示 o红花
注射液具有抑制 ¦¤¶³¤¶¨2v表达的作用 ∀
综上所述 o红花注射液对缺血再灌注损伤所致
肾功能损害具有显著的保护作用 o其能够抑制
¦¤¶³¤¶¨2v蛋白表达 o具有抑制细胞凋亡的作用 o该
作用可能是红花注射液对肾缺血再灌注损伤产生保
护作用的重要分子机制之一 ∀
≈参考文献
≈t 罗 嘉 o方治平 o周黎明 o等 q红花注射液对大鼠局灶性脑缺
血后梗死体积和神经元凋亡相关蛋白 ¥¦¯2uo¦¤¶³¤¶¨2v表达的
影响 ≈ q中国中药杂志 ousswou|ktsl}|zzq
≈u 陈铎葆 o郑为超 o赵 辉 o等 q红花总黄素对心肌缺血 2再灌注
损伤大鼠心功能的影响 ≈ q中国中医药科技 oussvotskxl}
u|sq
≈v 刘秉乾 o武玉东 o马腾骧 o等 q血红素氧和酶 2t对大鼠肾缺血
再灌注损伤的保护作用 ≈ q中华实验外科杂志 ousswout
ktul}txvtq
≈w 张 戈 o郭美丽 o李 颖 o等 q不同品种红花黄酮类成分的
°≤含量测定及其遗传稳定性研究 ≈ q中草药 ousswovx
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≈x ×½¨ ±ª≥ o ² • ≤o ² ƒ o ·¨¤¯q±«¬¥¬·¬²± ²©³¯¤·¨¯ ·¨¤ªªµ¨2
ª¤·¬²± ¥¼ ¶²°¨©¯¤√²±²¬§¶≈ q׫µ²°¥ ¶¨ot||toyw}|tq
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≈ts 罗 嘉 o周黎明 o方治平 o等 q红花注射液对大鼠局灶性脑缺
血后细胞凋亡的影响 ≈ q四川中医 ousswouukul}uzq
≈tt ¤ª¤·¤ ≥qƒ¤¶ ¬¯ª¤±§2¬±§∏¦¨§ ¤³²³·²¶¬¶≈ q±±∏ √¨ ±¨ ·¨o
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Εφφεχτ οφ σαφφορ(Χαρτηαµ υσ τινχτοριυσ) ινϕεχτιον ον
ρεναλισχηεµ ια/ρεπερφυσιον ινϕυρψ ιν ρατσ
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(t. ∆επαρτµ εντ οφ Υρολογψ, Τηε Νο. x Ηοσπιταλοφ Χηονγθινγ , Χηονγθινγ wsssyu, Χηινα;
u. ∆επαρτµ εντ οφ Υρολογψ, Τηε Φιρστ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλοφ Χηονγθινγ Υνιϖερσιτψ οφΜεδιχαλΣχιενχεσ, Χηονγθινγ wsssty, Χηινα;
v. ∆επαρτµ εντ οφ ΛαβορατορψΜεδιχινε, Χηονγθινγ Υνιϖερσιτψ οφΜεδιχαλΣχιενχεσ, Χηονγθινγ wsssty, Χηινα;
w. ∆επαρτµ εντ οφ Ανατοµ ψ, Χηονγθινγ Υνιϖερσιτψ οφΜεδιχαλΣχιενχεσ, Χηονγθινγ wsssty, Χηινα)
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第 vt卷第 ut期
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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µ¤·¶1Μετηοδ : ≥ √¨ ±¨·¼2©¬√¨≥⁄ µ¤·¶º µ¨¨ µ¤±§²° ¼¯ §¬√¬§¨ § ¬±·² ©¬√¨ ªµ²∏³¶kν txo¬± ¤¨¦«lo ±²µ°¤¯ ¦²±·µ²¯ ªµ²∏³¶o r ¦²±·µ²¯
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[ Κεψ ωορδσ] ¦¤µ·«¤°∏¶·¬±¦·²µ¬∏¶¬±¨¦·¬²±~ ¬¶¦«¨ °¬¤rµ¨³¨ µ©∏¶¬²±~ µ¨±¤¯ ©∏±¦·¬²±~ ¤³²³·²¶¬¶~ ¦¤¶³¤¶¨2v
≈责任编辑 古云侠
≈收稿日期 ussx2tt2us
≈通讯作者 3 肖培根 oר¯}kstslyvsttu|w
uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷
对 ³¨u细胞的细胞毒性及其作用机制
田 泽 t o斯建勇 t o陈四保 t o杨梦甦 u o肖培根 t3 o吴二喜 v
kt1中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|w~
u1香港城市大学 深圳研究院 o广东 深圳 xt{sxz~
v1波士顿儿童医院 哈佛医学院 o波士顿 马萨诸塞州 suttxl
≈摘要 目的 }研究自兴安升麻提取的 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对 ³¨u细胞的细胞毒性及其作用
机制 ∀方法 }利用 ××法进行细胞毒活性测定 ~用 r∞
染色法观察细胞个体的凋亡 ~以流式细胞光度术研究细
胞周期的改变并验证凋亡的产生 ~用蛋白印迹技术从分子水平阐明该化合物的细胞毒作用机制 ∀结果 } uv2Ο2乙酰
升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷可以明显抑制 ³¨u细胞生长 o≤xs为 ty Λ°²¯# pt ∀同时该化合物可以使 ³¨u细胞产
生凋亡形态学变化和 u 2 细胞周期阻滞 o并使 ° °蛋白裂解 o¥¦¯2uo
¤¬o¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
等凋亡和细胞周期相
关蛋白表达改变 ∀结论 } uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对 ³¨u细胞具有明显的细胞毒作用 o该化合物可诱导
³¨u细胞凋亡和 u 2 周期阻滞 o其凋亡机制涉及 ¦¤¶³¤¶¨¶家族激活 o¥¦¯2u和
¤¬表达改变 o而 u 2 周期阻滞与
¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
下调直接相关 ∀
≈关键词 兴安升麻 ~uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷 ~凋亡 ~细胞形态 ~细胞周期 ~蛋白表达
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussylut2t{t{2sw
升麻属 Χιµ ιχιφυγα植物隶属毛茛科 ¤±∏±¦∏2
¤¯¦¨¤¨ o包括兴安升麻 Χ1δαηυριχα,西升麻 Χ1φοετιδα,
单穗升麻 Χ1σιµ πλεξ,南川升麻 Χ1νανχηυανενσισ,小
升麻 Χ1αχερινα以及总状升麻 Χ1ραχεµ οσα等主要品
种 ∀兴安升麻是我国特有品种 o其根茎作为常用中
药已载入 5中国药典 6o具有清热解毒 !升举阳气 !发
表透疹的功能 o主治风热头痛 !齿痛 !咽喉肿痛 !子宫
脱垂等症 ~而地上部分通常作为废弃物 ∀早在 us世
纪六七十年代日本学者曾从其中分离到一些环菠萝
蜜烷三萜化合物 ≈t o|s年代以后 o国内学者对兴安
升麻进行大量研究 o发现地上与地下部分化学成分
相似 o环菠萝蜜烷三萜化合物为其中主要特征成
分 ≈uov ∀药理研究表明 o兴安升麻地下部分总苷可
以抑制猴艾滋病毒的复制和丝裂酶素 ≤诱发的人
外周血淋巴细胞姐妹染色体的互换 ≈wox ~并可促进
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第 vt卷第 ut期
ussy年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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