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Experimental study on treatment of minimal change nephropathy with Lespedeza Michx

胡枝子总黄酮治疗大鼠微小病变型肾病综合征的实验研究



全 文 :胡枝子总黄酮治疗大鼠微小病变型肾病
综合征的实验研究
王彩云 o邓虹珠 3 o李 辉
k南方医科大学 中医系 o广东 广州 xtsxtxl
≈摘要  目的 }探讨胡枝子对微小病变型肾病的治疗作用 o为其开发利用提供实验基础 ∀方法 }利用尾静脉注
射阿霉素复制大鼠微小病变型肾病模型 o观察胡枝子总黄酮对模型 uw «尿蛋白 !血清超氧化物歧化酶k≥’⁄l活性 !
总抗氧化能力k„×≤’l o丙二醛k⁄„l oŒ2{ oבƒ2Α含量的影响及对肾组织的病理改变 ∀结果 }胡枝子总黄酮能降低
尿蛋白含量 o提高 ≥’⁄活力及 „×≤’能力而降低血中 ⁄„ o并抑制 Œ2{ oבƒ2Α的分泌 ∀结论 }胡枝子总黄酮对大鼠
微小病变型肾病综合征有一定治疗作用 ∀
≈关键词  胡枝子 ~黄酮类化合物 ~微小病变型肾病综合征
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxls{2sytw2sw
≈收稿日期  ussw2s|2tu
≈通讯作者   3 邓虹珠 oר¯ } ksusl ytyw{uyx o ƒ¤¬} ksusl
ytywtssu o∞2°¤¬¯} ⁄¨ ±«½«ƒ©¬°°∏1¦²°
微小病变型肾病综合征k≤‘≥l是肾病综合征
常见的病理类型之一 o临床以大量蛋白尿 !低蛋白血
症 !高脂血症及水肿为特征 ∀目前西医对该病的治
疗 o仍以激素及细胞毒药物为主 o由于这类药物对人
体细胞的作用选择性差 o在抑制异常免疫反应的同
时 o也抑制人体其他细胞的正常功能 o因此毒副作用
较大 ∀豆科胡枝子属 Λεσπεδεζα ¬¦«¬1 植物胡枝子 o
味微苦 o性平 o强筋益肾 o健脾祛湿 o润肺清热 ∀从本
属植物中已分离鉴定的化学成分有黄酮 !生物碱 !三
萜 !有机酸及甾醇类 ∀药理实验表明胡枝子具有抗
炎 !镇痛 !利尿和改善肾功能等作用≈t  ∀临床观察表
明肾炎四味片治疗肾小球肾炎临床效果确切 o而胡
枝子为肾炎四味片的君药之一 ∀为了胡枝子的药源
开发和利用提供实验基础 o作者考察胡枝子对阿霉
素致微小病变肾病大鼠的治疗作用 ∀
1 材料
111 药物和试剂 胡枝子总黄酮 o兰州佛慈药厂提
供 o批号 svsyts ~肾炎四味片 o荆州市制药厂生产 o批
号 sttssu ~注射用盐酸多柔比克k阿霉素 „⁄• l o深
圳万乐药业有限公司 o批号 svttsv ~马来酸依那普利
k„≤∞Œ抑制剂l o扬子江制药股份有限公司 o批号
svsvtu ~丙二醛k⁄„l !超氧化物歧化酶 k≥’⁄l !总
抗氧化能力k„×≤’l测定试剂盒及其他生化试剂由
南京建成生物工程研究所提供 oבƒ oŒ2{定量 ∞Œ„
试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供 ∀
112 器材 全自动血液生化分析仪k美国 o≤¬¥¤2
≤²µ±¬±ªl ouust紫外2可见分光光度计k日本 o岛津l ∀
离心机k⁄x p u„ 北京医用离心机厂l o高速离心机
k׊p ty{上海安亭科学仪器厂l ozxw紫外2可见分
光光度计k中国上海第三分析仪器厂l o透射电镜
k∞ p tuss∞÷l ∀
113 动物 清洁级 ≥⁄大鼠 xv只 o体重kuss ? usl
ªo雄性 o购于本校k原第一军医大学l动物中心 o合格
证号 }粤动检证字第 ussw„st{号 ∀
2 方法
211 动物模型的制作 大鼠适应性喂养 t周后 o称
体重 !测定第 t 次尿蛋白 o随机分组 o并应用
≥°≥≥ts1s软件统计分析确保各组间没有显著性差
异 o然后尾静脉注射 „⁄• 造模 ∀
参照 …¨ µ·¤±¬氏方法≈u  o改良复制阿霉素微小病
变型肾病大鼠模型 o每只鼠第 t次尾静脉注射 „⁄•
w °ª#®ªpt ot周后 o第 u次注射 v1x °ª#®ªpt o空白组
用相同的方法注射相同体积的生理盐水 ∀原造模方
法为每只鼠 z1x °ª#®ªpt一次性尾静脉注射 o作者在
预试中发现 o该方法死亡率很高 o死因为 „⁄• 副作
用引起的严重腹泻 ∀改良后成活率在 |s h以上 o第
u次注射 „⁄• t周后收集尿液 o检测出尿蛋白 o说明
造模成功 ∀
#wty#
第 vs卷第 {期
ussx年 w月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs oŒ¶¶∏¨ {
„³µ¬¯oussx
212 给药方法 实验动物随机分为 x组 }正常组 {
只 !模型组 tu只 !阳性对照组 !胡枝子高 !低剂量组
k均为 tt只l ∀胡枝子成人常用量 ux ª#®ªpt#§pt ~
其总黄酮含量为 u1vt ª#°pt o用时蒸馏水稀释配
制 ∀第 u次注射 „⁄• 后开始给药 o胡枝子高剂量组
kx1xs ª#®ªpt#§pt ou倍生物等效量l !胡枝子低剂量
组ku1ux ª#®ªpt#§pt o生物等效量l ~阳性对照组k肾
炎四味片 ot1u|y ª#®ªpt#§pt ou倍生物等效量l ~各
组溶成 u °溶液灌胃 o连续 w周 ∀正常对照组与模
型组用相同的方法给予 u °生理盐水 ∀
213 观察指标和测定方法
21311 一般情况 观察大鼠的精神状态 !体重 !体
毛 !进食量 !饮水量 !二便及活动情况等 ∀
21312 尿蛋白检查 将大鼠单独喂养在代谢笼中 o
收集 uw «尿液 o记录尿量 o分别于第 t周和第 v ow o
x oy周末测 uw «尿蛋白量 ∀
21313 肾脏形态学检查 实验第 y周末杀检 ∀光
镜 }取肾皮质 o经 ts h福尔马林固定 !乙醇脱水 !石
蜡包埋后 o制成 w Λ°厚的石蜡切片 o‹∞染色 o光镜
下观察肾小球的变化情况 ~电镜 }取少量肾皮质组
织 o用 u h戊二醛固定 vs °¬±o再用 t h锇酸固定 t
«o脱水 o∞³µ²±{tu常规包埋 o制作超薄切片 o铀2铅双
染色 o用 ∞ p tuss∞÷ 型透射电镜观察k拍片条件
为 xs ∗ zs ®∂ o÷{sssl ∀
21314 血清 ≥’⁄活力 !⁄„含量 !总抗氧化能力检
测 血清 ≥’⁄o⁄„ o总抗氧化能力均按试剂盒规定
程序进行测定 ∀
21315 血清 Œ2{ oבƒ2Α的测定 采用双抗夹心
„…≤2∞Œ≥„法 ∀用抗大鼠 Œ2{ 单抗包被于酶标板
上 o标准品和样品中的 Œ2{与单抗结合 o加入生物
素化的抗大鼠 Œ2{抗体 o形成免疫复合物连接在板
上 o辣根过氧化物酶标记的 ≥·µ¨³·¤√¬§¬±与生物素结
合 o加入酶底物 ’°⁄o出现黄色 o加终止液硫酸 o颜色
变深 o在 w|u ±°处测 Α值 oŒ2{浓度与 Α值成正比

kבƒ2Α检测原理同 Œ2{l ∀具体检测方法按说明书
操作 ∀
214 统计方法 实验数据以 cξ ? σ表示 ∀采用
≥°≥≥ts1s 统计软件 o单因素方差分析法k’±¨ 2 • ¤¼
„‘’∂ „l比较组间差异 o组间两两显著性比较采用
ΛΣ∆法 ∀
3 结果
311 一般情况 除正常组外 o尾静脉注射 „⁄• 的
各组大鼠均有不同程度的腹泻 o摄食减少 o精神萎
顿 o活动减少 o体毛干枯不齐 o尾部苍白粗糙 o甚至烂
尾等现象 o药物组大鼠表现均较模型组轻 o但不如正
常组健康 ∀共死亡大鼠 w只 o模型组 v只 o低剂量组
t只 ∀
正常组大鼠体重持续增加 ~造模后 o模型组体重
持续降低 ~各给药治疗组在第 u次注射阿霉素后 t
周时体重降到最低点 o随后体重持续缓缓增加 o各药
物组大鼠体重均较模型组同期重k图 tl ∀
图 t 大鼠体重动态变化曲线图
312 尿蛋白测定 模型组在第 w oy周末 o尿蛋白量
进行性升高 o明显高于正常组k Π s1stl ∀第 w周
末 o即干预治疗 u周后 o胡枝子高 !低剂量组与模型
组相比有降低的趋势 o但无统计学意义 ~第 y周 o即
干预治疗 w周后 o阳性组及胡枝子高 !低剂量组明显
低于模型组 o差异显著k Π s1sxl o胡枝子高剂量组
治疗作用最为明显k Π s1st o表 tl ∀
表 t 各组大鼠 uw «尿蛋白量kcξ ? σl
组别
剂量
rª#®ªpt#§pt
ν
尿蛋白量r°ª#uw «pt
实验前 第 w周末 第 y周末
正常组 { tu qsw ? u q{s tv qu| ? w quu tx q|| ? w qww
模型组 | tt qzu ? v qu| y| qyz ? ty qwwul utw qvx ? w| q{xul
胡枝子组 x qxs tt tt qws ? t qyw w| q{y ? tw qw| tyu qsv ? vx quwwl
u qux ts tu qwv ? v qww xx qwx ? ty qut tz{ q{x ? wt q|wvl
肾炎四味片组 t qu|y tt tu quz ? v qw{ xs q{s ? tx qyy tzs qzv ? vy qz|vl
注 }与正常对照组比tl Π s1sx oul Π s1st ~与模型对照组比vl Π s1sx owl Π s1stk表 u ov同l
#xty#
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∂²¯1vs oŒ¶¶∏¨ {
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313 血清 ⁄„含量 !≥’⁄活力 !总抗氧化能力检测
与正常组比较 o模型组 ⁄„ 含量显著升高k Π
s1stl o≥’⁄活力显著降低k Π s1stl ∀胡枝子高 !低
剂量组 !阳性组 ⁄„含量均较模型组低 o且有显著
性差异k Π s1st oΠ s1sxl ∀各给药组 ≥’⁄活力均
较模型组高 o胡枝子高剂量组作用最强 o与模型组有
非常显著性差异k Π s1stl ∀胡枝子组及复方组总
抗氧化能力也较模型组强k Π s1st o表 ul ∀
314 胡枝子对肾炎模型大鼠血清 Œ2{ oבƒ2Α的影
响 模型对照组大鼠血清 Œ2{ oבƒ2Α水平较正常
对照组显著升高k Π s1stl o胡枝子高低剂量组及
阳性组大鼠血清 Œ2{ oבƒ2Α水平均低于模型组 o且
有显著性差异k Π s1sx o表 vl ∀
315 肾脏形态学检查 肾脏形态学检查结果 }光
表 u 各组大鼠血清 ≥’⁄活性 !⁄„含量及总抗氧化能力kcξ ? σl
组别 剂量rª#®ªpt#§pt ν ⁄„r±°²¯#°pt ≥’⁄r˜#°pt ׄ≤’r˜#°pt
正常组 { v quu ? s q|x uz qx| ? z qwx w qvw ? s qzy
模型组 | x qv| ? t quxul tv qzu ? v qysul w q|x ? s q|t
胡枝子组 x qxs tt v qww ? t qtvwl ut q{z ? x qzzwl y q|z ? t q{uwl
u qux ts w qtx ? t qsvvl t{ q{y ? w q||vl x q{w ? t qxu
肾炎四味片组 t qu|y tt v qys ? t qtuwl us qxy ? w qytwl z qxy ? t qxywl
表 v 胡枝子对模型大鼠血清 Œ2{ oבƒ2Α的影响kcξ ? σl
组别
剂量
rª#®ªpt#§pt
ν
Œ2{
r³ª#°pt
בƒ2Α
r³ª#°pt
正常组 { wx qzt ? z qxu u q|{ ? s qvy
模型组 | tuw q|y ? ut qztul y q{v ? s qzxul
胡枝子组 x qxs tt {s qst ? ux qwwwl x q{s ? s qwxwl
u qux ts |t qzv ? uu qxtwl y qtu ? s qytvl
肾炎四味片组 t qu|y tt |u qsy ? uy quvwl x qyz ? s qxywl
镜下 o模型组肾小球脏层上皮细胞肿胀 o球囊腔变
窄 o偶见系膜细胞增生 o肾小管内见蛋白管型 ∀胡枝
子治疗组和肾炎四味片组上述病理改变均较模型组
为轻 ~电镜片显示 o正常组鼠肾小球上皮的足突清楚
可见 o内皮窗孔清晰 o基底膜均匀完整k图 ul ∀模型
组鼠肾小球上皮的足突广泛融合k图 vl ∀胡枝子高
剂量组鼠肾小球上皮的足突融合较模型组明显减
轻 o仅局部融合k图 wl ∀
图 u 正常组鼠肾小球上皮k ≅ x sssl
4 讨论
微小球病变型肾病k≤‘l是引起肾病综合征最
常见的病理类型之一 ∀阿霉素所致的大鼠实验性肾
损伤模型 o其病理变化与临床表现符合人类的
≤‘o是一个国际公认的动物模型 o本实验选用该模

图 v 模型组鼠肾小球上皮k ≅ ts sssl
图 w 胡枝子高剂量组鼠肾小球上皮k ≅ ts sssl
型考察胡枝子总黄酮对肾病综合征的治疗作用 ∀阿
霉素通过羧基的还原而代谢 o其代谢产生的氧自由
基 o直接损伤肾小球脏层上皮细胞 o从而使肾小球滤
过膜的分子选择屏障和电荷屏障受损导致大量蛋白
尿的发生 ∀该模型中存在着亢进的脂质过氧化反
应 o与人类的 ≤‘相一致 ∀该模型也是考察在肾炎
发生发展过程中 o药物对脂质过氧化损伤影响的一
个较好的模型 ∀本研究发现 o服用胡枝子的大鼠尿
蛋白含量明显降低 o血中 ≥’⁄含量显著高于模型对
照组 o说明胡枝子可显著增加模型大鼠血中 ≥’⁄含
量 o特异性地清除氧自由基 ∀同时 o胡枝子能抑制模
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型大鼠血清过氧化脂质的生成 o减少过氧化脂质对
细胞结构及功能的损害 o表现为胡枝子治疗组血清
⁄„含量降低 ∀
尿蛋白是肾小球疾病最常见表现 o也可作为一
个独立的致病因素参与肾病变过程 ∀尿蛋白对肾小
球系膜细胞和肾小管上皮细胞有直接损害≈v  ∀肾小
球内细胞的膜性结构含有丰富的不饱和脂肪酸 o对
氧自由基极为敏感 o两者极易结合形成自由基中间
产物 o如有机烷自由基k#l o然后与 ’u反应 o生成脂
过氧基k’’#l和脂氢过氧化物k’’‹l o后者可分
解形成丙二醛k⁄„l ∀中间产物氧自由基和 ⁄„
可通过共价键与细胞膜结合 o影响细胞的结构和功
能 o使细胞膜脆性增加≈w  ∀因此增强 ≥’⁄活性 o抑
制血清过氧化脂质的生成 o提高总抗氧化能力从而
减轻机体组织细胞的损伤 o改善肾脏的组织功能 o可
能是胡枝子治疗肾小球肾炎的机理之一 ∀
胡枝子抑制Œ2{ oבƒ2Α的分泌 ∀在肾炎病变中 o
除疾病状况下浸润的白细胞外 o几乎所有肾脏固有细
胞具有产生细胞因子的能力 o同时肾组织细胞又是细
胞因子生物学作用的靶细胞 o使肾小球病理变化加
剧 o引起肾小球组织结构及功能异常≈x  ∀肾小球系膜
细胞在Œ2tΒ和 בƒ刺激下释放 Œ2{≈y  o使 Œ2{水平
升高 ∀Œ2{不仅能使外周血中性粒细胞数量增加 o还
可以使其脱颗粒 !产生白三烯 …w o释放溶酶体酶 !产
生呼吸爆发 o加重肾脏病理损伤≈z  ∀活化的单核巨噬
细胞产生的 בƒ称为 בƒ2Αo是参与机体炎症与免疫
反应的重要调节因子 ∀某些肾小球疾病病人血浆中
的 בƒ2Α含量明显高于正常人 o且肾小球内皮细胞损
伤程度与 בƒ水平密切相关≈{  ∀胡枝子可能通过直
接抑制 ≤‘发病过程中的重要介质 Œ2{ oבƒ2Α的分
泌 o从而调整免疫系统 o减轻炎症细胞在肾内的聚集 ∀
也可能通过清除肾内沉积的免疫复合物 o减轻其对肾
小球系膜细胞的刺激 o间接抑制 Œ2{ oבƒ2Α的分泌 o
达到减轻肾脏病理损害的目的 ∀
此外 o本实验干预治疗第 w周后 o胡枝子高剂量
组尿蛋白量与模型组相比差异显著kΠ s1stl o但与
正常组相比差距仍很大 o是否增加治疗时间能够再提
高治疗效果 o使其接近正常组 o还有待进一步考察 o而
胡枝子何种成分发挥作用 o也有待进一步研究 ∀
≈参考文献 
≈t  王 威 o吴立军 o王玉光 o等 q胡枝子属植物化学成分及药理
活性研究进展 q中草药 ousss ovtkul }tww q
≈u  …¨ µ·¤±¬× o °²ªª¬ • q „§µ¬°¼¦¬±2¬±§∏¦¨§ ±¨ ³«µ¬·¬¦¶¼±§µ²°¨ ¬± µ¤·¶}
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≈v  程叙扬 o李晓玫 o唐嘉薇 o等 q微小病变患者尿蛋白对肾小管
上皮细胞的损伤作用及其机制研究 q中华肾脏病杂志 oussu o
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≈w  廖新波 o彭杰青 o熊 密 q氧自由基在肾小球肾炎发病机制中
的意义 q广东医学院学报 ot||y otwkwl }vsz q
≈x  侯凡凡 q细胞因子网络与肾脏疾病 q中华肾脏病杂志 ot||| otx
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≈{  钱耀琴 o陈 难 o储松雯 o等 q血清肿瘤坏死因子水平在原发性
肾小球疾病中的变化 q临床儿科杂志 ot||x otvkwl }uxy q
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¤±§×‘ƒ2Α¬± ¶¨µ∏°o¬±¦µ¨¤¶¨ ≥’⁄¯¨ √¨ ¯¤±§¬°³µ²√¨ §·«¨ ³¤·«²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨ ²©ª¯²°¨ µ∏¯¬qΧονχλυσιον : ¨¶³¨ §¨½¤ ¬¦«¬ º¤¶ ©¨©¨¦·¬√¨ ²± ≤‘q
[ Κεψ ωορδσ] ¨¶³¨ §¨½¤ ¬¦«¬~°¬±¬°¤¯ ¦«¤±ª¨ ±¨ ³«µ²³¤·«¼~ ¬¯³¬§³¨µ²¬¬§ ≈责任编辑 方文贤 
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