全 文 ：野葛毛状根的诱导及离体培养
刘传飞t o李 玲u o施和平u o潘瑞炽u o于树宏u
kt q江西农业大学农学院 o江西 南昌 vvsswx ~u q华南师范大学生物系 o广东 广州 xtsyvtl
≈摘要  目的 }野葛毛状根的诱导和无激素离体培养 ∀方法 }用含超强毒性基因的发根农杆菌 • tyst与野葛
离体叶片共培养 ∀结果 }经感染的野葛叶片表面直接形成大量生长快 !分枝多 !负向地性的毛状根 o毛状根离体培
养具有抗卡那霉素特性和激素自给特性 ∀结论 }建立了发根农杆菌诱导野葛毛状根的方法和野葛毛状根的离体培
养系统 ∀
≈关键词  野葛 ~毛状根 ~离体培
≈中图分类号 ≥xyz ≈文献标识码 … ≈文章编号 tsst2xvsukusssls|2sxux2sv
野葛 Πυεραρια λοβαταk • ¬¯¯§ql’«º¬是豆科葛属
Πυεραριαε 植物 o系常用中药 o药用部位为块根k葛
根l o其主要有效成分是葛根素 !大豆甙和大豆甙元
等异黄酮类次生代谢物 o具有解表去热 !生津止泻 !
健脾等功效 o临床上用于治疗心律失常 !心绞痛 !高
血压 !冠心病等 o日常饮用有提高肌体免疫和大脑记
忆能力 !改善视力等作用 o市场需求较大 o大量挖取
野生葛根 o造成植被破坏 !资源严重浪费 o而栽培野
葛品种退化 !病虫害滋生 !品质也不稳定≈t ∗ v  ∀
发根农杆菌是根瘤菌科 Ρηιζοβιαχεαε 农杆菌属
Αγροβαχτεριυ µ 的革兰氏阴性细菌 o能够侵染双子叶
植物 o并在侵染部位形成大量生长迅速 !多分枝 !负
重力向性的毛状根k«¤¬µ¼µ²²·l o毛状根的形成是发
根农杆菌所携带的根诱导质粒k•¬l上的 ×2⁄‘„ 转
化的结果 o由于毛状根生长迅速 o能够在无激素培养
基上生长 o因此毛状根培养已成为近年来发展起来
的生产有用次生代谢物的培养系统 o已在人参皂甙 !
紫草素等的生产上成功应用 o同时毛状根的次生代
谢与正常根相似 o因此该培养系统特别适合根用次
生代谢物的产生≈w  ∀本文报道初步建立的野葛毛状
根诱导和离体培养系统 o为野葛资源的可持续开发
利用提供基础 ∀
1 材料与方法
111 菌种特性与活化
发根农杆菌 • tyst为农杆碱型 o具有质粒 ³•¬
≈收稿日期  t|||2tu2sy
≈资助项目  广东省重点科技项目资助k≥|{svxtl和江西自然
科学基金k≥||wstl
„w¥o并在其中的 ‹¬±§¶片段 ut上整合有 ±³·µ基
因 o染色体背景与 ≤x{相同 o该菌还具有超致病根癌
农杆菌 ³×¬…sxwu粘性质粒 ³× ∂ Žu|t的 ∂¬µ区≈x  ∀
从斜面培养基上挑取单菌落接种于 ≠ ∞…k³‹ z1s o
tss °ª#pt卡那霉素l液体培养基中 oux ε o暗培养
vy «otus µ#°¬±p tkts°¬±l离心沉淀菌液 o用  ≥液
体培养基稀释菌液 o测菌液吸收度 Κyss °°为 s q{左
右 o作为活化菌液备用 ∀
112 植物材料
于 ts 月底在华南师范大学植物园采集野葛
Πυεραρια λοβαταk • ¬¯¯§ql ’«º¬未开荚的成熟荚果 o
洗净 o在超净工作台用 s1t h升汞消毒 us °¬±o无菌
水洗 v次 o取出种子 o置于内垫纱布 o盛少量水的三
角瓶中萌发 o条件为温度 u{ ε o光强 u sss ¬¯o光暗
交替 tyrt{«o生长 us §左右 o苗高约 y ∗ { ¦° o切取
无菌苗中部叶片备用 ∀
113 外植体转化
在超净工作台随机取叶片分为 u等份 o一份置
于有活化菌液的三角瓶中 o流程如下 }外植体和活化
菌液kΚyss °° € s q{l混匀 ts °¬± ψ取出外植体 o滤纸
吸干菌液 ψ置于无激素  ≥培养基上 u §ψ置于 xss
°ª#p t头孢霉素  ≥ 培养基上 u §ψ置于无激素
 ≥培养基上 ψ外植体上分化出毛状根 ∀另一份为
对照 o除不与发根农杆菌接触外 o其余操作均相同 ∀
114 毛状根的统计
叶片感染 t个月后统计毛状根 o毛状根诱导率
€产生毛状根的外植体数r接种的外植体数 o毛状根
诱导密度 €产生毛状根的总数r产生毛状根的外植
体数 o毛状根负重力向性率 €向上生长的毛状根数r
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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≥ ³¨qousss
毛状根总数 ∀
115 毛状根在固体培养基上生长及抗卡那霉素特
性
切取野葛毛状根根尖 u ∗ v ¦°长置于添加有不
同浓度卡那霉素的  ≥ 固体培养基上 o每处理 vss
个毛状根根尖 o观察离体根的生长情况 ∀
116 毛状根液体培养
将除菌的野葛毛状根根尖 vs 个k约 vs °ª鲜
重l接种于txs °¯ 三角瓶中 o内装wx °¯ o³‹x qz o
tru  ≥液体培养基 o暗培养温度 u{ ε o摇瓶转速
tts µ#°¬±p t o每周称重 o每处理重复 w次 ∀
2 结果
211 野葛毛状根的形成及观察
野葛外植体与农杆菌共培养初期 o在培养基与
外植体接触面有明显菌斑生长 o为此 o将外植体用无
菌水稍洗 o用灭菌滤纸吸干水分后 o置于 xss °ª#
pt头孢霉素  ≥培养基上除菌 o培养 u §未见农杆
菌菌斑后转移到  ≥培养基上 o叶片在感染的第 { §
起有轻微的皱缩反应 o并伴有白色点状突起 ots §后
陆续分化出明显的白根 o大多数根直接从叶片表面
长出 o不经愈伤组织过程 o根分化的部位多数集中在
叶脉维管束组织附近 o多数根呈密集丛生状k图 tl ∀
图 t 发根农杆菌处理的
野葛离体叶片上产生的大量毛状根
毛状根的形成高峰期在第 tv ∗ t{天 o此后逐渐
下降 o毛状根形态纤细 !色白 o在根尖 t ¦°左右有点
状膨大 o并由此产生分枝 o根毛少 o有明显负重力向
性 ∀毛状根在形成的最初 x §生长很快 o此后急剧
减慢 o根基部逐渐褐化 o最后毛状根会停止生长 o干
燥卷曲死亡 ∀
感染 w周后外植体不再有新毛状根的分化 o此
时毛状根的诱导率为 ty1y h o毛状根诱导密度为
tu1u o毛状根负重力向性率为 xx1u h ∀
转化的离体叶片在培养过程中一直维持绿色 o
当毛状根形成后 o在毛状根着生部位会逐渐褐化 o但
非毛状根着生部位仍然保持绿色 o而非转化的离体
叶片在培养过程中逐渐变黄 !褐化 o最终死亡 ∀
212 野葛毛状根在固体培养基上生长及抗卡那霉
素特性
最初从外植体上切取的毛状根根尖 o培养在固
体培养基上仍有菌斑产生 o为此 o先将毛状根置于
uxs °ª#p t头孢霉素的  ≥培养基上除菌 u §o然后
接种于含不同浓度卡那霉素的  ≥固体培养基上 ∀
野葛毛状根离体后大多数能够在无激素  ≥培
养基上迅速生长 o而正常根k种子萌发根系l离体后
在无激素条件下完全不能生长 o全部死亡k表 tl ∀
表 t 野葛毛状根和正常根在不同浓度卡那霉素
 ≥固体培养基上的存活率
卡那霉素浓度r°ª#p t 毛状根r h 正常根r h
s {{ qxk|{ qul sk{y qyl
us {u quk{y qxul sktu qxl
ws zw qykzu qxl sksl
ys ww qukw{ qyl sksl
{s vx qykvy qul sksl
tss s qsksl sksl
注 }括号中的数据为培养基中添加了 s1t °ª#p t 乙酸的结果
为了比较野葛毛状根和正常根的抗卡那霉素能
力 o为此向培养基中添加 s1t °ª#pt 乙酸 o则大
多数正常根也能生长k表 tl o但正常根生长缓慢 o容
易褐化 o而毛状根离体后仍生长迅速 o且伴有分枝产
生或负重力向性 ∀在 us °ª#p t卡那霉素浓度下 o
正常根大部分死亡 o直到 ws °ª#p t卡那霉素浓度
下 o正常根全部死亡 o而此浓度的卡那霉素条件下 o
毛状根大部分存活 o表现出明显的对卡那霉素抗性 o
培养基中添加 乙酸与否对毛状根在卡那霉素条件
下的存活率没有明显影响 ∀
213 野葛毛状根在液体培养基中的生长动态
由于不同的野葛毛状根系生长速率差异较大 o
为此选择生长较快的野葛毛状根系 ‹ • v 进行液体
培养试验 o其生长过程中每周的干鲜重结果如表 u ∀
野葛毛状根在第 t周生长缓慢 o这期毛状根离
体后有一个适应时间 o同时由于生长的基数小 o生物
量增加少 o第 u ov周期间 o毛状根生长速率最快 o生
物量增加最快 ∀在培养的第 w周期间 o毛状根生长
速率减慢 o但由于生长基数较大 o生物量仍增加明
显 o此时毛状根的鲜重是其接种量的 txu倍 ∀第 w
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qux o‘²q|
≥ ³¨qousss
表 u 野葛毛状根系 ‹ • v
在液体培养过程中每瓶生物量的变化 °ª
周数 干重 鲜重
s v1u vs
t tt1u tux
u tvu1x tuxs
v wuu1x v{xs
w w{v1y wxys
x w|x1x wy{s
y w{s1s wxus
周后毛状根生长缓慢 o生物量增加很少 o毛状根老化
明显加剧 o直到第 x周毛状根已停止生长 o其干重 !
鲜重甚至出现负增长 ∀
3 讨论
发根农杆菌能够诱导野葛外植体产生毛状根 o
而非诱导外植体不生根 o说明野葛对发根农杆菌敏
感 o以毛状根诱导率为判断转化效率指标 o发根农杆
菌对野葛的转化效率仍偏低 o有待进一步提高 ∀
•¬×2⁄‘„上携带有生长素合成基因 ¤∏¬ t o¤∏¬
v o¤∏¬u和分解卡那霉素基因 ±³·µ o因此 o离体毛状
根能够在无激素培养基上或含有卡那霉素的培养基
上正常生长 o表现出明显的激素自养性和抗卡那霉
素特性 o这些特性也常用于发根农杆菌转化实验中
筛选转化子≈y  ∀外源生长素的添加对毛状根抗卡那
霉素的能力没有明显影响 o表明生长素类物质不参
与对卡那霉素的抗性作用 ∀
植物组织 !器官 !个体的生长表现出 ≥型的生长
大周期特性 o离体野葛毛状根的生长也符合这一生
长大周期特性≈z  ∀野葛毛状根根尖在培养的第 t周
主要进行旺盛的细胞分裂生长 o生物产量增加较慢 o
随后毛状根进入一个以快速伸长生长为主的时期 o
表现为生物量急剧增加指数生长期 k ¬¨³²±¨ ·¬¤¯
ªµ²º·«³«¤¶¨lk第 u ov周l o然后毛状根主要进行分
化生长k第 w周及以后l o毛状根老化k褐化l加剧 !生
长减慢 o甚至停止生长 o进入所谓的停止生长期k¶·¤2
·¬²±¤µ¼ ªµ²º·«³«¤¶¨lk第 x周以后l o生物量的增加
不及代谢消耗 o导致生物量净减 ∀毛状根培养过程
中各生长时期的长短与植物基因型有关 o缬草 ςα2
λεριανα οφφιχιναλισq毛状根的指数生长期可达 w ∗ y
周 o而败酱草 Χεντραντηυσ ρυβερ ⁄≤ q毛状根在第 u
周进入指数生长期 o指数生长期只 u周 o产生的生物
量占 wx §培养期的 {s h以上≈z  ∀此外 o培养容积 o
培养过程中氧气 !营养元素供应状况 o代谢产物的抑
制等均对毛状根生长动态有不同程度的影响≈{  ∀
本实验中野葛毛状根系 ‹ • v 生长迅速 o经过 t
代以上的无激素继代培养 o性状稳定 o有待进一步大
规模培养的研究 ∀
≈参考文献 
≈t  于树宏 o李 玲 q野葛的组织培养和植株再生 1 植物资源与环
境 ot||| o{ }yw1
≈u  刘传飞 o李 玲 o施和平 o潘瑞炽 1 生长素和细胞分裂素类物质
对野葛器官发生的影响 1 华南师范大学学报 ot||| okul }tss1
≈v  郭建平 o孙其荣 o周 全 1 葛根药理作用研究进展 q中草药 o
t||x ouy }tyv1
≈w  周立刚 o王君健 o杨崇仁 1 植物毛状根的培养及其化学进展 1
天然产物研究与开发 ot||{ ots }{z1
≈x  施和平 o李 玲 o潘瑞炽 1 发根农杆菌对黄瓜的遗传转化 1 植
物学报 ot||{ ows }wzs1
≈y  刘传飞 o潘瑞炽 o李 玲 o等 1 几种抗生素对野葛外植体生长的
影响 1 中国植物学会第 yx周年会议论文摘要汇编 1 北京 }中
国林业出版社 ot||{ owvs1
≈z  Šµ¤±¬¦«¨µƒ o≤«µ¬¶·¨± ° oŽ¤³¨·¤±¬§¬¶Œq°µ²§∏¦·¬²± ²© ∂ ¤¯ ³¨²·µ¬¤·¨¶
¥¼ ‹¤¬µ¼ • ²²·≤∏¯·∏µ¨¶²© Χεντραντηυσρυβερ ⁄≤ q°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨o
t||x otw }u|w q
≈{  Ž¤±²®º¤µ¨¨ Žo⁄²µ¤± °  q׫¨ ∞¬·¨±··² º«¬¦«∞¬·¨µ±¤¯ ’¬¼«µ±
×µ¤±¶©¨ µ¯¬°¬·¶ Šµ²º·«¬± ≥«¤®¨ ƒ¯ ¤¶® ≤∏¯·∏µ¨ ²© ‹¤¬µ¼ • ²²·¶q
…¬²·¨¦«±²¯ …¬²¨ ±ªot||z oxx }xut q
Ηαιτψ Ροοτ Ινδυχφιον ανδ ιν ςιτρο Χυλτιϖατιον οφ Πυεραρια λοβατα Ωιλλα . Οηωι
Œ˜ ≤«∏¤±2©¨ t¯ oŒ ¬±ªu o≥‹Œ ‹ 2¨³¬±ªu o°„‘ • ∏¬2¦«¬u o≠ ˜ ≥«∏2«²±ªu
kt q„ªµ²±²°¼ ≤²¯¯¨ ª¨ ²©¬¤±ª¬¬„ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ o‘¤±¦«¤±ªvvsswx ¬¤±ª¬¬o≤«¬±¤~
u q…¬²¯²ª¼ ⁄¨ ³¤µ·° ±¨·²©≥²∏·« ≤«¬±¤ ‘²µ°¤¯ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ oŠ∏¤±ª½«²∏ xtsyvt o Š∏¤±ª§²±ªo≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏¤·«¨ «¤¬µ¼ µ²²·¬±§∏¦·¬²± ¤±§ «²µ°²±¨ 2©µ¨¨¬± √¬·µ² ¬¯´∏¬§¦∏¯·¬√¤·¬²± ²©
Πυεραρια λοβατα k • ¬¯¯§l ’«º¬q Μετηοδ : ≤²2¦∏¯·¬√¤·¬²± ²©¶∏³¨µ2√¬µ∏¯ ±¨·Αγροβαχτεριυ µ ρηιζογενεσ • tyst
k下转第 xvx页l
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表 t 样品中大黄素加样回收率测定结果
样品量
r°ª
添加量
r°ª
测出量
r°ª
回收率
r°ª
平均回收率
r°ª
ΡΣ∆
r°ª
s quwuu s qs|uu s qvvsy |x q{{
s quxsu s qtuu| s qvy{u |y qst
s quxsw s qtxvy s qv|zv |x qyw |y q|s

t quxs quy{w s qt{wv s qwwzz |z qu|
s quzzs s qutxs s qw{{u |{ quv
s quwtx s quwx{ s qw{vu |{ qvv
注 }ν € y
219 提取方法的研究
制备供试品溶液时 o提取条件的选定是参考
t||x年版5中国药典6一部虎杖含量测定项下的提
取方法 o我们曾考察了不同酸度ku1x ov1s °²¯#pt
及不同酸水解时间kt ot1x «l对含量测定结果的影
响 o结果 u1x °²¯#pt硫酸溶液水解 t1s «能够使结
合型大黄素完全水解 ∀
2110 含量测定
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液 ts Λ¯ o
按上述色谱条件测定 o外标一点法计算含量 o结果见
表 u ∀采用了与成品制剂相同的测定方法对制何首
乌中的大黄素进行含量测定 o结果见表 v ∀
表 u ts批乐得胶囊中大黄素含量测定结果
批号 含量r°ª#ªp t ΡΣ∆r h
|zsvtt t qsust t qxv
|zsws{ s qwztu t q|{
|zswty s qxtyy u qv{
|zswuv s qw|{x u qtz
|zszs{ s qz{xs t qsy
|{ttsw s q{|vx t qzz
|{ttt| s qtxw| v q{u
|{tutu s qw|{y u qx{
|{tut| s qxs|{ t qzy
|{tuuz s qxvwu t q|v
注 }ν € v
表 v 制何首乌药材中总大黄素含量测定结果
批号 来源 含量r°ª#ªp t ΡΣ∆r h
|zst 四川 t qx|w t qxw
|zsu 重庆 s qzwu t qz{
|zsv 贵州 t qtzv t q{x
|{st 成都 t qvzx t qz|
|{su 云南 s qtx| t q|u
|{sv 四川 s qy|{ t qyy
注 }ν € v
3 讨论
311 何首乌含大黄素 !大黄酚 !大黄酸 !大黄素甲醚
等多种蒽醌类化合物等 o我们曾用薄层扫描法对原
药材制何首乌及成品制剂中游离蒽醌中大黄素进行
含量测定 o虽经反复试验 o均未获得理想结果 ∀之
后 o采用高效液相色谱法测定样品所含总大黄素的
含量方法 o取得满意效果 ∀该法灵敏 !可靠 o可作为
该样品的含量测定方法 ∀
312 流动相的 ³‹ 值对实验有较大的影响 o因为蒽
醌类化合物呈弱酸性 o在酸性条件下色谱行为得到
明显改善 o采用 s1t h磷酸代替水取得了较好的分
离效果 o与文献报道一致≈t ou  ∀在选择检测波长时 o
通常蒽醌类的检测波长选用 uxw ±° o但用于成品检
测不够理想 o尚未达到基线分离 o而选用 wvz ±°
时 o蒽醌吸收良好 o可排除共存药材及杂质的干扰 o
分离度好 ∀
≈参考文献 
≈t  大岛俊幸 o平山总良 o王 柯 o等 1 高效液相色谱法测定何首
乌和夜交藤中蒽醌类成分的含量 1 药物分析杂志 ot||y oty
kwl }ut| q
≈u  吴振洁 o王丹平 o顾以振 o等 1 反相高效液相色谱法测定首乌
喘息灵胶囊中大黄素的含量 1 中国药科大学学报 ot||z ou{
kul }tuv q
≈责任编缉 李 禾 
k上接第 xuz页l
º¬·« Π. λοβατα ¯¨ ¤√ ¶¨¬± ∏¬·µ²qΡεσυλτσ: ‹¤¬µ¼µ²²·¶²©µ¤³¬§ªµ²º·«o«¬ª«¥µ¤±¦«¨¶¤±§³¯¤ª¬²·µ²³¬¶° §¨ √¨¯²³¨ §
√¬ª²µ²∏¶¯¼ ²±·«¨ ¶∏µ©¤¦¨ ²©¯¨ ¤√ ¶¨o ¬¨«¬¥¬·¬±ªµ¤³¬§ªµ²º·«¤±§µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ·²®¤±¤°¼¦¬±¬± «²µ2°²±¨ 2©µ¨¨ ° §¨¬2
∏°¬± √¬·µ²qΧονχλυσιον : „ ° ·¨«²§²©«¤¬µ¼ µ²²·¬±§∏¦·¬²± º¬·« Α . ρηιζογενεσ ¤¶º¨¯¯¤¶¤¶¼¶·¨° «¤¬µ¼ µ²²·
¬¯´∏¬§¦∏¯·¬√¤·¬²±¬± ∏¬·µ²©²µΠ.λοβατα «¤√¨¥¨ ±¨ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨ §q
[ Κεψ ωορδσ] Πυεραρια λοβατα ~«¤¬µ¼ µ²²·~¦∏¯·¬√¤·¬²±¬± √¬·µ²
≈责任编辑 王康正 
#xvx#
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≥ ³¨qousss