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Effects of Ampelopsin on Invasion and Metastasis of B16 Mouse Melanoma in vivo and in vitro

蛇葡萄素体内外对小鼠B16黑色素瘤侵袭和转移的抑制作用



全 文 :Εφφεχτσ οφ Τοταλ Αλκαλοιδσ οφ
Τριπτερψγιυµ Ηψπογλαυχυµ Ηυτχη ον τκ Γενε οφ Μουσε Λψµ πηοµ α Χελλσ
Œ˜ ≥«¨ ±ª2¬∏¨ t o ≤ „ ’ ¬¤t o ≠ ˜„‘¬¤±t o ‹ ˜„‘Š °¬±ªt o≥‹ ˜„Œ ° ¬¨2 ¬´¤±ªu o ‹ ’‘ „ ¤¶¤°¬·¶∏v
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ©¨©¨ ¦·¶²©·²·¤¯ ¤¯®¤¯²¬§¶²©·µ¬³·¨µ¼ª¬∏° «¼³²ª¯¤∏¦∏° «∏·¦«k× ‹ ‹l ²±·«¨ ·® ª¨ ±¨ ²©
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[ Κεψ ωορδσ] × ‹ ‹ ~·® ª¨ ±¨ ~ °∏·¤ª¨ ±¨ ¶¬¶~xtz{≠ ¦¨¯¯ ≈责任编辑 方文贤 
蛇葡萄素体内外对小鼠 …ty黑色素瘤
侵袭和转移的抑制作用
刘德育 o郑宏强 o罗高琴
k中山大学 中山医学院 化学教研室 o广东 广州 xtss{|l
≈摘要  目的 }研究蛇葡萄素对 …ty小鼠黑色素瘤体内外抗侵袭和转移的作用 ∀方法 }…ty细胞由尾静脉注
入 ≤xz…ry小鼠体内建立实验性肺转移模型 o蛇葡萄素以 v个剂量从接种瘤细胞前一天腹腔给药 o连续 t{ §o于停
药后第 u天观察肺转移瘤灶数 ∀ …ty细胞经蛇葡萄素处理 v §o用具有聚碳酸酯和重建基底膜k ¤·µ¬ª¨ l¯的 ×µ¤±2
¶º¨¯¯小室侵袭模型 o研究药物处理后细胞侵袭 !趋化运动 !粘附能力的改变 ∀结果 }剂量为 txs ouss ouxs °ª#®ªp t
的蛇葡萄素可抑制小鼠肺转移瘤灶形成 o与溶剂对照组比 o抑制率分别为 vs q|z h ows qx{ h oyt qty h k Π s qsxl
∀经 us ows o{s Λ°²¯#p t各浓度蛇葡萄素处理后 o对 …ty细胞侵袭人工基底膜的抑制率分别为 vy qsy h ox| q
x{ h oz| qs| h k Π s qstl ~对细胞的趋化运动抑制率分别为 xt qx| h oxy qxt h oyy qzx h k Π s qstl ~显著降低 …ty
细胞与基质成分层粘连蛋白 !纤维粘连蛋白及 ¤·µ¬ª¨¯的粘附作用 ∀结论 }蛇葡萄素具有抑制黑色素瘤的侵袭和
转移的作用 ∀
≈关键词  蛇葡萄素 ~…ty小鼠黑色素瘤 ~抗侵袭和转移
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvlts2s|xz2sw
肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞离开原发生长部
位 o突破基底膜和细胞外基质构成的屏障 o侵犯毗邻
≈收稿日期  ussu2s|2s|
≈基金项目  广东省自然科学基金kusstszyul
≈通讯作者  刘德育 ר¯ }ksusl{zvvtwzy ∞2°¤¬¯}¯¬∏§¼ ƒ ª½2
¶∏°¶q¨§∏q¦±
的正常组织 ∀而转移即恶性肿瘤细胞借助血管 !淋
巴管等途径 o在远离肿瘤原发生长部位的器官内形
成继发瘤的过程≈t  ∀肿瘤侵袭及转移是肿瘤病人治
疗失败的主要原因 o很大一部分肿瘤病人在初治时
已有微小的或潜在的转移病灶 ∀为了能彻底治愈癌
症 o控制肿瘤侵袭和转移是关键 ∀目前虽有一些抗
#zx|#
第 u{卷第 ts期
ussv年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ ts
’¦·²¥¨µoussv
肿瘤侵袭和转移的药物在临床上应用 o但效果不理
想 ∀为此寻找抗肿瘤侵袭和转移药物是当务之急 o
特别是寻找高效低毒的天然产物更具有实用价值 ∀
蛇葡萄素k¤°³¨ ²¯³¶¬¶l是无根的主成分 o属于黄
酮类化合物≈u  ∀近年来我们发现其在 ≤xz…ry小
鼠体内有抑制黑色素瘤生长的作用 o在体外对人早
幼粒白血病 ‹2ys oŽxyu o人鼻咽癌 ‹Ž2t o人肝癌
…∞2zwsu o人乳腺癌  ≤ƒ2z等肿瘤细胞株有显著抑
制癌细胞增殖作用≈v ow  ∀本文通过研究蛇葡萄素对
…ty小鼠黑色素瘤体内外侵袭 !转移过程的影响来
评价蛇葡萄素抗肿瘤侵袭和转移的能力 ∀
1 材料与方法
1 q1 实验材料
≤xz…ry小鼠k ⎯ oty ∗ us ªl及 …ty小鼠黑色
素瘤细胞株均由中山大学动物中心提供 ∀ ×µ¤±¶º¨¯¯
小室及聚碳酸酯k°∂ °ƒl膜由美国 ≤²µ±¬±ª公司购
得 ∀酶标仪是美国 …Œ’2• „⁄产品 ∀
1 q2 药品与试剂
蛇葡萄素纯品由本研究室提供 ∀注射用氮烯咪
胺是南京制药厂生产k批号 usststs|l ∀ ¤·µ¬ª¨¯购
于 …¬²·¨¦«公司 ∀层粘连蛋白 !纤维粘连蛋白由北京
大学医学部生物教研室提供 ∀
1 q3 蛇葡萄素对 …ty细胞侵袭和运动能力的影响
用蛇葡萄素孵育 …ty细胞 v §后进行实验 o另
设二甲亚砜k⁄ ≥’l溶剂对照组≈x  ∀
侵袭实验 }在小室 °∂ °ƒ膜内表面铺 ¤·µ¬ª¨¯x
Λªo外表面铺趋化剂纤维粘连蛋白 x Λªo×µ¤±¶º¨¯¯
小室加入经各浓度药物处理过的 …ty细胞 u ≅ tsx
个 ovz ε 温箱培养 w «o棉签擦尽膜内表面细胞 o‹∞
染色 owss倍显微镜下计数膜上 x个视野的细胞数 o
取均值 ∀按下式计算药物对肿瘤细胞侵袭的抑制
率 }
抑制率k h l € k对照组平均侵袭细胞数 p给药组平均侵
袭细胞数lr对照组平均侵袭细胞数 ≅ tss h
运动实验 }除了在 °∂ °ƒ 膜内表面不铺 ¤2
·µ¬ª¨¯o其余步骤与侵袭实验相同 ∀按下式计算药物
对肿瘤细胞运动能力的抑制率 }
抑制率k h l € k对照组平均细胞数 p 给药组平均细胞
数lr对照组平均细胞数 ≅ tss h
1 q4 蛇葡萄素对 …ty细胞粘附能力的影响
各实验组 …ty细胞 o用各浓度蛇葡萄素孵育 v §
后 o以 { ≅ tsw 个r孔的 …ty细胞加入分别已铺好层
粘连蛋白 !纤维粘连蛋白 !¤·µ¬ª¨¯各 u Λª的 |y培
养板中 o置孵箱内 t «∀ °…≥洗掉未粘附的细胞 ∀粘
附于板上的细胞数量用  × × 法于 xzs ±°测定吸
光值 ∀把溶剂对照组作为 tss h 粘附率 o计算各实
验组的相对粘附率 ∀
1 q5 蛇葡萄素对 …ty细胞肺转移的实验性治疗
小鼠 …ty黑色素瘤人工肺转移模型的建立按文
献≈y 方法并作适当修改 ∀取雄性 ≤xz…ry小鼠 xs
只 o按处理因素随机分为溶剂对照组 !氮烯咪胺阳性
对照组 !蛇葡萄素高 !中 !低剂量组共 x组 o每组 ts
只 ∀胰蛋白酶消化收集体外培养的对数生长期 …ty
细胞 o以 °…≥洗涤 v遍 o用 uss目筛网过滤得到单细
胞 o…ty细胞重悬于 °…≥中 o稀释调整瘤细胞浓度为
每毫升 t ≅ tsy个 ∀每鼠尾静脉注射 s qu °瘤细胞
悬液 ∀
蛇葡萄素以 vs h ⁄ ≥’ 溶解 o于接种 …ty细胞
的前 t天开始腹腔注射给药 o剂量分别为 txs ouss o
uxs °ª#®ªp t o每天 t次 o连续给药 t{ §∀动物于停
药后第 u天处死 o取肺 o用 …²∏¬±氏液固定 o解剖显
微镜下计数肺转移瘤灶数 ∀按下式计算肺转移瘤抑
制率 }
抑制率 € k溶剂组平均转移瘤灶数 p给药组平均转移灶
数lr溶剂组平均转移瘤灶数 ≅ tss h
1 q6 统计学处理
应用 ≥°≥≥ ts qs ©²µ • ¬±§²º¶统计软件对实验
结果进行单因素方差分析 ∀
2 结果
2 q1 蛇葡萄素对 …ty细胞侵袭和运动能力的影响
蛇葡萄素在 us ows o{s Λ°²¯ #pt浓度时 o对
…ty细胞的侵袭和运动能力都有极显著抑制作用
k与溶剂对照组比 Π s qstl o其结果见表 t和图 t ∗
{ ∀照片图是各处理组在 wss倍显微镜下某个视野
的侵袭细胞数或运动细胞数 ∀
表 t 药物对肿瘤细胞侵袭重组基底膜及运动能力的影响
k ξ ? σl
组别
药物浓度
rΛ°²¯#p t
侵袭细胞数
r个r视野
抑制率
r h
运动细胞数
r个r视野
抑制率
r h
溶剂对照 vv qwz ? y qwz xs qtv ? tv qxy
蛇葡萄素 us ut qws ? z qsstl vy qsytl uw quz ? y qw| xt qx|tl
ws tv qxv ? v qwwtl x| qx{tl ut q{s ? w q|x xy qxttl
{s z qss ? w qsztl z| qs|tl ty qyz ? y qvw yy qzxtl
注 }tl与对照组比 Π s qst
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图 t 阴性对照对 …ty细胞
侵袭重组基底膜的影响 ≅ wss
图 u 蛇葡萄素 us Λ°²¯#p t
对 …ty细胞侵袭重组基底膜的影响 ≅ wss
图 v 蛇葡萄素 ws Λ°²¯#p t
对 …ty细胞侵袭重组基底膜的影响 ≅ wss
图 w 蛇葡萄素 {s Λ°²¯#p t
对 …ty细胞侵袭重组基底膜的影响 ≅ wss
图 x 阴性对照对 …ty细胞运动能力的影响 ≅ wss
图 y 蛇葡萄素 us Λ°²¯#p t
对 …ty细胞运动能力的影响 ≅ wss
图 z 蛇葡萄素 ws Λ°²¯#p t
对 …ty细胞运动能力的影响 ≅ wss
图 { 蛇葡萄素 {s Λ°²¯#p t
对 …ty细胞运动能力的影响 ≅ wss
2 q2 蛇葡萄素对 …ty细胞粘附能力的影响
结果表明 o蛇葡萄素 us ows o{s Λ°²¯ #pt各浓
度能降低 …ty细胞对层粘连蛋白粘附 o相对粘附率
分别为 zy qw| h oyw q{s h ox| qs| h ~降低 …ty细胞
对纤维粘连蛋白粘附 o相对粘附率分别为 zx q{s h o
yx qy{ h ox{ qyv h ~降低 …ty细胞对 ¤·µ¬ª¨¯的粘附
率 o相对粘附率分别为 zs qst h oxx qvv h ow| qw| h ~
抑制瘤细胞粘附的效应与药物浓度呈正相关 k图
|l ∀
图 | 蛇葡萄素对 …ty细胞粘附能力的影响
#|x|#
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∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ ts
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2 q3 蛇葡萄素对 …ty细胞肺转移的实验性治疗
由 ¨√ ±¨¨ 方差齐性检验结果 Π€ s qsxy可认为
各样本方差齐性 ∀采用 ≥⁄法对各处理组的小鼠
肺转移瘤灶数进行均值多重比较 ∀由表 u可看出各
药物剂量组与溶剂对照组存在显著性差异k Π 
s qsxl ~蛇葡萄素 uxs °ª#®ªp t剂量组与 tss °ª#
®ªp t氮烯咪胺阳性对照组无显著性差异k Π 
s qsxl ∀
表 u 蛇葡萄素对小鼠 …ty细胞肺转移的实验性治疗k ξ ? σl
组别
剂量
r°ª#®ªp t
动物数
前r后
平均体重
变化rª
转移瘤
灶数r个
抑制率
r h
Π值k与对
照组比l
较大转移
瘤灶数
°值k与对
照组比l
⁄ ≥’ 对照 ts °¯ tsrts n t qu ts qvs ? v qvz w qys ? u qvu
蛇葡萄素 txs tsrts n s q{ z qtt ? w qtt vs q|z s qstz u qyz ? t q{z s qsty
uss tsrts n t q{ y qtu ? u qtz ws qx{ s qssv u qtv ? t qux s qssv
uxs tsrts n t qt w qss ? u quy yt qty s qsst t qzs ? t qzz s qsst
氮烯咪胺 tss tsrts n u qt t q|s ? t qus {t qxx s qsst s qvs ? s qw{ s qsst
3 讨论
肿瘤转移始于恶性侵袭 o而侵袭是贯穿肿瘤转
移全过程的重要步骤 ∀此外瘤细胞穿入穿出血管或
淋巴管 o侵入靶器官内都是侵袭行为 ∀ ¬²··¤等提出
侵袭过程的 /三步0假说 o已得到一些实验的支持 ∀
首先肿瘤细胞通过膜表面的受体与基底膜 !基质成
分层粘连蛋白 !纤粘连蛋白和胶原蛋白结合 ~然后肿
瘤细胞分泌或利用细胞膜上的多种蛋白酶降解基底
膜和基质 ~最后肿瘤细胞定向运动穿越破损的基底
膜和基质部位 ∀转移的基本步骤归结如下 }原发瘤
增殖 o肿瘤新血管生成 ~肿瘤细胞侵袭毗邻的基底
膜 !基质和正常细胞 ~瘤细胞穿入血管或淋巴管并在
循环系统中存活 ~瘤细胞栓塞 !滞留于远隔靶器官的
微血管中并增殖 ~瘤细胞穿出血管或淋巴管 o在靶器
官内形成微转移灶 ~肿瘤间质内新血管生成 o转移瘤
快速生长≈z o{  ∀抗肿瘤细胞侵袭及转移药物是指作
用于上述各个步骤来达到抑制侵袭或转移的目的 ∀
为了衡量药物对肿瘤细胞侵袭细胞外基底膜的影
响 o本实验采用能在培养基中重组形成与天然基底
膜极为相似的膜结构的 ¤·µ¬ª¨¯胶 o它是从小鼠
∞‹≥肉瘤中提取的基质成分 o含有层粘连蛋白 !·型
胶原等 ∀用纤维粘连蛋白作为趋化剂 o…ty细胞在
趋化剂诱导下穿过 ×µ¤±¶º¨¯¯小室底部的涂有 ¤2
·µ¬ª¨¯的聚碳酸酯膜 o通过统计穿过膜的细胞数 o可
观察药物对 …ty细胞侵袭能力的影响 ∀同样 o肿瘤
细胞在趋化剂诱导下 o穿过 ×µ¤±¶º¨¯¯小室底部不涂
¤·µ¬ª¨¯的聚碳酸酯膜 o通过计数穿过膜的细胞即可
反映细胞的运动能力 o而加入经过药物处理的细胞
即可评价药物对细胞运动能力的影响≈x o|  ∀本实验
显示蛇葡萄素在 us ows o{s Λ°²¯#p t浓度都能明显
抑制 …ty细胞的侵袭 !运动和粘附 o而癌细胞的侵袭
与其运动和粘附有关 o因此蛇葡萄素抑制小鼠黑色
素瘤的运动和粘附是其抗侵袭的可能机制 ∀
人工肺转移模型集中体现了肿瘤细胞进入血液
循环以后癌转移的几个步骤 ∀小鼠 …ty黑色素瘤人
工肺转移模型是将瘤细胞直接注射入小鼠的血液循
环中 o最终导致肿瘤的肺部转移≈ts  ∀由于肿瘤细胞
侵袭穿过血管内皮下基底膜是形成实验性肺转移灶
的关键步骤之一 o我们认为 o蛇葡萄素通过抑制 …ty
细胞侵袭穿过血管内皮下基底膜 o从而抑制肺转移
瘤灶的形成 o可能是其抗转移作用的主要机制 ∀
我们的研究表明 o一定剂量或浓度的蛇葡萄素
对 …ty细胞的侵袭和转移有明显的抑制作用 o而蛇
葡萄素的毒性却很低k对昆明小鼠的单剂量腹腔给
药 o⁄xs为 t sux °ª#®ªp t≈tt l o有可能开发成高效
低毒的抗侵袭和转移药物 ∀
≈参考文献 
≈t  „½±¤√²²µ¬¤± ≥ o ≥·¨·¯¨µ2≥·¨√ ±¨¶²± • Š o ¬²··¤  „ q  ²¯ ¦¨∏¯¤µ
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≈u  王玫馨 o刘文粢 o黄爱东 o等 q无根黄酮类成分的分离和鉴定 q
中药材 ot|{| otukzl }u{ q
≈v  刘德育 o罗 曼 o谢冰芬 o等 q蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究 q癌
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≈w  周宁宁 o朱孝峰 o谢冰芬 o等 q无根中蛇葡萄素体外抗肿瘤作
用研究 q广东药学 ousss otskwl }z q
≈x  „ ¥¯¬±¬„ oŒº¤°²·² ≠ o Ž¯ ¬¨±°¤± ‹ Žo ·¨¤¯ q „ • ¤³¬§ ιν ςιτρο
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银杏叶提取物对谷氨酸诱导的兔视网膜
‘’ 水平及细胞凋亡的影响
李养军t o杨新光t o高玫蕊u
kt q第四军医大学 唐都医院 眼科 o陕西 西安 ztssv{ ~
u q延安大学 医学院 附属医院 眼科 o陕西 延安 ztysssl
≈摘要  目的 }探讨银杏叶提取物k ¬¨·µ¤¦·²©ª¬±®ª²¥¬¯²¥¤o∞Š…l对谷氨酸诱导的兔视网膜 ‘’ 水平及细胞凋
亡的影响作用 ∀方法 }利用谷氨酸兔玻璃体内注射 o诱导视网膜细胞凋亡的模型 o眼球后注射不同剂量的 ∞Š…o采
用分光光度法测定兔视网膜 ‘’ 水平 o琼脂糖凝胶电泳分析视网膜细胞 ⁄‘„断裂 ∀结果 }实验对照组视网膜的
≈收稿日期  ussu2tu2tu
≈基金项目  陕西省自然基金kusss≥„  |l
≈通讯作者  李养军 ר¯ }ksu|lvvzzzx| ∞2°¤¬¯}¯¼­∏±y{#¶¬±¤q¦²°
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第 u{卷第 ts期
ussv年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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