全 文 ：农杆菌介导转化法构建转 ≤ × ∂2¦³的枳壳植株
贺 红t o韩美丽u o李耿光v
kt1 广州中医药大学 中药所 o广东 广州 xtswsx ~
u1 广西林业科学研究院 o广西 南宁 xvssst ~
v1 中国科学院 华南植物研究所 o广东 广州 xtsyxsl
≈摘要  目的 }采用农杆菌介导法 o将能抑制病毒侵染的外壳蛋白基因转入枳壳 o为通过基因转化进行枳壳的
抗病育种提供依据和方法 ∀方法 }以枳壳实生苗上胚轴为材料 o农杆菌菌株为 ∞‹„tst o含有质粒载体 ³Š„w{uŠŠ ∀
质粒上插入了 vx ¶启动子驱动的外源目的基因 ) ) ) 柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因k≤ × ∂2¦³l及 Š˜≥ o‘°× µ基因 ∀
结果 }枳壳转化试验中 o抗菌素采用头孢霉素较好 o浓度为 vss °ª#p t ~以卡那霉素作为选择试剂 o浓度为 xs °ª#
p t ~转化获得的抗性植株 oŠ˜≥检测结果 ozs qs h的植株呈阳性反应 ~≥²∏·«¨µ± 杂交分析k≥²∏·«¨µ± ¥¯²·l鉴定证明
外壳蛋白基因已整合到枳壳植株的核基因组中 ∀结论 }通过农杆菌介导的转化法 o成功地获得了转外壳蛋白基因
的枳壳植株 ∀
≈关键词  枳壳 ~外壳蛋白基因 ~植物转化
≈中图分类号  ≥ xyz ~≥ ysv qy ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstl2st2ssut2sv
枳壳 Πονχιρυστριφολιατα • ¤©q为芸香科植物 o其
幼果及成熟果实入药 ∀枳壳生产中面临一种由病毒
引起的衰退病 o它由蚜虫传播 o目前的防治措施主要
是烧毁病株 !喷洒农药杀灭蚜虫以切断传染源 o但不
能从根本上解决问题 ∀遗传转化技术是近年来兴起
的一项新型生物育种技术 o利用该技术可将衰退病
病毒外壳蛋白k≤ × ∂2¦³l 编码基因转入受体 o利用交
叉保护原理 o起到抑制 !减轻病毒侵染的作用≈t  ∀我
们采用农杆菌介导法 o将外壳蛋白基因转入枳壳 o为
通过基因转化进行枳壳的抗病育种提供依据和方
法 ∀
1 材料与方法
111 植物材料 枳壳种子经表面消毒培养无菌苗 o
当苗长至一定大小时 o采取上胚轴切成约 t ¦°长的
小段作转化的外植体 ∀
112 细菌菌株及培养 农杆菌菌株为 ∞‹„tst o含
有质粒载体 ³Š„w{uŠŠ ∀质粒上插入了 vx ¶启动子
驱动的外源目的基因 ) ) ) 柑桔衰退病病毒外壳蛋白
基因k≤ × ∂2¦³l及 Š˜≥ o‘°× µ基因 o基因全长 yy|
¥³o插入位点为 ΝχοŒ位点k图 tl ∀
农杆菌菌株在含 xs °ª# pt 卡那霉素
kŽ¤±¤°¼¦¬±oŽ°l的 ≠ ∞°培养基上繁殖保存 o感染
≈收稿日期  usss2sv2ut
≈基金项目  国家自然科学基金项目kv|yzswzyl
前 o在 ≠ ∞°液体培养基中 ou{ ε 振荡 us ∗ ux «o达
到菌对数生长期k ’⁄yss € s q{ ∗ t qsl o离心沉淀
kv sss µ# °¬±p tl o然后悬浮于附加 s qt °²¯ #p t乙
酰丁香酮的  × 液体培养基中 o此菌液用于浸染 ∀
图 t 携带柑桔衰退病病毒外壳
蛋白基因k≤ × ∂2¦³l的质粒 ³Š„w{uŠŠ
• 1 右边界 1 左边界 v≥≥ ∗ vx≥1 启动子 ‹1 Ηινδ ¶
‘1 ΝχοΙ ≤ × ∂2¦³1 柑桔衰退病病毒外壳蛋白
#tu#
第 uy卷第 t期
usst年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quy o‘²qt
¤±qousst
113 外植体的转化
将枳壳上胚轴切段浸入到准备好的菌液中 us
°¬±o随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液 o将外
植体接种于  × 培养基上共培养 v §后 o再转到含
Ž° xs °ª#pt和头孢霉素k≤ ©¨²·¤¬¬°¨o≤¬lvss °ª
#p t的选择培养基上 o诱导抗性芽的产生 ∀
114 组织化学法检测 Š˜≥活性
Š˜≥组织化学染色法参见5植物遗传转化手
册6≈u  ∀
115 转基因植株的 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·分析
植物 ⁄‘„及质粒 ⁄‘„提取分别采用 ≥⁄≥法 !
碱裂解法≈v  ∀质粒 ⁄‘„经 Νχο ´酶切消化后 o采用
⁄¬Š标记法制成探针k5⁄¬ª⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§⁄¨ ·¨¦2
·¬²± Ž¬·6 ˜¶¨µ. ¶Š∏¬§¨ ot|{|l ∀
≥²∏·«¨µ± ¥¯²·分析采用 ⁄¬Š成套试剂盒试剂及
反应条件k5⁄¬ª⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª¤±§⁄¨ ·¨¦·¬²± Ž¬·6 ˜¶2
µ¨. ¶Š∏¬§¨ ot|{|l ∀植物 ⁄‘„ 经 Νχο ´酶切消化
后 ow ε 下 s q{ h琼脂糖上电泳 tu «o经变性 o转移至
‘≤膜上 ∀烘干膜后进行预杂交 !杂交及显色 ∀杂交
带预期位点为 yy| ¥³∀
2 结果与分析
211 抑菌剂的选择
在用农杆菌转化植物细胞时 o常用羧苄青霉素
和头孢霉素抑制农杆菌的过量生长 ∀试验结果表
明 o两种抗菌素在浓度为 xss °ª#p t时 o对外植体
出芽均无明显影响 ∀抑菌试验中 ovss °ª#pt的头
孢霉素能完全抑制农杆菌的生长 o而相同浓度的羧
苄青霉素杀菌效果不太好 o农杆菌仍少量生长 ∀因
此 o枳壳转化试验中 o抗菌素采用头孢霉素较好 o浓
度为 vss °ª#pt ∀
212 选择培养基中卡那霉素浓度的确定
以卡那霉素作为选择试剂 o筛选抗性芽的产生 ∀
枳壳上胚轴切段平放于加有 Ž°的培养基上 o本试
验观察了不同浓度 Ž° 对出芽的影响 ot个月后统
计结果 o当卡那霉素浓度为 s oux oxs ozx °ª#pt时 o
出芽率k h l分别为 yt qu ow qu os os ∀且可观察到 o随
着 Ž°浓度升高kxs °ª#p t以上l o外植体逐渐变
白 ∀因此以 Ž° xs °ª#p t o作为常用的选择水平 ∀
213 抗性植株的再生
外植体与农杆菌共培养后 o在选择培养基上进
行培养 o出芽过程大大延缓 ou周后 o外植体切口膨
大 ot个多月后才可看到抗性芽的产生k图 ul ∀待芽
长至 u ¦°左右 o从外植体上切下诱导生根 o生根培
养基为  × n ‘„„ t °ª#p t ∀我们用上述方法 o最
终获得了 vu株枳壳的抗性植株k图 vl ∀
图 u 在选择培养基上获得的枳壳抗性芽
图 v 枳壳抗性植株
214 转化体的鉴定
21411 Š˜≥基因表达检测 转化处理获得的抗性
植株生长 x个月后 o进行 Š˜≥基因表达活性检测 o
结果表明 ozs qs h的植株呈阳性反应 o这是茎段染色
的结果 o又取叶片进行 Š˜≥染色 o大多数呈阳性反
应 o少数不显蓝色 o说明有些植株已有稳定的 Š˜≥
基因表达 o也有些植株可能是嵌合转化体 ∀
21412 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·分析 选取具有 Š˜≥酶活性
的植株进行 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·分析 o结果见图 w ∀从分析
杂交结果显示 }{个 Š˜≥阳性无性系与质粒均在预
期的 yy| ¥³位点处出现同一条杂交带 o对照则无 o
因而可以证明 o柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因已稳
定整合到了植物基因组中 o所获得的枳壳植株确为
转基因植物 ∀
3 讨论
建立高效稳定的组织培养再生体系是利用遗传
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转化技术获得转基因植株的重要前提之一 ∀我们曾
分别用枳壳的根尖 !茎段 !叶片 !子叶及上胚轴为材
料进行离体培养 o结果上胚轴获得了最高出芽率≈w  ∀
图 w ≥²∏·«¨µ± ¥¯²· 分析转基因枳壳植株
t ∗ {1 转化枳壳植株 |1 对照 ts1 质粒 ⁄‘„ tt1 Μαρκ
本研究结果说明 o通过农杆菌介导并以无菌苗
上胚轴为受体材料的转化 o是目前获得转外源基因
枳壳植株的可靠而又能重复的方法 ∀
在用农杆菌转化植物细胞时 o常用羧苄青霉素
和头孢霉素抑制农杆菌过量生长 ∀程振东等≈x 在用
根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化中 o发现两者除了
抑制农杆菌的生长外 o还影响植物的生长发育 o头孢
霉素易于引起伤口细胞褐化死亡 o抑制芽的分化 ~而
羧苄青霉素则促进芽分化 o抑制生根 o因此他们认
为 o在转化过程的不同阶段最好用不同的抗菌素作
抑菌剂 }诱导茎芽分化时羧苄青霉素较好 o诱导生根
时头孢霉素较好 ∀而我们在枳壳转化中并没有出现
类似的结果 o头孢霉素不仅杀菌效果好 o而且对芽的
形成无不良作用 o说明抗菌素应用于不同植物类型 o
对生长发育可能有不同的影响 ∀
≈参考文献 
≈t  ∂ µ¨°¤ ⁄ ° o Š²¯§¥¨µª • …q °¯ ¤±·Š ±¨¨ • ¶¨¨¤µ¦« ר°³²µ¤¯ ¤±§
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科学技术出版社 ot||w1ty{1
≈v  孙敬三 1 植物细胞工程手册 1 北京 }中国科学技术出版社 o
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≈w  贺 红 1 枳壳组织培养和植株再生研究 1 中草药 ot||{ ou|
ktul }{uw1
≈x  程振东 o卫志明 o许智宏 1 根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及
转基因植株的再生 1 植物学报 ot||w ovyk|l }yxz1
Πλαντ Ρεγενερατιον φροµ Αγοβαχτεριυµ2µεδιατεδ ΧΤς2χπ
Γενε Τρανσφορµ ατιον οφ Πονχιρυστριφολιατα Ραφ .
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¤¯¼ ¤©²∏±§¤·¬²± ©²µ·«¨ µ¨¶¬¶·¤±·¥µ¨§¬±ªo·«¨ ¤±·¬2√¬µ∏¶ ≤ × ∂2¦³ ª¨ ±¨ º¤¶
·µ¤±¶©²µ° §¨¬±·²·«¨ ³¨¬¦²·¼¯ ¶¨ ° §¨¬¤·¨§¥¼ Αγροβαχτεριυ µ τυ µεφαχιενσ ιν Πονχιρυσ τριφολιαταq Μετηοδ : ׫¨
¬¨³¯¤±·¶∏¶¨§©²µ·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± º µ¨¨ ·«¨ ³¨¬¦²·¼¯¶©µ²° Π. τριφολιατα . ׫¨ Αγροβαχτερυ µ τυ µεφα2
χιενσ¶·µ¤¬± º¤¶∞‹„tst ¦²±·¤¬±¬±ª√ ¦¨·²µ³¯¤¶°¬§³Š„w{uŠŠ q׫¨ ¦²¤·³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ k≤ × ∂2¦³ª¨ ±¨ l oŠ˜≥ ª¨ ±¨
¤±§‘°× ŒŒ ª¨ ±¨ º µ¨¨ ¬±·µ²§∏¦¨§¬±·²·«¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ³¯¤¶°¬§qΡεσυλτσ: ≤ ©¨·¤¬¬°¨∏¶¨§¤¶¤±·¬¥¬²·¬¦¶ º¤¶
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φαχινεσ, º«¬¦««¤µ¥²∏µ¶¤ ≤× ∂2¦³ ª¨ ±¨ o«¤¶¥¨ ±¨ §¨ √¨¯²³¨ §¬± Π. τριφολιατα . ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦≤ × ∂2¦³ ³¯¤±·¶ º µ¨¨
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[ Κεψ ωορδσ] Π. τριφολιατα ; ¦²¤·³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ ~³¯¤±··µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ≈责任编辑 王康正 
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