全 文 ：虫草多糖逆转 ＤＭＮ诱导大鼠肝纤维化
的作用及机制研究
李风华１，刘 平１，熊卫国１，徐光福 ２
（１上海中医药大学 肝病研究所，上海 ２０１２０３；
２北京中医药大学 附属东直门医院，北京１００７００）
［摘要］ 目的：研究虫草多糖抗肝纤维化作用的机制。方法：将 ＳＤ大鼠随机分为正常组、模型组、虫草多糖
组。采用二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型。经过虫草多糖治疗４周后，大鼠肝脏用丽春红胶原染色观察大
鼠胶原纤维沉积的变化，观察大鼠血清肝功能的变化，盐酸水解法检测肝组织羟脯氨酸含量，Ｅｎｖｉｓｉｏｎ两步法测定
肝组织Ⅳ型胶原含量和金属蛋白酶组织抑制因子２（ＴＩＭＰ２）含量；酶图法检测肝组织金属蛋白酶２（ＭＭＰ２）活性，
同时检测肝组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）含量的改变。结果：镜下检查可见模型组大鼠肝脏胶
原纤维间隔形成；血清肝功能指标异常，ＭＭＰ２含量降低；组织Ｈｙｐ含量，Ⅳ型胶原含量，Ｉ型胶原蛋白表达，ＴＩＭＰ
２，ＭＤＡ含量，均较正常组均显著增加，ＳＯＤ活性下降，而虫草多糖组的上述指标较模型组均有不同程度的显著下
降，使ＳＯＤ活性升高，ＭＭＰ２含量升高。结论：虫草多糖有显著的抗肝纤维化作用，其机制与促进胶原降解和抗脂
质过氧化作用有关。
［关键词］ 肝纤维化；二甲基亚硝胺；虫草多糖；基质金属蛋白酶；超氧化物歧化酶
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００６）２３１９６８０４
［收稿日期］ ２００６０２０６
［基金项目］ 国家杰出青年科学基金资助项目（３９８２５１２）；上
海市重点学科建设项目（Ｙ０３０２）；上海市教委青年基金项目
（０１ＱＮ７８）
［通讯作者］ 刘平，Ｔｅｌ：（０２１）５１３２２４５４，Ｅｍａｉｌ：ｌｆｈ＠ｈｏｔ
ｍａｉｌｃｏｍ
虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它
能促进淋巴细胞转化，提高血清 ＩｇＧ的抗体含量和
机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力。
从２０世纪９０年代以来，虫草多糖应用于肝硬化治
疗的研究屡有报道［１，２］。本研究的主要目的是探讨
虫草多糖干预ＤＭＮ诱导大鼠肝纤维化的机制。
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 药物 二甲基亚硝胺（ＤＭＮ，东京化成工业
株式会社，批号 ＭＡＬ０５）。发酵虫草菌丝 Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ
ｓｉｎｅｎｓｅｓ购自江西国药责任有限公司，经不同的乙醇
分级提取后，残渣用热水反复提取，提取液透析数
次，加入乙醇沉淀，沉淀物用水洗涤浓缩后冷冻干
燥，即得粗多糖，提取率为１５％。提取物用费林试
剂鉴定多糖部分，呈阳性反应。
１１２ 动物 ＳＤ大鼠，雄性，清洁级，体重（１５０±
１０）ｇ，中国科学院上海实验动物中心提供。
１１３ 试剂 小鼠抗人ＩＶ型胶原蛋白（ＣｏｌＩＶ）单
克隆抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ公司）。鼠抗人 ＴＩＭＰ２（Ａｂ１）
单克隆抗体（一抗）（复旦大学医学院病理教研室免
疫组化研究室张秀荣馈赠，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ公司），
Ｃａｔ＃ＣＰ５６，Ｅｎｖｉｓｉｏｎ４００４Ｂ（ｍｏｕｓｅ）二抗（丹麦ＤＡＫＯ
公司，购自上海中达试剂公司），肝组织 ＳＯＤ和
ＭＤＡ检测盒（南京建成生物工程公司），血清肝功能
试剂盒（上海生物制品研究所）。
１２ 方法
１２１ 动物模型制备 参照 Ａｌａｋｋｏｋ方法。０９％
ＮａＣｌ稀释ＤＭＮ为０５％，以１０μＬ·ｋｇ－１剂量，腹腔
注射ＤＭＮ，每天１次，每周连续３ｄ，共４周。
１２２ 分组 ＳＤ大鼠２５只，随机分组。正常对照
组７只，以２ｍＬ·ｋｇ－１大鼠体重容积腹腔注射生理
盐水，每天 １次，每周连续３ｄ，共４周。模型组１１
只、虫草多糖组１０只，造模４周结束后分别以蒸馏
水和虫草多糖（６０ｍｇ·ｋｇ－１）溶液灌胃，疗程４周。
１２３ 指标检测报 疗程结束后，以２％戊巴比妥
钠按２ｍＬ·ｋｇ－１剂量腹腔注射麻醉大鼠，取肝组
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第３１卷第２３期
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织，进行如下指标检测：肝组织标本胶原纤维染色
（丽春红染色），胶原纤维增生程度半定量标准参见
文献，半定量标准为：０级，正常肝脏，无明显的胶原
纤维增生；１级，胶原纤维增生，中央静脉和门静脉
区有少量星状胶原纤维束放散但无间隔形成；２级，
原纤维增生，中央静脉和门脉区结缔组织变厚，由
此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；３级，胶原
纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成，或较厚
的不完全间隔即将形成假小叶；４级，完全间隔较
厚，假小叶大量形成。部分组织羟脯氨酸（Ｈｙｐ）含
量测定用Ｊａｍａｌ氏法［３］；组织金属蛋白酶２（ＭＭＰ
２）活性采用酶图法；肝组织Ⅳ型胶原、金属蛋白酶
组织抑制因子 ２（ＴＩＭＰ２）含量采用 Ｅｎｖｉｓｉｏｎ两步
法，图像分析半定量；血清肝功能和ＭＤＡ，ＳＯＤ检测
均使用试剂盒检测。
１２４ 统计学处理 所有数据均使用ＳＰＳＳ１１０软
件包进行统计学分析。计量资料用 珋ｘ±ｓ表示。统
计方法使用方差分析的两两比较。
２ 结果
２１ 虫草多糖对肝纤维化大鼠血清肝功能指标的
影响
模型组大鼠血清 ＡＳＴ，ＡＬＴ较正常组明显升高
（Ｐ＜００１），而Ａｌｂ则明显降低（Ｐ＜００１），表明该
模型动物的肝损伤明显。给予虫草多糖的治疗后，
血清ＡＳＴ，ＡＬＴ水平显著降低（Ｐ＜００１），血清 Ａｌｂ
含量明显升高（Ｐ＜００１）。在降低血清总胆红素方
面，较之模型组，虫草多糖组能显著降低 ＴＢＩＬ的含
量（Ｐ＜００１）（表１）。
表１ 虫草多糖对肝纤维化大鼠血清肝功能及肝组织羟脯氨酸的影响（珋ｘ±ｓ）
组别 ｎ ＡＳＴ／Ｕ·Ｌ－１ ＡＬＴ／Ｕ·Ｌ－１ Ａｌｂ／ｇ·Ｌ－１ Ｔｂｉｌ／ｇ·Ｌ－１ Ｈｙｐ／ｍｇ·ｇ－１
正常 ７ １３２．６±１５．１ １５．２±５．５ ４０．３±２．７ ３０．０±３．７ ３．８２±１．３２
模型 １１ ２０７．８±２１．４１） ８６．６±２０．２１） ２８．９±１．８１） ６７．５±１９．２１） １８．８２±４．８４Ｄ１）
虫草多糖 １０ １４２．７±３３．１２） ２０．０±８．６２） ３２．７±３．３２） ３５．１±０．６２） ９．２３±５．３５２）
注：与正常组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００１
２．２ 虫草多糖对肝纤维化鼠肝组织病理的改变
２．２１ ＨＥ染色观察 模型组动物肝组织散在汇管区炎
性细胞浸润与少量肝细胞坏死，汇管区、中央静脉、肝窦
周围及坏死灶中见有部分结缔组织增生，虫草多糖组肝
组织出血坏死灶及炎细胞浸润明显轻于模型组。
２．２．２ 胶原染色观察 模型组大鼠肝组织中，纤维
组织弥漫性增生严重，少数大鼠肝纤维组织大量增
生，形成菲薄的纤维间隔，向肝小叶组织内伸展，分
割包绕肝组织，正常肝小叶结构紊乱，形成假小叶，
用药组大鼠弥漫性纤维组织增生程度较模型组大鼠
轻，胶原纤维间隔缩小，着色浅，肝窦内连续性环状
胶原减少或断续，肝脏炎性坏死减轻，纤维间隔变
窄，少数大鼠肝组织周围胶原沉积不明显（表２）。
表２ 各组大鼠肝组织胶原纤维增生程度比较
组别 ｎ
胶原纤维增生程度
０级 １级 ２级 ３级 ４级
正常 ７ ７ ０ ０ ０ ０
模型 １１ ０ １ １ ４ ５
虫草多糖 １０ ０ ３ ６ １ ０
２３ 虫草多糖对肝纤维化大鼠肝组织羟脯氨酸
（Ｈｙｐ）的影响
与正常组比较，模型组 Ｈｙｐ量明显升高，胶原
沉积显著。经虫草多糖治疗后，Ｈｙｐ明显降低（Ｐ＜
００１），接近正常组水平（表１）。
２４ 虫草多糖对肝纤维化大鼠肝组织Ⅳ型胶原含
量，ＭＭＰ２活性和ＴＩＭＰ２含量的影响
与正常组比较，模型组Ⅳ和 ＴＩＭＰ２含量的影
响明显升高，ＭＭＰ２活性显著低于正常组。经虫草
多糖治疗后，Ⅳ型胶原含量降低（Ｐ＜００５），ＭＭＰ２
活性显著升高（Ｐ＜００１）（表３）。图象分析显示，
虫草多糖治疗组的ＴＩＭＰ２较模型组轻，主要表现为
肝窦区域ＴＩＭＰ２染色仅比正常略多，小叶周边和间
隔的阳性染色较淡（图１）。图象分析处理结果也表
明，模型组 ＴＩＭＰ２的含量显著高于正常组，治疗组
能明显抑制ＴＩＭＰ２的升高（Ｐ＜００１）。
表３ 虫草多糖Ⅳ对型胶原、ＭＭＰ２和
ＴＩＭＰ２的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 Ⅳ型胶原／％ ＭＭＰ２活性 ＴＩＭＰ２／％
正常 ３３±０４ ３５５８１±２４５９ ４５±０７
模型 ８１±０５１） ２３５１２±５５１１１） １１５±２４１）
虫草多糖 ５８±０３２） ３２０９５±３１５７３） ６３±１４３）
注：与正常组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００５，３）Ｐ＜００１
２５ 虫草菌丝对肝纤维化大鼠肝脏 ＭＤＡ和 ＳＯＤ
的影响
模型组ＳＯＤ活性显著低于正常组，虫草多糖组
较模型组 ＳＯＤ活性明显上升（Ｐ＜００１）。模型组
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图１ 各组大鼠肝组织ＴＩＭＰ２染色病理图（×２００）
Ａ正常组；Ｂ模型组；Ｃ虫草多糖组
肝组织ＭＤＡ大幅度增加，为正常组的２５倍；药物
治疗组能显著降低ＭＤＡ（Ｐ＜００１）（表４）。
表４ 虫草多糖对纤维化大鼠肝脏ＭＤＡ含量
和ＳＯＤ活性的影响（珋ｘ±ｓ）
组别 ｎ ＳＯＤ／×１０－３ＮＵ·ｇ－１ ＭＤＡ／μｍｏｌ·ｇ－１
正常 ７ ２３．３±８．８ ２．６±０．７
模型 １１ １３．４±３．５１） ６．４±１．０１）
虫草多糖 １０ １７．０±２．３２） ３．９±０．７２）
注：与正常组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００１
３ 讨论
细胞外基质的胶原可被多种蛋白酶分解，
ＭＭＰ２是其中一种已知的蛋白酶，ＭＭＰ２又叫Ⅳ型
胶原酶或明胶酶，主要在 ＨＳＣ，ｋｕｐｆｅｒ细胞和窦内
皮细胞中合成，通过其氨基端被机体内有机泵裂解
后而激活。ＴＩＭＰ为基质金属蛋白酶抑制因子家
族［４，５］。肝纤维的维持是因为ＴＩＭＰ家族表达过大，
从而抑制了 ＭＭＰｓ的活性，ＴＩＭＰ２是 ＭＭＰ２的主
要抑制物［６］。
本实验模型组大鼠 ＭＭＰ２活性及 Ｈｙｐ含量明
显低于正常组，ＴＩＭＰ２含量高于明显高于正常组，
病理观察结果也证实模型组纤维增生严重。在给药
４周后，虫草多组 ＭＭＰ２活性都有上升，提示虫草
多糖可能有提高酶活性，从而促进Ⅳ型胶原的降解
的功能；同时，ＴＩＭＰ２的含量下降 。据此，虫草多
糖可能会通过降低 ＴＩＭＰ２的含量，从而减弱 ＭＭＰ
２的抑制作用，提高了 ＭＭＰ２的活性，这有利于肝
纤维化时过多Ⅳ型胶原的降解，有利于肝脏特别是
肝窦结构的快速修复。这种作用可能是虫草多糖抗
肝纤维化的重要机制之一。
本实验所采用的造模剂 ＤＭＮ是一种肝细胞基
因毒性化学物质，可导致肝细胞及其线粒体缺血缺
氧，从而生成过氧基，引发自由基发生脂质过氧化反
应，其主要反应产物 ＭＤＡ等活性醛基化合物则能
直接刺激星状细胞活化，导致肝纤维化。此外，在
ＤＭＮ造模刺激的初期，可引起过多的游离脂肪酸在
肝细胞内沉积，产生氧自由基激发脂质过氧化，引发
ＭＤＡ和４ＨＮＥ（４ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ）激活ＨＳＣ，启动纤
维合成链式反应，导致肝纤维化的形成［７］。同时，４
ＨＮＥ又是一种强的中性粒细胞化学趋势剂，可进一
步加速肝纤维化进程。更多的学者认为，除了激活
ＨＳＣ可导致肝纤维化外，脂质过氧化产物还可以作
用于ｋｕｐｆｅｒ细胞，促使其释放前胶原细胞激动素，
如细胞转化生长因子 β１（ＴＧＦβ１），从而增加胶原
量［８，９］。
虫草多糖较显著地降低 Ｈｙｐ的含量，降低血清
中ＡＬＴ，ＡＳＴ酶活性，改善肝组织结构，保护肝细胞，
减轻肝脏胶原沉积，具有良好的抗肝纤维化作用，而
且均有抗氧化作用。实验结果提示，抗氧化抑制胶
原的合成可能是虫草多糖抗肝纤维化作用的另一机
制，推测虫草多糖可能是通过纠正肝细胞缺血、缺氧
状态，保护肝脏、减轻对间质细胞的刺激等抗氧化作
用抑制ＦＳＣ增殖和 ＴＧＦβ１的活性，从而达到抑制胶
原合成的目的。
总之，通过以上实验，初步认为虫草多糖抗肝纤
维化的作用可能主要是通过２个途径：抗脂质过氧
化从而抑制胶原的合成；同时虫草多糖又通过提高
ＭＭＰ２的活性、对 ＴＩＭＰ２表达的影响从而促进胶
原的分解，加速肝纤维化的恢复。
［参考文献］
［１］ 邱德凯，李 海虫草多糖脂质体对大鼠肝纤维化胶原酶
ｍＲＮＡ变化的影响［Ｊ］新消化病学杂志，１９９７，５（７）：４１７
［２］ 卢春凤，刘 蕾，杨丽虫，等虫草多糖对离体肝星状细胞增
殖及胶原基因表达的影响［Ｊ］黑龙江医药科学，２００４，２７
（５）：１７
［３］ 梁扩寰肝脏病学［Ｍ］北京：人民卫生出版社，１９９５：５７５
［４］ ＦｒｉｅｄｍａｎＳＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ，ａｎｉｎ
·０７９１·
第３１卷第２３期
２００６年１２月
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