全 文 :益肾软坚散含药血清拮抗马兜铃酸对人
近端肾小管上皮细胞的作用
方 静 o谌贻璞 3 o杨彦芳 o张
k中日友好医院 肾病中心 o北京 tsssu|l
≈摘要 目的 }研究益肾软坚散含药血清能否拮抗马兜铃酸k¤µ¬¶·²¯²¦«¬¦¤¦¬§ol诱发的人近端肾小管上皮细
胞株k≤l促纤维化效应 ∀方法 }用马兜铃酸钠盐k2¤ows °ª#ptl加或不加 ts h大鼠含药血清与 ≤ 细胞孵
育 o而后检测信使 k° l和蛋白质表达 ∀结果 }大鼠含药血清能显著下调 2¤刺激后 ≤ 细胞对转化生长
因子2Βtk׃2Βtl !结缔组织生长因子k≤׃l和金属蛋白酶组织抑制物2tk×°2tl° 及蛋白质的高表达k Π
s1sxl o但对纤溶酶原激活物抑制物2tk°2tl° 及蛋白质高表达无显著作用k Π s1sxl ∀结论 }益肾软坚散含药
血清可下调 刺激的 ≤细胞促细胞外基质k∞≤ l合成因子及抗 ∞≤ 降解因子的表达 ∀
≈关键词 马兜铃酸 ~肾小管上皮细胞 ~细胞培养
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussxls|2szsw2sx
≈收稿日期 ussw2sz2ts
≈基金项目 国家自然科学基金资助项目kvstzswu|l ~国家中
医药管理局科研基金资助项目 kusss22°2yw 及国中医药科
usst⁄÷swl
≈通讯作者 3 谌贻璞 oר¯ }kstslywuuttuu2uuyy o∞2°¤¬¯}≤«¨ ±
¼¬³∏ ° §¨°¤¬¯q¦²° q¦±
含马兜铃酸k¤µ¬¶·²¯²¦«¬¦¤¦¬§ol成分的中草药
能够导致马兜铃酸肾病k¤µ¬¶·²¯²¦«¬¦¤¦¬§±¨ ³«µ²³¤·«¼o
l现已被确认 o并日益受到重视 ∀但是 o至今
的发病机制不十分清楚 o也无良好治疗方法 ∀
结合我科体内外试验≈t2v 及郑法雷等≈w 研究 o笔者推
测肾小管上皮细胞在 的发生和发展中起重要
作用 ∀故本实验拟用中药复方益肾软坚散含药血清
进行体外细胞生物学实验 o以观察该药能否干预
对肾小管上皮细胞的效应 ∀
1 材料和方法
111 试剂
正常人近端肾小管上皮细胞 ≤ 株k美国 ²«±
²³®¬±¶大学 o协和医院郑法雷教授惠赠l ∀小鼠抗
人角蛋白k≤l单克隆抗体 !小鼠抗人 Α2平滑肌肌动
蛋白kΑ2≥l单克隆抗体 !生物素标记山羊抗小鼠
ª !辣根过氧化物酶标记链霉卵白素k≥2r °l
k北京中山生物技术公司l ∀其他试剂均与参考文献
≈x 相同 ∀
112 动物
雄性 ≥⁄大鼠k北京维通利华实验动物公司l o
合格证号 ≥≤÷k京lussu2sssv o体重 uzs ∗ u|s ª∀
113 药物
取丹参 !炙鳖甲 !生黄芪 !全当归 !虫草菌丝等 {
味中药k由本院中药房李维英主管药师鉴定 o均为正
品l o由本院中药房按传统方法制备水煎剂 o并浓缩
至浸膏 op us ε 保存 ∀临用前用蒸馏水稀释至生药
含量为 u ª#°pt ∀
114 方法
11411 大鼠含药血清的制备 大鼠禁食不禁水 ty
«o以益肾软坚散水煎剂灌胃k每次灌胃量为 tt °#
®ªpt体重l o分别于单次灌胃后及 u次灌胃k间隔 u
«l后 s1x ot ot1x «从大鼠内眦静脉采血k每个时间点
y只大鼠l o离心后留取血清 o将 y只大鼠血清混合 o
过滤除菌 oxy ε 灭活 vs °¬±o此为实验用含药血清 ∀
同法取大鼠正常血清 ∀高效液相色谱法k°≤l测
定各个时间点的大鼠血清丹参素含量≈y ∀按实验要
求分别 p vs ε 和 p {s ε 保存 ∀
11412 细胞增殖及细胞毒性检测 分别用 2¤ktso
usowso{s °ª#ptl或k和l大鼠血清kxh otsh oush l孵
育 ≤细胞 w{ «o用 ××比色法检测细胞增殖≈t o用
乳酸脱氢酶k⁄l释放实验检测细胞毒性≈t ∀
11413 细胞 ° 和蛋白质表达的检测 实验分
组如下 }≠不加 2¤及大鼠血清k对照组l ~ 2
¤ws °ª#ptk2¤组l ~≈ ts h大鼠正常血清k大
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鼠血清组l ~…ts h大鼠正常血清加 2¤ws °ª#
ptk大鼠血清 n 2¤组l ~ ts h大鼠含药血清加
2¤ws °ª#pt组k含药血清 n 2¤组l ∀上述
2¤或k和l大鼠血清与 ≤ 孵育 tu «后检测各
指标的 ° 表达 o孵育 vy «后检测其蛋白质表
达 ∀
1141311 细胞 ° 表达的检测 用 ×2°≤ 方
法 o与参考文献≈x 相同 ∀
1141312 细胞培养液中转化生长因子2Βtk׃2
Βtl o纤溶酶原激活物抑制物2tk°2tl o金属蛋白酶
组织抑制物2tk×°2tl含量及细胞层 ´型胶原k≤²¯
´l含量的检测用 ∞≥方法 o与参考文献≈x 相同 ∀
1141313 细胞层结缔组织生长因子k≤׃l含量的
检测 用 • ¶¨·¨µ± ¥¯²·方法 o与参考文献≈x 相同 ∀
11414 细胞抗原表达的检测 取 ≤ 细胞以 t ≅
tsxr孔浓度接种于含玻片的 y孔培养板 o设 v孔重
复 o待细胞贴壁后换用无血清 ° tyws培养液静
止 uw «o加入含 2¤ws °ª#pt的培养液 o刺激 vy
«后终止实验 o取出爬有细胞的盖玻片 o进行免疫细
胞化学染色 }w ε 丙酮固定 ts °¬±o正常山羊血清室
温封闭 ts °¬±o加小鼠抗人 ≤或小鼠抗人Α2≥ 单
克隆抗体ktΒxsl ovz ε 孵育 ys °¬±o加生物素标记山
羊抗小鼠 ª ovz ε 孵育 us °¬±o加 ≥2r ° ovz ε
孵育 us °¬±o加 ⁄
2u u显色 o显微镜下观察并拍
照 ∀
115 统计学处理
计量资料数据以 cξ ? σ表示 o组间差异比较采
用单因素方差分析 o由 ≥°≥≥ ts1s统计软件完成 ∀
2 结果
211 大鼠含药血清丹参素含量测定
°≤结果显示丹参素标准品和大鼠含药血清
均于 z °¬±左右出现单峰k丹参素l o而大鼠正常血
清未检测到此峰k图 tl ∀经 °≤测定 u次给药后 t
«大鼠含药血清丹参素含量最高kx1xw °ª#pt oν
yl o故以下实验大鼠含药血清采血时间定为 u次给
药后 t «∀将大鼠含药血清分别 p vs ε 保存 t月和
p {s ε 保存 y月 o再进行 °≤ 测定发现丹参素含
量从 x1xw °ª#pt分别下降至 t1|{ ox1uv °ª#pt o故
以下实验选 p {s ε 保存的大鼠含药血清 ∀
212 大鼠血清及 2¤对 ≤ 细胞增殖和毒性
作用的检测
⁄释放实验结果显示 o当大鼠含药血清含量在
x h和 ts h 时对 ≤ 细胞无明显毒性作用k Π
s1sxl o而 us h含量时大鼠含药血清对 ≤ 有杀伤作
用kΠ s1sxl o故以下实验大鼠含药血清所选含量为
ts h ~2¤在 ts ous ows °ª#pt时对 ≤ 无明显毒
性作用kΠ s1sxl o而 {s °ª#pt时 2¤对 ≤ 有
杀伤kΠ s1sxl o故以下刺激实验 2¤所选含量为
ws °ª#pt ∀为此 o笔者又对 ts h大鼠含药血清加
2¤ws °ª#pt再次进行了细胞毒性检测 o⁄ 释
放率与对照组比较仍无显著性差异k Π s1sxlk表
tl∀以上结果说明 o本实验含量的 2¤和大鼠含药
血清共同孵育对 ≤无细胞毒性作用 ∀
图 t °≤测量丹参素含量
q丹参素标品 ~
q大鼠正常血清 ~≤ q大鼠含药血清
表 t 不同含量益肾软坚散含药血清和 2¤对
≤ 细胞毒性效应kcξ ? σoν yl
组别 ⁄释放率r h
对照组 | qz{ ? s qts
x h大鼠含药血清 { qx| ? t qvu
ts h大鼠含药血清 z q|z ? u qwz
us h大鼠含药血清 ws qv{ ? { qz{tl
2¤ts °ª#pt | qxw ? s qvx
2¤us °ª#pt tv qus ? t qzz
2¤ws °ª#pt ts qv| ? t qys
2¤{s °ª#pt ww qw{ ? z q{vtl
ts h大鼠含药血清加 2¤ws °ª#pt | qwx ? t qxv
注 }与对照组比较tl Π s1sx
××比色法结果显示 o当大鼠正常血清和含药
血清含量为 x h ots h及 us h时 o吸光度值k Αl与对
照组比较均显著性增加k Π s1sxlk表 ul o说明上述
含量的大鼠正常血清和含药血清均能刺激 ≤ 细
胞增殖 ∀但是 o在相同含量下 o大鼠正常血清与含药
血清的 Α比较并无显著差异k Π s1sxlk表 ul o说明
含量相同时两者对 ≤细胞增殖的作用一致 ∀
213 2¤对 ≤ 表达 ׃2Βt o≤׃ o°2t o
×°2t和 ≤²¯ ´的作用
分别将实验分组的对照组与 2¤组比较 o大
鼠血清组与大鼠血清 n 2¤组比较 o发现在普通
培养k对照组与 2¤组l和 ts h大鼠正常血清培
#xsz#
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表 u 不同含量大鼠正常血清和益肾软坚散含药血清对
≤ 细胞的增殖作用kcξ ? σ, ν yl
组别 Α正常血清 含药血清
对照组 s qtzv ? s qssx s qtzv ? s qssx
x h浓度 s quxs ? s qst{tl s quz{ ? s qsust oul
ts h浓度 s qvy{ ? s qst{tl s qvxz ? s qsuvt oul
us h浓度 s qvuu ? s qstytl s qvvx ? s qsu|t oul
注 }与对照组比较tl Π s1sx ~与同含量的正常血清比较ul Π
s1sx
养k大鼠血清组与大鼠血清 n 2¤组l时 o加入
2¤ws °ª#pt均能显著上调 ≤ 对 ׃2Βt o≤×2
ƒ o°2t 和 ×°2t ° 和蛋白质的表达k Π
s1sxlk表 v ow o图 u ovl ∀但在该实验条件下 o未检测
出 ≤细胞 ≤²¯ ´ ° 和蛋白质的表达 ∀
214 大鼠含药血清对 2¤刺激的 ≤ 表达
׃2Βt o≤׃ o°2t和 ×°2t的作用
将大鼠血清 n 2¤组与含药血清 n 2¤组
比较 o发现 ts h大鼠含药血清显著下调了 2¤ws
°ª#pt导致的 ≤ 对 ׃2Βt o≤׃及 ×°2t °2
和蛋白质的高表达k Π s1sxl o而对 2¤ws °ª
#pt所致 °2t ° 和蛋白质的高表达无作用
k Π s1sxlk表 v ow o图 u ovl ∀
表 v 益肾软坚散含药血清对 2¤刺激 ≤ 基因表达的影响kcξ ? σ, ν vl
组别 ׃2Βt ≤׃ °p t ×° p t
对照组 s qwtz ? s qszu s qxs{ ? s qs{x s qzvx ? s qsyz s qztz ? s qs|t
2¤组 s qx|{ ? s qsystl s qzvt ? s qtwytl s q|vz ? s qs{|tl s q{{{ ? s qswttl
大鼠血清组 s qwvz ? s qszyul s qxtx ? s qszwul s qzvz ? s qtsyul s qy{s ? s qsztul
大鼠血清 n 2¤组 s qx{u ? s qtsw s q{ts ? s qtvv s q|v| ? s qs|x s q{s{ ? s qs{s
含药血清 n 2¤组 s qwuw ? s qszxul s qwx{ ? s qtstul s q|s| ? s qttt s qxut ? s qsxzul
注 }表内数值为目的基因相对表达量 ~与对照组比较tl Π s1sx ~与大鼠血清 n 2¤组比较ul Π s1sx
表 w 益肾软坚散含药血清对 2¤刺激 ≤ 合成蛋白质的作用kcξ ? σ, ν y)
分组 ׃2Βtr³ª#°pt °p tr±ª#°pt ×° p tr±ª#°pt
对照组 zv qss ? tz q{v yu qzs ? { qu| tz qt| ? t q{y
2¤组 tuy q|s ? t{ qyutl {| q{z ? tu qsttl u{ qtt ? v qvwtl
大鼠血清组 uuy qvz ? v| qtxul zz qtt ? tv qsxul t{ q{z ? u qysul
大鼠血清 n 2¤组 vu| qsu ? xx qsz tsx qut ? tw qws u| qwx ? w qy|
含药血清 n 2¤组 uxw qyw ? wu qzzul tsz qus ? z qz| uv qvz ? v quzul
注 }与对照组比较tl Π s1sx ~与大鼠血清 n 2¤组比较ul Π s1sx
图 u ×2°≤ 检测益肾软坚散含药血清对 2¤刺激
≤ ° 表达的作用k ν vl
s1 阴性对照 ~1°¤µ®¨µ~t1对照组 ~u12¤组 ~v1大鼠血清组 ~
w1大鼠血清 n 2¤组 ~x1 含药血清 n 2¤组
215 2¤对 ≤细胞转分化的影响
ws °ª#pt 2¤刺激 ≤ 细胞 vy «后 o留取
≤细胞进行免疫细胞化学染色 o结果显示 2¤
刺激组与对照组的 ≤ 细胞均表达 ≤o而不表达
Α2≥ o提示在此实验条件下 ≤细胞并未
图 v • ¶¨·¨µ± ¥¯²·检测益肾软坚散含药血清对
2¤刺激 ≤ 合成 ≤׃的作用k ν vl
¦1 阳性对照 ~t1 对照组 ~u12¤组 ~v1 大鼠血清组 ~
w1 大鼠血清 n 2¤组 ~x1 含药血清 n 2¤组 ∀与 t组比较 o
3 Π s1sx ~与 w组比较 o∃Π s1sx
向肌成纤维细胞转分化 ∀
3 讨论
慢性 临床以进行性肾衰竭 !病理以寡细胞
性肾间质纤维化为主要特点 o至今无成熟治疗方
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案≈z ∀祖国医药学在抗纤维化治疗上有着广阔前
景 o为研究中药复方煎剂的药效及药理 o现常采用含
药血清进行体外细胞生物学实验≈x o{ ∀本研究自拟
了具有/健脾益肾 !活血软坚0功能的益肾软坚散处
方 o制备含药血清 o通过体外细胞培养实验来初步探
讨它是否能拮抗 的致纤维化效应 ∀
在利用含药血清进行实验时 o采集到药含量较
高的血清至关重要 o本处方内丹参是君药 o因此笔者
对血清中丹参素进行了检测 o根据 °≤ 检测结果 o
最后确定在两次给药后 t «留取血液≈x ∀
本科既往研究和本研究均发现 ows °ª#pt 2
¤未能刺激 ≤表达 ≤²¯ ´ ° 及蛋白质≈t ∀进
一步用免疫细胞化学染色检查证实 ws °ª#pt 2
¤未能使 ≤ 转分化为肌成纤维细胞 ∀而肾小管
上皮细胞在未转分化为肌成纤维细胞时并不分泌
≤²¯ ´ ≈t o| o故本实验结果与此相符 ∀
本研究发现 ws °ª#pt2¤可刺激体外培养
的 ≤ 上调 ׃2Βt o≤׃ o°2t 和 ×°2t °
和蛋白质高表达 ∀ 刺激 ≤ 高表达上述因子对
肾间质纤维化有何意义呢 o已知 ׃2Βt和 ≤׃是
致纤维化因子≈ts ott ~而 °2t和 ×°2t能抑制细胞
外基质k∞≤l降解≈tu otv ∀笔者≈tw 曾利用细胞共培
养技术进行实验 o发现 2¤能刺激 ≤ 活化 o而
后释放 ׃2Βt o进而作用于肾间质成纤维细胞 o促
其合成 ≤²¯ ´ ∀²«±¶²±等≈tx 也有类似发现 ∀故推测
能活化肾小管上皮细胞 o分泌上述促 ∞≤ 合成
因子k׃2Βt o≤׃l和抗 ∞≤ 降解因子k×°2t o
°2tl o而后以旁分泌作用于肾间质成纤维细胞 o增
加后者对 ≤²¯ ´等 ∞≤ 的合成 o促进肾间质纤维化 ∀
本实验结果显示益肾软坚散含药血清确能下调
2¤作用 ≤ 导致的 ׃2Βt o≤׃和 ×°2t高
表达 o但对 °2t无作用 ∀经 ⁄释放实验证实 o上
述因子的下调并非 ≤受损所致 o而是益肾软坚散
含药血清拮抗 作用的结果 ∀同时 o×× 比色显
示在相同浓度下 o正常血清和含药血清对 ≤ 的细
胞增殖作用一致 o故两组间上述因子表达的差异也
并非大鼠血清刺激细胞增殖程度不同导致 ∀
在评价本实验结果时 o必须注意研究方法的局
限性 ∀首先 o血清中成分复杂 o虽然本研究设立了相
同浓度的大鼠正常血清作对照 o但也不能完全排除
干扰 ∀其次 o在体内 活化肾小管上皮细胞后 o分
泌的上述调节 ∞≤ 合成及降解因子是如何经旁分
泌途径作用于肾间质成纤维细胞的 o也需进一步研
究 ∀因此 o此体外细胞实验的结果 o还必须再经体内
实验验证及充实 ∀
≈致谢 北京大学肾病研究所黄海长副研究员及本院
临床研究所赵世萍研究员 ∀
≈参考文献
≈t 唐功耀 o田雪飞 o谌贻璞 q马兜铃酸对人肾细胞作用的实验
研究 q中华肾脏病杂志 oussu ot{ktl }uyy q
≈u 高艳丽 o谌贻璞 o董鸿瑞 o等 q慢性马兜铃酸肾病肾间质纤维
化的实验研究 q中华肾脏病杂志 oussx outktl }vt q
≈v 陈 文 o谌贻璞 o张 晶 o等 q慢性马兜铃酸肾病患者肾小管
上皮细胞转分化的研究 q中华肾脏病杂志 oussv ot|ktl }y q
≈w 文晓彦 o郑法雷 o高瑞通 o等 q马兜铃酸 ´诱导人肾小管上皮
细胞转分化的作用及机制 q肾脏病与透析肾移植杂志 ousss o
|kvl }usy q
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铃酸对人肾间质成纤维细胞的作用 q中国中西医结合杂志 o
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原儿茶醛 q药学学报 ot||| ovwk{l }ytv q
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现 q中华医学杂志 ousst o{tkt{l }ttst q
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床药理 ot||| o|ktl }u|s q
≈| 郭 华 o邹万忠 q实验性肾小管间质纤维化中肾小管上皮细
胞表型转化的研究 q中华病理学杂志 oussv ovukwl }vyw q
≈ts ⁄²∏·«º¤¬·¨ o²«±¶²± × ≥ o ¤¼¯²µo ετ αλ. ∞©©¨¦·¶²©·µ¤±¶2
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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Τηε µεδιχιναλσερυµ οφ Ψι2σηεν Ρυαν2ϕιαν σαν ανταγονιζεδ τηε εφφεχτ οφ
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¬¨³µ¨¶¶¬²±²© ¦¼·²®¨µ¤·¬± ¤±§Α2¶°²²·« °∏¶¦¯¨ ¤¦·¬± ²± ≤ º¤¶ §¨·¨¦·¨§ ¥¼ ¬°°∏±²¦¼·²¦«¨ °¬¶·µ¼o·«¨ ° ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©·µ¤±¶©²µ°¬±ª
ªµ²º·«©¤¦·²µ2Βt k׃2Βtl o¦²±±¨ ¦·¬√¨·¬¶¶∏¨ ªµ²º·«©¤¦·²µk≤׃l o³¯¤¶°¬±²ª¨ ± ¤¦·¬√¤·²µ¬±«¬¥¬·²µ2t k°2tl o·¬¶¶∏¨ ¬±«¬¥¬·²µ²©° ·¨¤¯ ²¯³µ²2
·¨¬±¤¶¨2t k×°2tl ¤±§·¼³¨ ´ ≤²¯ ¤¯ª¨ ± k≤²¯ ´l ²© ≤ º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ ×2°≤ o¤±§·«¨¬µ³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²± º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ ∞≥ ²µ
• ¶¨·¨µ± ¥¯²·q Ρεσυλτ : ²¦¼·²·²¬¬¦ ©¨©¨¦·º¤¶©²∏±§¬± ≤ ¤©·¨µ¶·¬°∏¯¤·¬²± ²© 2¤º¬·«²µº¬·«²∏··«¨ ° §¨¬¦¬±¤¯ ¶¨µ∏° ²© ≠¬2¶«¨ ± ∏¤±2
¬¤± ¶¤± k Π s qsxl q² ³¨¬·«¨ ¬¯¤¯2°¼²©¬¥µ²¥¯¤¶··µ¤±¶§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± º¤¶©²∏±§¬± ≤ ¤©·¨µ2¤¶·¬°∏¯¤·¬²±q׫¨ ° ¤±§³µ²·¨¬± ¬¨2
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≈责任编辑 古云侠
≈收稿日期 ussw2sz2s{
≈基金项目 武警部队科研基金资助课题kusss2xwl
≈通讯作者 3朱江 oר¯ }ksuulysxz{uxv o∞2°¤¬¯}·∏²©∏yy ¶¬±¤1¦²°
京尼平苷对类风湿性关节炎大鼠血清 2tΒ
和 ׃2Α的影响
朱 江 3 o高 欣 o谢文利 o晋玉章 o孙文军
k武警医学院 o天津 vsstyul
≈摘要 目的 }研究京尼平苷对类风湿性关节炎大鼠血清 2tΒ和 ׃2Α的影响 o进一步探讨该药物的作用机
制 ∀方法 }建立 µ型胶原蛋白诱导大鼠类风湿性关节炎模型 ∀观察京尼平苷对实验性大鼠足肿胀的抑制作用 ~检
测血清 2tΒ和 ׃2Α的水平 ∀结果 }与模型组比较 o京尼平苷可以延缓对侧肢体足肿胀发生的时间 o抑制大鼠足肿
胀的程度k Π s1stl ~用药后 o中 !高剂量给药组血清 2tΒ和 ׃2Α水平明显低于模型组k Π s1stl ∀结论 }京尼平
苷在类风湿性关节炎大鼠中可以下调致炎因子 2tΒ和 ׃2Α的水平 o提示这可能与该药抑制实验性类风湿性关
节炎病情进展密切相关 ∀
≈关键词 京尼平苷 ~类风湿性关节炎 ~白细胞介素2t ~肿瘤坏死因子
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第 vs卷第 |期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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