全 文 ：#药理#
肺舒灵对金黄地鼠肺泡巨噬细胞
产生肿瘤坏死因子的影响 3
张旭晨 阮英茆 焦增绵 韩晓男
k中国医学科学院中国协和医科大学心血管病研究所阜外心血管病医院 北京 tsssvzl
摘要 目的 }观察中药复方肺舒灵对金黄地鼠肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子k× ‘ƒ2Αl的影响 o探
讨肺舒灵防治慢性阻塞性肺疾病的作用机制 ∀方法 }经支气管肺泡灌洗获得肺泡巨噬细胞并进行培养 o
在脂多糖刺激同时或刺激 y«后加入不同剂量的肺舒灵 o应用 ∞Œ≥„法测定上清液中 × ‘ƒ2Α含量 o原位
杂交技术检测细胞中 × ‘ƒ2Α °• ‘„ 表达情况 ∀结果 }应用肺舒灵后 o上清液中 × ‘ƒ2Α含量和细胞中
× ‘ƒ2Α °• ‘„表达均明显低于脂多糖刺激组k Π s qstl o且呈剂量依赖关系 o与单纯培养基培养组相比
无明显差异k Ё s qsxl ∀结论 }减少肺泡巨噬细胞 × ‘ƒ2Α的产生 o减轻 × ‘ƒ2Α介导的肺组织损伤 o可能
是肺舒灵防治慢性阻塞性肺疾病的机制之一 ∀
关键词 肺泡巨噬细胞 肿瘤坏死因子 慢性阻塞性肺疾病
临床初步观察表明 o具有固本理气 !化痰祛
瘀功效的中药复方肺舒灵煎剂对慢性阻塞性肺
疾病k≤ ’°⁄l具有较好的防治作用 o但其详细机
制尚不清楚 ∀为了探讨肺舒灵的作用机制 o本
研究应用肺泡巨噬细胞培养的方法 o观察了其
对金黄地鼠肺泡巨噬细胞产生 × ‘ƒ2Α的影响 ∀
1 材料与方法
1 q1 药物 肺舒灵由桔梗 yª!当归 txª!地龙
txª!莱菔子 txª等 z味药组成 o均一次性购自
北京市医药总公司白塔寺药店 o经北京中医药
大学中药学院中药鉴定教研室闫玉凝教授鉴定
为正品 ∀制剂时称取所需药材 o加 {倍量蒸馏
水浸泡 t«o电炉加热至沸 ovs°¬±后过滤 ∀药渣
再加 y 倍量蒸馏水加热至沸 ovs°¬±后过滤 ∀
合并两次滤液 o加热浓缩后离心除去沉淀 o加蒸
馏水至终浓度为每 °¯ 含生药 tª∀冰箱内保存
备用 ∀临用前在超净工作台内过滤除菌 ∀
1 q2 肺泡巨噬细胞的分离与培养 体重ktus
? {lª雄性叙利亚金黄地鼠k购自卫生部生物
制品研究所l o用 u h戊巴比妥钠kt °¯ #tssªp tl
麻醉后 o在无菌条件下剖开颈部 o暴露气管 o并
用眼科剪剪一小口 o将一特制顶端膨大的注射
器针头置入气管中 o结扎 ∀每只鼠每次用
u qx °¯ 生理盐水进行在体支气管肺泡灌洗 o共
ts次 ∀灌洗液在 tussµ#°¬±p t离心 ts°¬±后弃
掉上清 o将沉淀的细胞混悬于含 ts h新生牛血
清的 • ° Œ tyws培养基kŠ¬¥¦²r…• l中 o并用
培养基调整细胞数为 x ≅ tsx 个r °¯ ∀将细胞接
种于内置盖玻片的 tu孔培养板中 o每孔 t °¯ o
在 vz ε ox h ≤ ’u培养箱中培养 u«后 o洗去未贴
壁细胞 o取单层细胞作非特异性脂酶染色鉴定
肺泡巨噬细胞及胎盼蓝染色显示细胞存活率在
|s h以上 ∀然后每孔加入含 ts h 新生牛血清
的 • ° Œ tyws培养基 t °¯ o并分为以下 {组行
细胞培养 }单纯培养基培养组 ~脂多糖 °≥k∞¶2
¦«¨µ¬¦«¬¤¦²¯¬stuz }…{ o≥¬ª°¤l刺激组ktsΛª#
°¯ p tl ~°≥ktsΛª# °¯ p tl与肺舒灵共孵育小剂
量kxs°ª# °¯ p tl组 ~°≥ktsΛª# °¯ p tl与肺舒灵
共孵育中剂量 ktss°ª# °ªp tl ~°≥ ktsΛª#
°ªp tl与肺舒灵共孵育大剂量kuss°ª# °ªp tl
组 ~°≥ktsΛª#°ªp tl刺激 y«后再加肺舒灵小
剂量kxs°ª# °¯ p tl组 ~°≥ktsΛª# °¯ p tl刺激 y«
3 国家/九五0科技攻关课题 ‘²q|y2|sy2su2tu
#y{y# 中国中药杂志 t|||年第 uw卷第 tt期
后再加肺舒灵中剂量ktss°ª# °¯ p tl组 ~°≥
ktsΛª# °¯ p tl刺激 y«后再加肺舒灵大剂量
kuss°ª# °¯ p tl组 ∀
1 q3 上清液收集及盖玻片贮存 以上各实验
组细胞在培养 uw«后 o吸取上清液至微量离心
管中 o每管中加蛋白酶抑制剂苯甲基氟磺酸至
t°°²¯#pt o以防蛋白酶对 × ‘ƒ2Α的降解 ∀上
清液及保留于 tu孔培养板中的上有肺泡巨噬
细胞贴壁生长的盖玻片均于 p us ε 保存备用 ∀
1 q4 ∞Œ≥„法测定上清液中 × ‘ƒ2Α含量 按
× ‘ƒ2Α ∞Œ≥„检测试剂盒k军事医学科学院邦
定生物医学公司l说明书要求 o建立 × ‘ƒ2Α标
准曲线 o分别将各实验组上清液加于 |y孔酶标
板ktssΛ¯r孔l o每个样品加两孔 o取两孔平均值
进行计算 ∀用酶标仪 k≥× „ƒ2ƒ„÷utssl在
wxs±°下测定 × ‘ƒ2Α含量k³ª# °¯ p tl ∀
1 q5 原位杂交技术检测 × ‘ƒ2Α °• ‘„ 将有
肺泡巨噬细胞贴壁生长的盖玻片从 p us ε 取
出 o°…≥洗 u次 o每次 v°¬±ow h 多聚甲醛固定
us ∗ vs°¬±os qu°²¯ #p t ‹≤¯ ts°¬±otΛª# °¯ p t
蛋白酶 Žk  ∞• ≤Žlus°¬±o逐级酒精脱水 ∀盖
玻片干燥后 o滴加适量含有生物素标记的 × ‘ƒ2
Α¦• ‘„ 探 针 k × ‘ƒ 2 Α¦• ‘„ 探 针 长 度 为
s q|Ž¥o系由 × ‘ƒ2Α¦⁄‘„经体外转录而获得 o
由北京医科大学基因诊断中心提供l的杂交液
kxs h 甲酰胺 oxs°°²¯ ∞⁄× „ os qv°²¯ ‘¤≤¯o
us°°²¯ ×µ¬¶2‹≤ l¯ o置湿盒中 wu ε 杂交 tu«∀系
列 ≥≥≤ 洗涤 ov h ‹u’u 阻断内源性过氧化物酶
x°¬±o滴加适量 tΒxs稀释的链酶亲合素r过氧
化物酶结合物k≥° oŠ…Œlvz ε 孵育 vs°¬±∀ ⁄„…
显色 !苏木素复染 !逐级酒精脱水 !二甲苯透明
后封片 o显微镜下观察并对 × ‘ƒ2Α °• ‘„阳性
细胞进行定量 ∀每实验组中各计数 v 张盖玻
片 o每张中计数 tss个细胞 o结果以阳性细胞所
占百分率表示≈t  ∀
1 q6 统计学分析 采用 ≥°≥≥ ©²µº¬±§²º¶y qs
进行组间 τ检验 o结果以 ξ ? σ表示 ∀
2 结果
2 q1 /肺舒灵0对上清液中 × ‘ƒ2Α含量的影响
当向培养基中加入 °≥进行刺激后 o上清液
中 × ‘ƒ2Α含量明显高于单纯培养基培养组k Π
 s qstl ~当向培养基中加入中药肺舒灵k°≥
与肺舒灵共孵育组和 °≥刺激 y«后再加肺舒
灵组l后 o上清液中 × ‘ƒ2Α含量明显低于 °≥
刺激组k Π s qstl o且呈剂量依赖关系 ~与单纯
培养基培养组相比无明显差异k Ё s qsxl ∀见
表 t ∀
2 q2 /肺舒灵0对巨噬细胞 × ‘ƒ2Α °• ‘„表达
的影响 单纯用培养基对巨噬细胞进行培养
时 o即见部分巨噬细胞胞浆中有 × ‘ƒ2Α °• ‘„
表达 o阳性细胞胞浆呈棕黄色 ∀当向培养基中
加入中药肺舒灵k°≥ 与肺舒灵共孵育组和
°≥刺激 y«后再加肺舒灵组l后 o巨噬细胞
× ‘ƒ2Α °• ‘„表达阳性细胞数明显低于 °≥
刺激组k Π s qstl o且呈剂量依赖关系 ∀但与
单纯培养基培养组相比无明显差异k Π 
s qsxl ∀见表 t ∀
表 t 肺舒灵对肺泡巨噬细胞产生 × ‘ƒ2Α的影响
组别 剂量 °ª# °¯ p t × ‘ƒ2Α含量 ³ª# °¯ p t × ‘ƒ2Α °• ‘„表达 h
°≥刺激组 uy quw ? u qu{ zt qss ? v qyt
单纯培养基组 ts qs{ ? v qwztl wy qss ? v qsstl
°≥与肺舒灵共孵育 xs | qx{ ? u qvtt oul xt qss ? u qyxt oul
tss { qwv ? t qw|t oul wt qyz ? w qxtt oul
uss z q{s ? t qwut oul vw qvv ? { q|yt oul
°≥刺激后加肺舒灵 xs tv qu{ ? v qyxt oul xt qyz ? v quut oul
tss tu qvs ? t qzwt oul xs qss ? v qytt oul
uss { q|y ? t q|ut oul ws qyz ? u qxut oul
注 }ξ ? σ 与 °≥刺激组相比 tl Π s qst 与单纯培养基培养组相比 ul Ё s qsx
#z{y# 中国中药杂志 t|||年第 uw卷第 tt期
3 讨论
≤ ’°⁄是常见病 !多发病 o其发病机制尚不
清楚 ∀目前认为 o弹性蛋白酶r抗弹性蛋白酶系
统失衡 !肺及气道内炎症等是 ≤ ’°⁄的主要发
病因素≈u  ∀研究表明 o≤ ’°⁄患者痰液中 × ‘ƒ2
Α含量明显增高 o肺及气道内及肺泡灌洗液中有
多量的以中性白细胞 !巨噬细胞为主的炎细胞
存在≈v  ∀ ≥∏¯®²º¶®¤及 ≤²±µ²¼等通过动物实验
发现≈w ox  o× ‘ƒ2Α对于肺气肿的形成和肺内炎细
胞的浸润起非常重要的作用 ∀临床实验也发
现 o应用 × ‘ƒ2Α抗体或可溶性 × ‘ƒ2Α受体治
疗 o可明显减轻炎症性病变的程度 o使肺内
× ‘ƒ2Α水平下降 yu h o肺内中性白细胞数下降
xx h ≈y  ∀因此 o抑制肺泡巨噬细胞产生过量的
× ‘ƒ2Α或促使高水平的 × ‘ƒ2Α降解 o可以减轻
肺内炎症程度 o减少中性白细胞弹性蛋白酶和
基质金属蛋白酶的含量 o抑制肺基质的降解和
破坏 o从而对肺组织起到保护作用 o阻止和减轻
≤ ’°⁄的发生和发展 ∀
祖国医学中将 ≤ ’°⁄归之于 / 咳嗽0 !/ 痰
饮0 !/喘症0 !/肺胀0等范畴 o其病机以正气虚弱
为本 o痰饮 !血瘀 !气滞等邪实为标 o其治则宜固
本理气 !化痰祛瘀 ∀肺舒灵由桔梗 !当归 !地龙 !
莱菔子等 z味药组成 o具有固本理气 !化瘀祛瘀
之功效 ∀经临床观察 o其对 ≤ ’°⁄有较好的防
治作用 ∀但其作用机制尚不清楚 ∀本实验中应
用大肠杆菌内毒素 °≥对支气管肺泡灌洗液中
肺泡巨噬细胞进行刺激后发现 o细胞中 × ‘ƒ2Α
°• ‘„转录明显增加 o培养液上清中 × ‘ƒ2Α含
量明显升高 ∀提示 °≥可明显促进肺泡巨噬细
胞 × ‘ƒ2Α °• ‘„ 的转录和 × ‘ƒ2Α的合成 ∀当
向培养基中同时加入 °≥和不同剂量的肺舒灵
时 o可见 × ‘ƒ2Α °• ‘„转录产物和 × ‘ƒ2Α蛋白
含量明显下降 o且呈剂量依赖关系 ∀当应用
°≥刺激 y«后再向培养基中加入不同剂量的
肺舒灵时 o亦可见到 × ‘ƒ2Α °• ‘„ 转录产物和
× ‘ƒ2Α蛋白含量有较明显的下降 o并有剂量依
赖关系 ∀以上结果提示 o肺舒灵既可在转录水
平抑制 × ‘ƒ2Α的转录 o又可在蛋白水平促进
× ‘ƒ2Α的降解 ∀由此可见 o降低肺内 × ‘ƒ2Α含
量 o减轻 × ‘ƒ2Α介导的肺组织损伤 o可能是/肺
舒灵0对 ≤ ’°⁄发挥防治作用的机制之一 ∀
4 参考文献
t פ√µ¨¶o• ¤±ª²² „ o⁄¬¯º²µ·« ° o¨·¤¯ q׫¤¯¬§²°¬§¨ • §¨∏¦¨
×∏°²µ ‘¨¦µ²¶¬¶ ƒ¤¦·²µ2Α °µ²§∏¦·¬²± ¥¼ ‹∏°¤± „ √¯ ²¨¯¤µ
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·¨µ¯¨ ∏®¬±2{ ¤±§ ×∏°²µ ‘¨¦µ²¶¬¶ƒ¤¦·²µ2Α¬± Œ±§∏¦¨§ ≥³∏·∏°
©µ²° °¤·¬¨±·¶º¬·« ≤«µ²±¬¦’¥¶·µ∏¦·¬√¨°∏¯°²±¤µ¼ ⁄¬¶¨¤¶¨ ²µ
„¶·«°¤q„ °  • ¶¨³¬µ≤µ¬·≤¤µ¨  §¨ot||y otxvkul }xvs
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‘¨¦µ²¶¬¶ ƒ¤¦·²µ2¤¯³«¤ Œ±§∏¦¨¶ ∞°³«¼¶¨ °¤2¯¬®¨ °∏¯°²±¤µ¼
׬¶¶∏¨ • ¥¨∏¬¯§¬±ª ≤«¤±ª¨¶¬± ×¼³¨ ŒŒ „ √¯ ²¨¯¤µ ∞³¬·«¨ ¬¯¤¯
≤¨¯ ¶¯q°²¯  °¤·«²¯ ot||z ow{kvl }tz|
x ≤²±µ²¼ ⁄  oƒµ¤±¦¬¶¦«¬‘o≥¬µ²¬¶° q∞©©¨ ¦·²© ×∏°²µ‘¨¦µ²2
¶¬¶ ƒ¤¦·²µ • ¦¨¨³·²µ…¬±§¬±ª °µ²·¨¬± ²± ≤¨¯¯ Œ±©¬¯·µ¤·¬²± Œ±2
§∏¦¨§¥¼ ¬³²³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ¤±§ ≥ ³¨«¤§¨ ¬ …¨ ¤§¶¬± Š∏¬±¨ ¤
°¬ª∏±ªqŒ±©¯¤°°¤·¬²±ot||x ot|kul }uvv
y • ²ª¼  „ o„∏©©¨ ±¥¨µª × o∞¶³¤·‘o¨ ·¤¯ q‹∏°¤± ×∏°²µ
‘¨¦µ²¶¬¶ ƒ¤¦·²µ • ¦¨¨³·²µk °xxl ¤±§ Œ±·¨µ¯¨ ∏®¬±2ts Š ±¨¨
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