全 文 ： [ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ©¨©¨¦·¤±§ ° ¦¨«¤±¬¶° ²©¶¤©©²µ¬±¨¦·¬²± ²± µ¨±¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤rµ¨³¨ µ©∏¶¬²±kr l ¬±∏µ¼ ¬±
µ¤·¶1Μετηοδ : ≥ √¨ ±¨·¼2©¬√¨≥⁄ µ¤·¶º µ¨¨ µ¤±§²° ¼¯ §¬√¬§¨ § ¬±·² ©¬√¨ ªµ²∏³¶kν txo¬± ¤¨¦«lo ±²µ°¤¯ ¦²±·µ²¯ ªµ²∏³¶o r ¦²±·µ²¯
ªµ²∏³¶o ²¯º2§²¶¨ ·µ¨¤·° ±¨·ªµ²∏³¶o °¬§§¯ 2¨§²¶¨ ·µ¨¤·° ±¨·ªµ²∏³¶¤±§«¬ª«2§²¶¨ ·µ¨¤·° ±¨·ªµ²∏³¶q ©·¨µµ¤·π¶r ¬±∏µ¼ °²§¨ ¯º¤¶ ¶¨2
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[ Κεψ ωορδσ] ¦¤µ·«¤°∏¶·¬±¦·²µ¬∏¶¬±¨¦·¬²±~ ¬¶¦«¨ °¬¤rµ¨³¨ µ©∏¶¬²±~ µ¨±¤¯ ©∏±¦·¬²±~ ¤³²³·²¶¬¶~ ¦¤¶³¤¶¨2v
≈责任编辑 古云侠
≈收稿日期 ussx2tt2us
≈通讯作者 3 肖培根 oר¯}kstslyvsttu|w
uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷
对 ³¨u细胞的细胞毒性及其作用机制
田 泽 t o斯建勇 t o陈四保 t o杨梦甦 u o肖培根 t3 o吴二喜 v
kt1中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|w~
u1香港城市大学 深圳研究院 o广东 深圳 xt{sxz~
v1波士顿儿童医院 哈佛医学院 o波士顿 马萨诸塞州 suttxl
≈摘要 目的 }研究自兴安升麻提取的 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对 ³¨u细胞的细胞毒性及其作用
机制 ∀方法 }利用 ××法进行细胞毒活性测定 ~用 r∞
染色法观察细胞个体的凋亡 ~以流式细胞光度术研究细
胞周期的改变并验证凋亡的产生 ~用蛋白印迹技术从分子水平阐明该化合物的细胞毒作用机制 ∀结果 } uv2Ο2乙酰
升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷可以明显抑制 ³¨u细胞生长 o≤xs为 ty Λ°²¯# pt ∀同时该化合物可以使 ³¨u细胞产
生凋亡形态学变化和 u 2 细胞周期阻滞 o并使 ° °蛋白裂解 o¥¦¯2uo
¤¬o¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
等凋亡和细胞周期相
关蛋白表达改变 ∀结论 } uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对 ³¨u细胞具有明显的细胞毒作用 o该化合物可诱导
³¨u细胞凋亡和 u 2 周期阻滞 o其凋亡机制涉及 ¦¤¶³¤¶¨¶家族激活 o¥¦¯2u和
¤¬表达改变 o而 u 2 周期阻滞与
¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
下调直接相关 ∀
≈关键词 兴安升麻 ~uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷 ~凋亡 ~细胞形态 ~细胞周期 ~蛋白表达
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussylut2t{t{2sw
升麻属 Χιµ ιχιφυγα植物隶属毛茛科 ¤±∏±¦∏2
¤¯¦¨¤¨ o包括兴安升麻 Χ1δαηυριχα,西升麻 Χ1φοετιδα,
单穗升麻 Χ1σιµ πλεξ,南川升麻 Χ1νανχηυανενσισ,小
升麻 Χ1αχερινα以及总状升麻 Χ1ραχεµ οσα等主要品
种 ∀兴安升麻是我国特有品种 o其根茎作为常用中
药已载入 5中国药典 6o具有清热解毒 !升举阳气 !发
表透疹的功能 o主治风热头痛 !齿痛 !咽喉肿痛 !子宫
脱垂等症 ~而地上部分通常作为废弃物 ∀早在 us世
纪六七十年代日本学者曾从其中分离到一些环菠萝
蜜烷三萜化合物 ≈t o|s年代以后 o国内学者对兴安
升麻进行大量研究 o发现地上与地下部分化学成分
相似 o环菠萝蜜烷三萜化合物为其中主要特征成
分 ≈uov ∀药理研究表明 o兴安升麻地下部分总苷可
以抑制猴艾滋病毒的复制和丝裂酶素 ≤诱发的人
外周血淋巴细胞姐妹染色体的互换 ≈wox ~并可促进
#{t{t#
第 vt卷第 ut期
ussy年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto ¶¶∏¨ ut
²√ °¨¥¨ µo ussy
人类成骨细胞 k≥ ×∞{xl的增殖 o用于骨质疏松和
更年期综合征的治疗 ≈y ∀兴安升麻地下和地上部
分总苷还具有相似的细胞毒和抗氧化作用 ≈z ∀
为了寻找兴安升麻中细胞毒活性的有效成分 o
作者对分离自其中的一系列化合物进行了活性筛
选 o并对其中细胞毒活性成分 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2
Ο2Β2∆2木糖苷的作用机制进行深入研究 ∀
1 材料与方法
111 药品与试剂 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖
苷提取自兴安升麻 Χ1δαηυριχα地上部分 o纯度大于
|xh o由本所植化室提供 ~原材料经本所潘瑞乐副研
究员鉴定为升麻属植物兴安升麻的地上部分 ∀三尖
杉酯碱 o纯度大于 |sh o购自中国药品生物制品检
定所 o批号 ~培养基 ° tywso胎牛血清均购自
¬¥¦²公司 ~四氮唑溴 o ××≈v2kwox2§¬° ·¨«¼¯·«¬¤½²¯2
u2¼¯ l2uox2§¬³«¨ ±¼¯ ·¨·µ¤½²¯¬∏° ¥µ²°¬§¨ 为 ∞≥≤
公司产品 o由上海生物工程有限公司分装 ~ °k³µ²2
³¬§¬∏° ¬²§¬§¨ lo ±·¬2¦§¦uo ±·¬2¥¦¯ uo±·¬2
¤¬o均
购 自 פ®¤µ¤~ ±·¬2°²¯¼2k ⁄°2 ¬¥²¶¨ l2°²¯¼° µ¨¤¶¨
k° °l和 ±·¬2¦¼¦¯¬±
o分别购自 ²¦«¨和
⁄~牛
血清白蛋白 k
≥lo胰蛋白酶 o二甲基亚砜 k⁄ ≥l
均为 ≥¬ª°¤公司产品 ∀
112 细胞培养 人肝癌细胞株 k ³¨ulo购自美国
×≤≤k° µ¨¬¦¤± ×¼³¨ ≤∏¯·∏µ¨ ≤²¯¯¨¦·¬²±lo用含 tsh
胎牛血清的 ° tyws培养液常规培养 ∀细胞接种
uw «后用于各项试验 ∀
113 细胞毒作用 接种 u ≅ tsw个 r孔 ³¨u细胞
于 |y孔板 ∀常规加药 kt1y ∗ tss Λ°²¯# pt lo对照
组加等容积的 ⁄ ≥ ktsh l∀在 xh ≤u和 vz ε
培养箱中培养 w{ «∀加 ××o终浓度为 xs Λª#
°pt ∀继续孵育 w «后 o在 xzs ±°处测定吸光度
kΑlo计算生长抑制率 ∀ kh l kt p Τ/Χl ≅
tssh ∀并由量效曲线计算半数抑制率 k≤xs l∀
114 细胞形态学观察 接种细胞于 vx °° ≅ ts
°°培养皿中 o分别加入测试药物和阳性药物 o在
xh ≤u和 vz ε 培养箱中作用 tuouw «后取出 o加
wss Λ r∞
k吖啶橙 r溴化乙啶 l溶液 ktss Λª#
°pt 溶液 o tss Λª# °pt ∞
溶液 o用 °
≥配
制 l混匀 o立即在 ws ≅ ts荧光倒置显微镜下观察 ∀
根据坏死细胞和凋亡细胞细胞膜完整性的不同 o应
用 r∞
染色法观察凋亡细胞形态特征 ∀
115 细胞周期分析 药物处理后收集 ³¨u细
胞 o用 °
≥洗 u次后以 zsh 乙醇固定过夜 ∀ t sss µ
# °¬±pt ots °¬±离心去乙醇 o用含 th胎牛血清的
°
≥洗 u次 o再以 u °含 th 胎牛血清的 °
≥重
悬 o加 ¤¶¨酶 k终浓度 s1x °ª# °pt l消化 t «o
然后加 °ku1x Λª# °pt l染色 o冰上放置 us °¬±
后 o上流式细胞仪检测 o每个样本中检测细胞数大于
t ≅ tsw个 ∀
116 • ¶¨·¨µ± ¥¯²· 药物处理后 o用冰冷的 °
≥溶
液洗 u次 o然后以细胞裂解液 kxs °°²¯# pt ×µ¬¶p
≤ o¯ ³ z1wots °°²¯ # pt ∞⁄×o th ×µ¬·²± ÷ 2
tsso uyh ∏µ¨¤o t ·¤¥¯ ·¨rts °蛋白酶抑制剂鸡尾
酒片 l裂解细胞 ∀用灭菌牙签挑走黏稠的 ⁄∀用
µ¤§©²µ§法测定上清中蛋白含量 ∀用 tsh 聚丙烯
酰胺凝胶进行 ≥⁄≥2°∞电泳 o并将分离好的蛋白
转移至硝酸纤维素膜上 ∀然后将硝酸纤维素膜分别
与一抗和连接辣根过氧化物酶的二抗一起孵育 ∀用
∞≤º ¶¨·¨µ± ¥¯²·检测试剂进行检测 o在 ¦«¨ °¬§²¦成
相仪上成相 ∀
2 结果
211 细胞毒性 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷
和阳性药三尖杉酯碱在 t1y ∗ tss Λ°²¯ # pt剂量
范围内能够显著抑制 ³¨u细胞增殖 o且呈剂量依
赖关系 k图 tl∀由图得 ≤xs值分别为 tyo{ Λ°²¯ #
pt o表明 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对
³¨u细胞有较好的细胞毒性作用 ∀
图 t uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷
对 ³¨u细胞的细胞毒性
t1uv2Ο2乙酰升麻醇 2Ο2Β2∆2木糖苷 ~u1三尖杉酯碱
212 诱导细胞凋亡 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木
糖苷和阳性药三尖杉酯碱 o在 us Λ°²¯# 2t作用 tuo
uw «后可使 ³¨u细胞发生典型的凋亡形态学改
变 k图 ul∀细胞皱缩变圆 o染色质凝集 o边缘化 o在
细胞内呈现亮绿色斑点 o或被核膜包裹成为凋亡小
体 ∀这些细胞为早期凋亡细胞 ∀少数细胞被 ∞
染
成橙色 o染色质在细胞内呈橙色斑点 o为晚期凋亡细
胞 ∀极少数细胞显现均匀的橙色 o为坏死细胞 ∀并
#|t{t#
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且凋亡细胞随时间延长而增加 ∀
图 u uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对
³¨u细胞形态学的影响
t1 ³¨u2对照 ~ u1三尖杉酯碱 ous Λ°²¯ # pt otu «~ vow1uv2Ο2乙酰
升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷 ous Λ°²¯# pt otuouw «
213 细胞周期阻滞 应用 °染色流式细胞光度法
观察 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对 ³¨u细
胞周期的影响 ∀该化合物在 us Λ°²¯# pt o作用 yo
tuouw «时可使 ³¨u细胞阻滞在 u 2期 o并伴随
s 2t期细胞数下降 o≥期细胞数增多 ∀随时间延
长 ou 2期细胞逐渐增多 o到 uw «时 o出现少量凋
亡细胞 ∀
214 细胞凋亡及周期相关蛋白表达的改变 用 us
Λ°²¯# pt uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷处理
³¨u细胞 o进行 • ¶¨·¨µ± ¥¯²·试验 ∀该化合物自
tu «起即可使 ° °裂解 o随时间延长 o裂解作用更
加明显 k图 vl∀这一结果进一步证明该化合物可以
诱导 ³¨u细胞产生凋亡 o而且这一凋亡过程与
¦¤¶³¤¶¨¶家族激活有关 ∀该化合物作用于 ³¨u细
胞 yotuouwow{ «o还可使抗凋亡蛋白 ¥¦¯2u表达显著
下调 o凋亡蛋白
¤¬表达明显增加 k图 wl∀
图 v uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷对
³¨u细胞中 ° °蛋白裂解的影响
t1 ³¨u对照 ~ u ∗ w1uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷 ous
Λ°²¯# pt otuouw和 w{ «
同时 o用该化合物处理细胞 y «后 o¦§¦u表达
开始下降 o直至 w{ «下调作用一直维持 ~而 ¦¼¦¯¬±
在 yotu «时没有明显的表达改变 o至 uw «时才开始
图 w uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷调节
³¨u细胞中 ¥¦¯2u和
¤¬蛋白的表达
t1 ³¨u对照 ~ u ∗ x1uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷 ous
Λ°²¯# pt otuouw和 w{ «
下调 o至 w{ «时 o表达几乎被完全抑制 k图 xl∀这
可能是由于该化合物首先使 ¦§¦u表达下调 o随后
¦¼¦¯¬±
表达也随之下降 o而 ¦§¦ur¦¼¦¯¬±
复合物
的整体下调 o是最终导致 ³¨u细胞发生 u 2 周
期阻滞的主要原因之一 ∀
图 x uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷抑制
³¨u细胞中 ¦§¦2u和 ¦¼¦¯¬±
蛋白表达
t1 ³¨u对照 ~ u ∗ x1uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷 ous
Λ°²¯# pt otuouw和 w{ «
3 讨论
本研究对一系列提取自兴安升麻总苷的化合物
进行细胞毒活性筛选 o发现 uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2
Β2∆2木糖苷可以明显地抑制 ³¨u细胞的生长 o因
此进而对其作用机制进行了深入研究 ∀ r∞
染
色细胞形态学观察发现 ouv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2
木糖苷可诱发 ³¨u细胞产生典型的凋亡形态学
改变 o并可使 ° °蛋白裂解 ∀因此这一结果表明 o
该化合物可以诱导 ³¨u细胞凋亡 o并且凋亡的产
生与 ¦¤¶³¤¶¨¶家族的激活有关 ∀ ¥¦¯2u家族也与凋
亡密切相关 o既包含凋亡诱导基因又包含凋亡抑制
基因 o家族成员组成均相和杂合二聚体 o从而调节凋
亡反应 ∀这些蛋白的一个主要功能就是介导和防御
线粒体膜翻转 ∀其中 ¥¦¯2u可以抑制凋亡的产生 o而
¤¬可以诱导凋亡的产生 ≈{o| ∀ uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2
Ο2Β2∆2木糖苷可以下调 ¥¦¯2u的表达 o上调
¤¬的表
达 o提示调节 ¥¦¯2u家族蛋白表达也是该化合物诱导
凋亡的机制之一 ∀
许多细胞毒制剂通过影响细胞周期来发挥抗肿
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瘤作用 ∀细胞周期是由细胞周期依赖的激酶 k¦§®l
和细胞周期素按一定顺序严格控制的 ∀其中 ¦§¦2ur
¦¼¦¯¬±
复合物是 u到 期关卡的主要调节元
件 ≈ts ∀ uv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷可以使
³¨u细胞阻滞在 u 2 期 o并且使 ¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
表达明显下调 o这一结果表明下调 ¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
的表达是该化合物诱导 u 2阻滞的机制之一 ∀
综上所述 ouv2Ο2乙酰升麻醇 2v2Ο2Β2∆2木糖苷通
过诱导细胞凋亡和周期阻滞来发挥其细胞毒作用 o
而其诱导的凋亡和周期阻滞与 ¦¤¶³¤¶¨¶家族的激
活 o¥¦¯2u家族表达的改变以及 ¦§¦u和 ¦¼¦¯¬±
的
下调直接相关 ∀
≈参考文献
≈t ²¥∏®² ≥o פ®¤² o ¤¶¤«¬µ² q ≥·∏§¬¨¶²± ·«¨ ≤«¬± ¶¨¨ ¦µ∏§¨
§µ∏ª / ¶«²°¤0 q· q≥·µ∏¦·∏µ¨ ²© ¤¦¨·¼¯ ¶«¨ ±ª°¤±²¯ ¬¼¯ ²¶¬§¨ o ¤
³µ²¥¤¥¯¨ ³µ¨¦∏µ¶²µ²© ¶²°¨ ®±²º± ≤¬°¬¦¬©∏ª¤ ª¯¼¦²¶¬§¨ ¶≈ q
≤«¨ ° °«¤µ°
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学学报 ot||wou|kyl}ww|1
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¤¨ µ¬¤¯ ³¤µ·¶²©Χιµ ιχιφυγα δαηυριχα≈ q¤·°µ²§o ussuo yx}
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用及其机制 ≈ q华西药学杂志 o t||wo|kwl}uut1
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生物活性比较 ≈ q中药材 o ussxou{kxl} vuz1
≈{ ײ±ª÷ o ¬± ≥o ƒ∏¬¬ o ·¨¤¯q ²¯ ¦¨∏¯¤µ° ¦¨«¤±¬¶°¶²© ¦¨«¬±²2
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³«¼¶ ¶¨≤²°°∏±o usswovutkvl} xv|1
≈| • µ¬ª«·o °µ¨¯¨ ≤ o ≥∏±·¨µ¶o ·¨¤¯q¥¨ µµ¤±·³xv ¤¯ µ¨·¶
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²©≤⁄ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§ ¤¦·¬√¬·¼ ≈ q±· ≤¤±¦¨µo usswottu
kxl} zys1
≈ts ∏µ¶¨ °q ±¬√ µ¨¶¤¯ ¦²±·µ²¯ ° ¦¨«¤±¬¶° µ¨ª∏¯¤·¬±ª ²±¶¨·²© 2
³«¤¶¨ ≈ q¤·∏µ¨o t||so vwwkyuyyl} xsv1
Χψτοτοξιχιτψ ανδ µ εχηανισµ οφ
uv2Ο2αχετψλχιµ ιγενολ2v2Ο2Β2∆ 2ξψλοπψρανοσιδε ον ΗεπΓ u χελλσ
× t¨ou o ≥¬¤±2¼²±ªt o ≤∞≥¬2¥¤²t o ≠ ±¨ª2¶∏u o ÷ ° ¬¨2ª¨ ±t o • ∞µ2¬¬v
(t1 Ινστιτυτε οφΜεδιχιναλΠλαντ ∆εϖελοπµ εντ, Χηινεσε Αχαδεµ ψ οφΜεδιχαλΣχιενχεσ ανδ Πεκινγ Υνιον
ΜεδιχαλΧολλεγε, Βειϕινγ tsss|w, Χηινα;
u1Αππλιεδ Ρεσεαρχη Χεντρε φορΓενοµ ιχ Τεχηνολογψ, Χιτψ Υνιϖερσιτψ οφ Ηονγ Κονγ , Σηενζηεν xt{sxz, Χηινα;
v1ΧηιλδρενπσΗοσπιταλΙνφορµ ατιχσΠρογραµ , Ηαρϖαρδ2ΜΙΤ ∆ιϖισιον οφ Ηεαλτη Σχιενχεσ ανδ Τεχηνολογψ, Χηιλδρενπσ
ΗοσπιταλΒοστον, Ηαρϖαρδ ΜεδιχαλΣχηοολ, Βοστον Μασσsuttx, ΥΣΑ)
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©µ²° Χ1δαηυριχα ²± ³¨u ¦¨ ¯¯¶¤±§·²©¬±§·«¨ ¯¨ ¤§¬±ª¦²°³²∏±§©²µ± º¨ §µ∏ª§¨ √¨¯²³° ±¨·1 Μετηοδ : ××o r∞
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√¤·¬²±o ©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼ ¤±§º ¶¨·¨µ± ¥¯²·° ·¨«²§¶º µ¨¨ ∏¶¨§·²¶·∏§¼ ·«¨ ¦¼·²·²¬¬¦¬·¼o °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨ ¶o ¦¨¯¯ ¦¼¦¯¨§¬¶·µ¬¥∏·¬²± ¤±§
³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³µ²©¬¯¨ ²©uv2Ο2¤¦¨·¼¯¦¬°¬ª¨ ±²¯ 2v2Ο2Β2∆2¬¼¯ ²³¼µ¤±²¶¬§¨ ²± ³¨u ¦¨ ¯¯¶1 Ρ εσυλτ: uv2Ο2¤¦¨·¼¯¦¬°¬ª¨ ±²¯2v2Ο2Β2∆2¬¼2
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¦¼¦¯¨¤µµ¨¶·1 ƒ∏µ·«¨ µ¶·∏§¼ §¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤··«¨ ¦²°³²∏±§¦²∏¯§¦¯ ¤¨√¤ª¨ ° °o µ¨ª∏¯¤·¨ ³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©¥¦¯2u ©¤°¬¯¼ ¤±§ §¨ 2
¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©¦§¦u ¤±§ ¦¼¦¯¬±
1 Χονχλυσιον: uv2Ο2¤¦¨·¼¯¦¬°¬ª¨ ±²¯2v2Ο2Β2∆2¬¼¯ ²³¼µ¤±²¶¬§¨ ¬¨¨ µ·¶¬·¶¦¼·²·²¬¬¦¬·¼ ²±
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§²º± µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©¦§¦u ¤±§¦¼¦¯¬±
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[ Κεψ ωορδσ] uv2Ο2¤¦¨·¼¯¦¬°¬ª¨ ±²¯ 2v2Ο2Β2∆2¬¼¯ ²³¼µ¤±²¶¬§¨ ~ ¤³²³·²¶¬¶~ ¦¨¯¯ °²µ³«²µ¯²ª¼~ ¦¨ ¯¯ ¦¼¦¯ ~¨ ³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²±1
≈责任编辑 古云侠
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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