全 文 ：׬和 •¬质粒对栝楼双转化的研究
雷和田t o宋经元t o祁荫麟t o张荫麟t o杨峻山t o郭志刚u
kt q中国医学科学院 协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|w ~
u q清华大学 化学工程系 o北京 tsss{wl
≈摘要  目的 }建立栝楼双转化毛状根培养系统 ∀方法 }≠ 利用根癌农杆菌 Αγροβαχτεριυ µ τυ µεφαχιενσ菌株
≤x{感染栝楼 Τριχηοσαντηεσ κιριλοωιι q无菌苗诱导冠瘿瘤 o然后用发根农杆菌 Αγροβαχτεριυ µ ρηιζογενεσ菌株 tx{vw
感染其再生植株 o诱导出毛状根 ~ 用纸电泳检测 ׬和 •¬质粒是否转化成功 ~≈ 运用分光光度计和 ≥⁄≥2°„Š∞检
测栝楼组织中所含蛋白 ∀结果 }׬和 •¬质粒转化成功并建立了栝楼双转化毛状根培养系统 ∀结论 }双转化毛状根
与一般毛状根相比 o具有生长更迅速等特点而蛋白含量基本一样 ~因此 o利用它来生产天花粉蛋白更具有开发潜
力 ∀
≈关键词  栝楼 ~冠瘿瘤 ~双转化毛状根
≈中图分类号  • u{u qu ~±|wv qt ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsv2styu2sw
利用根癌农杆菌 ׬质粒的冠瘿组织和发根农
杆菌 •¬质粒转化和毛状根作为培养系统来生产有
用的植物活性成分是当今植物生物技术研究的热点
之一 ∀冠瘿组织和毛状根培养系统具有激素自主 !
生长迅速等优点 ∀栝楼的块根俗称天花粉 o含有淀
粉 !皂甙 !天花粉蛋白 !多种氨基酸及糖类等成分 o其
中天花粉蛋白≈ ×µ¬¦«²¶¤±·«¨¶k× ≤‘l o 能抑制绒毛
膜上皮癌细胞的生长≈t ou  o调节免疫反应及能选择
性地抑制 „Œ⁄≥病毒 ‹Œ∂ 在感染的免疫系统细胞内
的复制≈v  o尤其是在发现其具有抗艾滋病的功效后
更加激发了人们对它的兴趣 ~× ≤‘和 × „°u|k×µ¬2
¦«²¶¤±·«¨¶„±·¬2‹Œ∂ °µ²·¨¬± u|Ž§¤l是其中最引人
注目的两种蛋白≈u ov  ∀利用发根来生产生天花粉蛋
白的研究已有报道≈w ox  o但离工业化生产还有一定
距离 ∀我们基于使发根生长更迅速 !更能适宜于天
花粉蛋白的工业化生产进行了 ׬和 •¬质粒对栝楼
双转化的研究 ∀
1 材料与方法
111 细菌菌株及其培养
本实验采用根癌农杆菌菌株 ≤x{与发根农杆菌
菌株 tx{vw ∀在感染植物材料之前 o将农杆菌 ≤x{
与 tx{vw菌株接种于 ≠ ∞…固体培养基中 ou{ ε o暗
培养 uw «∀
112 冠瘿瘤的诱导及培养
≈收稿日期  usss2sx2tt
栝楼种子经 s qt h升汞消毒 ts °¬±o无菌蒸馏
水冲洗 v次 o于  ≥琼脂培养基上萌发获得无菌苗 ∀
培养条件为温度 ux ε o每天光照 ty «∀t个月后取
栝楼无菌苗长约 y ¦° o去掉顶芽和叶片 o在茎节处
涂上生长良好的 ≤x{菌株 o并用解剖针刺破表皮 o然
后放在 ux ε !漫射光下培养 ∀待诱导出的冠瘿瘤长
到一定大小时 o从母体上切下移到含有 xss °ª#p t
羧苄青霉素的  ≥琼脂培养基上除菌 ∀
113 ׬质粒转化后植株再生
把冠瘿组织接种在  ≥ o• ° oyz2∂ o…x 培养基上
诱导再生植株 ∀
114 双转化毛状根的获得及培养
用发根农杆菌菌株 tx{vw感染从冠瘿组织诱导
出的再生植株和从种子而来的无菌苗 o获得双转化
毛状根和普通毛状根 ∀然后放到含 xss °ª#pt羧
苄青霉素的  ≥琼脂培养基上除菌 o除菌后的毛状
根在  ≥培养基上继代培养及用于其它实验 ∀
115 ׬和 •¬质粒转化的证实
根据 ¨²± „ …≈y 等人的方法检测冠瘿组织 !转
化无菌苗 !双转化毛状根中的冠瘿碱 o证实 ׬质粒
转化是否成功 ∀根据文献≈z o{ 的方法证实 •¬质粒的
×2⁄‘„是否已转化到栝楼毛状根细胞的 ⁄‘„中 ∀
116 栝楼冠瘿组织 !双转化毛状根中总蛋白的测定
称取 xsª新鲜的栝楼块根 !冠瘿组织 !双转化毛
状根 !普通毛状根 o加入 tΒu 的 t ≅ °…≥k°«²¶³«¤·¨
…∏©©¨µ≥¤¯¬±¨ l o经破碎k破碎机 ovs ¶v ∗ w次l !分散
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第 uy卷第 v期
usst年 v月
中 国 中 药 杂 志
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k调整分散器 ovs ¶v ∗ w次l !浸泡kw ε ot ∗ u §l !离
心k{ sss µ#°¬±p t otx °¬±l后 o取 xs Λ¯ 上清液 n |xs
Λ¯ §‹u’ o最后加入 x °¯ 考马斯亮蓝溶液 ~然后用
zut分光光度计在 x|x ±°处测定其 ’⁄值≈| ots  ∀运
用 ≥⁄≥2°„Š∞测定栝楼各组织中所含蛋白的分子
量≈| ott  ∀
2 结果与分析
211 栝楼冠瘿瘤的诱导 !除菌及培养
用根癌农杆菌菌株 ≤x{感染栝楼无菌苗k茎节
处l ot周后 o在刺破感染处出现明显肿胀 ou周后 o待
该冠瘿瘤约 u °°k诱导率为 {s h l时 o把它切下放
入含 xss °ª#pt羧苄青霉素的  ≥固体培养基上
除菌 ~待除尽菌后 o把它们放在无激素的  ≥ o• ° o
yz2∂ o…x 培养基上培养 o其培养条件为黑暗 oux ε ∀
结果表明 o以  ≥培养基最适栝楼冠瘿组织生长k图
t2tl ∀我们把一些冠瘿组织放在黑暗 oux ε 条件下
培养 ts §转到光照 ty «o光强 usss ¬¯ous ε 条件下
培养 ous §时见一些冠瘿组织出现丛芽 o以后它们再
生出完整植株k图 t2ul ∀这些植株与普通无菌苗相
比 o具有根系发达 !节间较长等特点k图 t2vl ∀
212 双转化毛状根与普通毛状根的诱导及培养
用发根农杆菌菌株 tx{vw分别对经根癌农杆菌
转化后的再生植株与经种子繁殖而来的无菌苗k茎
节处l进行感染 o{ §后都成功地诱导出毛状根k诱导
率约 xs h l ∀待根长 v ¦°左右 o剪取根尖长约 u ¦°
放在含 xss °ª#pt羧苄青霉素的  ≥培养基上除
菌 o经除菌后放在  ≥琼脂培养基上继代培养 ∀据
观察k图 t2w oxl o双转化的毛状根较普通毛状根具有
根毛密集而长 !直径较粗等特点 ~t qy ª双转化及普
通毛状根接种到  ≥液体培养基ktl中培养 oux §
时收获 o双转化毛状根为 ts{ q| ª#pt o普通毛状根
为 zw qx ª#pt ~这些差异可能是由于双转化毛状根
在 ׬和 •¬两个质粒转化后细胞分裂素和生长素的
含量显著增加的结果 ∀
213 冠瘿碱的检测
21311 ±²³¤¯¬±¨ 检测 根癌农杆菌 ≤x{菌株 ׬质
粒含有 ±²³¤¯¬±¨ 合成酶基因 o如果 ׬质粒将其 ×2
⁄‘„导入到了植物细胞并整合到其染色体中 o那么
在诱导出的冠瘿组织和转化后的无菌苗 !双转化毛
状根中就能检测到 ±²³¤¯¬±¨ o表明转化成功 ∀我们用
高压纸电泳分别检测了栝楼冠瘿组织及其再生植
株 !双转化毛状根 o结果k图 t2x ozl表明 o它们都合成
了 ±²³¤¯¬±¨ o这证实转化成功 ∀
21312 °¤±±²³¬±¨ 检测 发根农杆菌 tx{vw 菌株
•¬质粒含有 ¤ªµ²³¬±¨ 和 °¤±±²³¬±¨ 合成酶基因 o同
׬质粒转化一样 o如果 •¬质粒将其 ×2⁄‘„ 整合到
植物染色体中 o那么在诱导出的毛状根就能检测到
其农杆碱 ∀我们也是用高压纸电泳分别检测了双转
化毛状根和普通毛状根中的冠瘿碱 ∀结果显示k图
t2{l o双 转 化 毛 状 根 和 普 通 毛 状 根 都 含 有
°¤±±²³¬±¨ o表明 •¬质粒的 ×2⁄‘„已转化到相应的
栝楼植物细胞中并获得表达 ∀
214 栝楼冠瘿组织 !发根总蛋白含量的测定
根据用标准蛋白求得的标准曲线 Ψ € t|| .yv Ξ
p z .sw , ρ€ s q|||y计算出各种组织中的蛋白含量 ∀
块根总蛋白为 uxy q{u °ª#p t o冠瘿组织为 tu| q{v
°ª#pt o普通毛状根为 tw{ qy °ª#pt o双转化毛状
根为 tws qvw °ª#p t ~结果表明 o栝楼块根蛋白含量
较高 o而冠瘿组织中蛋白含量较低 ∀
运用 ≥⁄≥2°„Š∞测定栝楼双转化毛状根所含
蛋白分子量 o结果k图 t2|l表明 o它含有的蛋白种类
与栝楼块根和普通毛状根基本一样 ∀
从以上实验可看出 o栝楼双转化毛状根是 ׬和
•¬两种质粒 ×2⁄‘„ 双重转化的结果 o它具有比普
通毛状根生长更迅速且天花粉蛋白含量基本不变的
特点 o为此 o利用它来生产天花粉蛋白更具有开发潜
力 ∀
≈参考文献 
≈t  ׶¤² ≥ • o ≠¤± Ž× o ≠ ∏¨±ª ‹ • q≥¨¯ ¦¨·¬√¨Ž¬¯¯¬±ª²© ≤«²µ¬²¦2
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究 q植物学报 ot||y qv{kyl }wv| q
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图 t ׬和 •¬质粒对栝楼的双转化
t q栝楼冠瘿组织 u q栝楼冠瘿组织再生苗 v„ q栝楼 ׬质粒转化苗 v…q栝楼无菌苗
w≤ q栝楼双转化毛状根 w⁄q栝楼毛状根
x¤o¬q¤µª¬±¬±¨ x¥oªq±²³¤¯¬±¨ x¦o©q栝楼无菌苗 x§o¨ q栝楼冠瘿组织 x«q²¦·²³¬±¨
y≤ q栝楼双转化毛状根 y⁄q栝楼普通毛状根
z¤q栝楼冠瘿组织再生苗 z¥q栝楼双转化毛状根 z≤ q栝楼无菌苗 z§q±²³¤¯¬±¨ z©q¤µª¬±¬±¨
{¤q栝楼冠瘿组织再生苗 {¥q栝楼双转化毛状根 {¦q普通毛状根 {§q栝楼无菌苗 {¨q°¤±±²³¬±¨ z¨q²¦·²³¬±¨
|¤o¨ q栝楼冠瘿组织 |¥q栝楼块根 |¦q栝楼双转化毛状根
|§o«q标准分子量蛋白 |ªq栝楼冠瘿组织再生苗根 |©q栝楼无菌苗根
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版社 ot||y q{{s1
Γενετιχ Τρανσφορµ ατιον οφ Ηαιρψ Ροοτσ
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε:ײ ¶¨·¤¥¬¶«¤«¤¬µ¼ µ²²·¦∏¯·∏µ¨ ¶¼¶·¨° ¥¼ §²∏¥¯¨·µ¤±¶©²±°¤·¬²± ©²µ Τριχηοσατηεσ
κιριλοωιι . Μετηοδ : ≠ ≤µ²º± ª¤¯ ¶¯ º µ¨¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ §¬µ¨¦·¬±©¨ ¦·¬²± ²©¶·¨µ¬¯¨ ¶¨ §¨¯¬±ª¶²© Τ . κιριλονιι º¬·« Α2
γροβαχτεριυ µ τυ µεφαχιενσ ≤x{ o¤±§·«¨ ±·«¨ «¤¬µ¼µ²²·¶º µ¨¨ ²¥·¤¬±¨ §©µ²° ·«¨ µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§³¯¤±·¶¥¼¬±©¨¦·¬²±
º¬·« Α . ρηζογενεσ tx{vw ~ ×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²© ׬¤±§ •¬³¯¤¶°¬§¶º¤¶¬±¶³¨¦·¨§¥¼ «¬ª«2³µ¨¶¶∏µ¨2³¤³¨µ¨¯ ¦¨2
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°„Š∞ qΡεσυλτ :„ «¤¬µ¼µ²²·¦∏¯·∏µ¨ ¶¼¶·¨° «¤¶¥¨ ±¨ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨ §¶∏¦¨¶¶©∏¯ ¼¯ ¥¼ §²∏¥¯¨·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± º¬·« ׬¤±§
•¬³¯¤¶°¬§¶¬± Τ . κιριλοωιι .Χονχλυσιον :≤²°³¤µ¨§ º¬·«·«¨ ²µ§¬±¤µ¼ «¤¬µ¼µ²²·¶o·«¨ §²∏¥¯¨·µ¤±¶©²µ° §¨«¤¬µ¼
µ²²·¶ªµ²º ©¤¶·¨µ¥∏·µ¨·¤¬± ¶¬°¬¯¤µ³µ²·¨¬± ¦²±·¨±·¶q
[ Κεψ ωορδσ] Τ . κιριλοωιι ~«¤¬µ¼ µ²²·¶~§²∏¥¯¨·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
≈责任编辑 王康正 
中国中医药学会第六届全国中药鉴定学术研讨会通知
中国中医药学会中药鉴定分会定于 usst年 {月中下旬在山东省威海市举办/全国第六届中药鉴定k含生药l学术研讨会 ∀
研讨及征集论文内容 }t q中药鉴定的品种鉴定及新方法 !新技术 !新思路 !新方向 ∀ u q中药质量控制和评价方法 !真伪鉴
别 ∀v q中药新药研究的质量标准和稳定性试验 ∀w q中药生产 !栽培 !加工 !管理的规范化研究与中药的 Š„°基地建设 ∀x q中
药资源的综合开发利用与道地药材研究 ∀y qut世纪中药鉴定学教材建设 !学科建设及教学法的研究与思路 ∀z q信息技术 !生
物工程技术等新技术在中药研究中的应用 ∀{ q中药药理学研究 ∀| q中药化学成分研究 ∀ts q中药鉴定学发展与边缘学科的相
关性研究k包括药理学 !分子生物学 !细胞生物学 !药用植物学 !中药化学 !中药炮制学 !中药制剂学业 !中药栽培学 !中药资源
学 !生药学 !中药商品学等l ∀tt q中药鉴定新技术专题讲座 ∀tu q中药鉴定与新技术专题讲座 ∀tv q中药鉴定学及相关学科的
人才培养 ∀tw q中药鉴定学的历史回顾 !发展与前景 ∀
与以上内容相关的论文均欢迎投稿 ∀所投稿要求为非公开发表的论文 o一律用 „w纸打印 o请附上 xss字以内的摘要k最
好同时有英文摘要l及关键词 ∀录用论文将收载入大会学术论文集k或5北京中医药大学学报6增刊l o会议交流论文将另颁发
证书 ∀该会议参加者可记继续教育学分 y分 ∀会议期间将组织与会者进行有关考察 ∀
会议论文截稿日期为 usst年 w月 vs日k以寄发邮局日戳为准l ∀usst年 w月 vs日不能按期交论文或论文摘要者 o请自
备 uss份材料参加大会 ∀投稿录用与否 o概不退稿 o请自留底稿 ∀稿件经审评录用后 o将收到第二轮会议通知 ∀
来稿请寄 }tsssu| o北京中医药大学中药学院 o艾路 o宋京晶 ∀电话 }kstsl2ywu{y|zw oywu{y|{| ∀
¨p °¤¬¯} ≠⁄ƒ °¤¬¯¶q¥­∏¦°³q¨§∏q¦±或 „Œƒ °¤¬¯¶q¥­∏¦°³q¨§∏q¦± k可收投稿l
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