全 文 ：云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University，2013，28 (1) :32 － 35 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 － 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2012 － 03 － 15 修回日期:2012 － 04 － 15 网络出版时间:2013 － 01 － 14 20∶ 14
* 基金项目:云南省攻关项目 (2006NG02)。
作者简介:李晓鹏 (1984 －) ，男，湖北恩施人，在读硕士研究生，主要从事花卉病毒研究。
E-mail:81738691@ qq. com
＊＊通信作者 Corresponding author:孔宝华 (1962 －) ，女，云南昆明人，教授，主要从事园艺植物病理研究。E-mail:
baohuakong@ gmail. com;陈海如 (1946 －) ，男，福建人，博士生导师，教授，从事植物病毒学研究。
E-mail:hrchen 44@ yahoo. cn
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20130114. 2014. 201301. 32_032. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 － 390X (n). 2013. 01. 006
香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的
原核表达及抗血清制备*
李晓鹏，王连春，彭杰军，姬 盼，李 准，孔宝华＊＊，陈海如＊＊
(云南农业大学 植物保护学院，农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南 昆明 650201)
摘要:香石竹斑驳病毒 (Carnation mottle virus，CarMV)是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的 CarMV毒源
植物中提取总 RNA，克隆外壳蛋白 (cp)基因后构建 pET30a-CP重组质粒，并转入 BL21 (DE3)pLysS进行原核表
达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化，目的蛋白在 37℃，IPTG 终浓度为 1. 0 mmol /L
的条件下，诱导表达 6 h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化 cp蛋白，纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异
性抗血清。经Western-blot检测，结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种 CarMV的香石竹样品均发
生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的 48 个香石竹样品进行抽检，结果表明香石竹样品的带毒率为
79. 2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒 cp基因与寄主的互作奠定基础。
关键词:香石竹斑驳病毒;外壳蛋白基因;原核表达;抗血清;检测
中图分类号:S 436. 81 文献标志码:A 文章编号:1004 － 390X (2013)01 － 0032 － 04
Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of the
Coat Protein Gene of Carnation mottle virus
LI Xiao-peng，WANG Lian-chun，PONG Jie-jun，JI Pan，LI Zhun，KONG Bao-hua，CHEN Hai-ru
(College of Plant Protection，Key Laboratory of Agriculture Biodiversity and Pest Controlling
Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China)
Abstract:Carnation mottle virus (CarMV)is one of the important viruses infecting carnation． In this
study，RNA was extracted from CarMV infected carnation，and coat protein (cp)gene was cloned into
pET30a (+)and transformed into BL21 (DE3)pLysS． The optimal conditionsor the highest expres-
sion of coat protein was expressing at 37℃ for 6 h and inducing with 1. 0 mmol /L IPTG． The expressed
protein was purified with gradient SDS-PAGE and the antiserum against the protein was raised in Kun-
ming mice． The result of Western-blot analysis confirmed that the antiserum reacted strongly and spe-
cifically recombinant CarMV cp and CarMV infected samples． Forty-eight carnation samples in Kun-
ming were tested with the antibody made in this experiment，of which 79. 2% of the samples were in-
fected by CarMV． This study provides a good basis for massive CarMV cp antiserum preparation CarMV
detection and interaction studies between CarMV and host plants．
Key words:Carnation mottle virus;coat protein gene;prokaryotic expression;antiserum;detection
香石竹斑驳病毒 (Carnation mottle virus，Car-
MV)是侵染香石竹的主要病毒之一。常造成香
石竹植株生长衰弱，花朵变小，杂色，花苞开裂
等危害，从而使其商品价值降低。CarMV 属于番
茄丛簇病毒科 (Tombusuiridae)、香石竹斑驳病毒
属 (Carmovirus)。CarMV 是该属的代表种病毒粒
子为等轴对称二十面体，直径 28 ～ 33 nm，无包
膜，表面粗糙。病毒基因组全基因长为 4 003 个
核苷酸，由 4 个开放阅读框 (open reading frame，
ORF)组成。其中 ORF1 编码 28 ku 蛋白，与
ORF1RT编码蛋白组成病毒的聚合酶;ORF2 编码
7 ku的胞间运动蛋白;ORF3 编码 9 ku 多肽，该
蛋白也能促进病毒在寄主植物中的移动［1］;ORF4
编码 38 ku 大小的外壳蛋白［2 － 3］，在体内由亚基
因组 RNA2 所表达。外壳蛋白 (coat protein，cp)
是一种单双链 DNA结合蛋白，参与病毒体内运输
或调解复制过程［4］。
由于 CarMV 常常在香石竹中累积，防控非常
困难，研究该病毒的检测检疫显得十分重要。构建
重组克隆并进行原核表达和抗血清制备是目前应用
较多的病毒检测方法和技术，这些技术可以避免病
毒提纯的麻烦和 RT-PCR的高成本。本研究以 Car-
MV的 cp为目的基因，构建其原核表达载体，通过
高效表达 CarMV的 cp 蛋白制备抗血清以便于实验
和生产鉴定，并建立 CarMV 的检测体系，为研究
该病毒 cp基因与寄主的互作提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 CarMV毒源材料
已经鉴定的 CarMV毒源材料活体保存于自然
寄主香石竹。
1. 1. 2 原核表达载体及菌株、试剂
CarMV毒源以及表达载体 pET-30a (+)、大
肠杆菌 (Escherichia coli)表达菌株 BL21 (DE3)
pLysS，由本实验室保存。反转录酶、限制性内切
酶、高保真酶、质粒 pMD19-T载体均购自宝生物
公司;过硫酸铵、SDS，溴酚蓝、购自 Sigma 公
司;IPTG购自 NOVON;30% ACRYL /BIS (27. 5∶
1)购自美国伯乐公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 CarMVcp基因的克隆
根据 GenBank数据库中 CarMV 的序列及质粒
pET30a的序列图谱，设计特异性引物。上游引物:
5 － CGGGATCCATGGAAAATAAAGGAGAAAAG －
3 (下划线处为 BamHⅠ酶切位点) ;下游引物:
5 － CGAGCTCTCATCACATCCTATAAACAACCC － 3
(下划线处为 SacⅠ酶切位点)。使用 Trizol法提取带
有 CarMV的香石竹总 RNA，反转录成 cDNA，以合
成的 cDNA为模板进行 PCR扩增，反应程序:94℃
预变性 4 min，94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃
延伸 70 s，共 35个循环，72℃延伸 10 min。割胶回
收 PCR产物并与载体 pMD19-T 连接，连接产物转
化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，进行蓝白斑刷
选，提取重组质粒进行 PCR 和双酶切鉴定，并通
过测序验证重组克隆载体 pMD19-T-CP中携带的 cp
基因序列及读码框的正确性。
1. 2. 2 CarMV cp基因原核表达载体的构建
重组克隆载体 pMD19-T-CP 中 cp 基因片段经
BamHⅠ和 SacⅠ双酶切后定向插入经同样酶切的
pET-30a (+)表达载体中。用 PCR、双酶切筛
选重组表达载体，并经基因测序验证重组表达载
体 pET-30a-CP 所携带的 cp 基因序列及读码框的
正确性。
1. 2. 3 CarMV cp基因的诱导表达和目的蛋白的纯化
将测序正确的重组质粒命名为 pET-CP，并转
化大肠杆菌 BL21 (DE3) － plysS 感受态细胞，
涂板、挑取单菌落，在含 Kan 的 LB 液体培养基
中，37℃振荡培养过夜。取重组菌按体积比 1 ∶
100 接入含 Kan的 LB 培养基中，180 r /min，37℃
振荡培养2 h，加入 IPTG 至终浓度 1 mmol /L，继
续诱导培养 6 h。离心收集菌体，加入 100 μL 2 ×
SDS上样缓冲液，煮沸 5 min，取 10 μL进行 SDS-
PAGE电泳分析。
蛋白纯化采用 2 次 SDS-PAGE 割胶回收目的
蛋白的方法，首先用 12% SDS-PAGE 胶分离目的
蛋白，电泳结束后用预冷的 0. 25 mol /L KCl 染色
20 min，然后切下目的蛋白带。第 2次用5% ～20%
梯度胶除去目的蛋白中的杂蛋白。将第 1 次切下的
目的条带研磨并加入适量的 2 × SDS 上样缓冲液，
离心后进行第 2次电泳;电泳完毕后，将凝胶置于
0. 25 mol /L KCl 4℃下染色 0. 5 h，切下目的条带。
1. 2. 4 抗血清的制备和 Western bolt检测
将纯化的 pET-CP 蛋白与等量的弗氏不完全
佐剂乳化后，经腹下多点注射昆明小鼠，每只每
次 0. 4 mL，以后每隔 7 d 强化注射 1 次，第 4 周
采血。用间接 ELISA 测定抗体的效价，Western-
blot分析抗血清的特异性。抗血清于 － 80℃冰箱
中保存备用。
1. 2. 5 CarMV抗血清检测初步应用
以制备的 CarMV cp抗血清为一抗、碱性磷酸
酶标记的兔抗鼠 IgG 为二抗、健康香石竹为阴性
33第 1 期 李晓鹏:香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备
对照、接种 CarMV的香石竹为阳性对照，建立检
测 CarMV的 Western blot 体系，并对昆明斗南地
区田间 48 株香石竹样品进行检测。
2 结果与分析
2. 1 CarMV CP基因的克隆及鉴定
从接种 CarMV的香石竹中提取总 RNA，利用
设计的 cp 特异性引物进行 PCR 后电泳，PCR 产
物在 1. 0 kb 左右位置 (图 1a) ，与预计的 CP 基
因 1 024 bp大小基本一致。产物割胶回收后连接
到 pMD19-T 克隆载体上，经 PCR 和酶切鉴定
(图 1b)得到阳性克隆 pMD19-T-CP。
2. 2 CarMV cp基因原核表达和 CP蛋白的纯化
将重组质粒 pMD19-T-CP 中的 cp 基因酶切然
后连接到原核表达载体 pET-30a (+)的多克隆
位点上，构建成重组载体 pET30a-CP。测序表明，
重组原核表达载体的 cp基因序列未突变且读码框
正确。将重组载体 pET30a-CP 热击转化至大肠杆
菌表达菌株 BL21 (DE3) － plysS 中。含重组表
达载体 pET30a-CP 的大肠杆菌 BL21 (DE3) －
plysS在终浓度 1 mmol /L IPTG 诱导下进行 CarMV
CP蛋白的表达，对表达产物进行 SDS-PAGE 电泳
分析发现，含重组表达载体 pET30a-CP 细菌的诱
导表达样品 (图 2a:泳道 4)在约 44 ku 处出现
一较高浓度的诱导表达条带，与预计的融合蛋白
大小一致 (融合蛋白由载体蛋白和目的蛋白组
成，目的蛋白表达为 38 ku，载体蛋白表达经测序
计算为 6 ku) ，而未诱导表达的样品 (图 2a:泳
道 3)在约 44 ku出出现一条很淡的条带，为 Car-
MV CP 蛋白的基础表达;利用割胶纯化 CarMV
CP蛋白，得到纯度较高的表达产物 (图 2b)。
2. 3 cp蛋白抗血清的制备和 Western-blot检测
诱导表达的目的蛋白纯化后作为抗原免疫昆
明小鼠获得抗 CarMV 抗血清。经 Western-blot 检
测发现制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白有较
强的血清学反应，条带特异，无明显杂带，与对
照物无免疫反应 (图 3a) ，表明目的抗原与抗体
之间的免疫反应良好。
以制备的抗血清为一抗、碱性磷酸酶标记的
兔抗鼠 IgG为二抗、健康香石竹为阴性对照、接
种 CarMV的香石竹为阳性对照，进行 CarMV样品
检测。结果发现健康香石竹均无免疫反应 (图
43 云南农业大学学报 第 28 卷
3b:1，5 泳道) ，而接种 CarMV 的香石竹都有特
异条带出现 (图 3b:2 ～ 4，6 泳道) ，说明所制备
的多克隆抗体是针对 CarMV 的 38 ku 外壳蛋白的
特异性抗体。
2. 4 CarMV抗血清的初步应用
利用制备的 CarMV多克隆抗体和 Western-blot
检测方法对昆明斗南香石竹样品进行了抽检。一共
检测 48个香石竹样品，结果发现，38 个样品呈阳
性反应，即阳性率高达 79. 2% (表 1) ，说明香石
竹斑驳病毒是田间香石竹流行的主要病毒种类。
表 1 CarMV抗血清检测样品结果
Tab. 1 The result of sample test by CarMV antibody
检测样品数
test sample
number
阳性反应
positive
reaction
阴性反应
negative
reaction
病毒检出率 /%
virus detection
rate
48 38 10 79. 2
3 讨论
香石竹是国内栽培面积最大、最为普遍的切
花，也是出口创汇最多的一种花卉。由于病毒感
染并逐步积累，病毒病对香石竹的观赏价值和经
济价值造成严重影响。因此，病毒的检测对于防
控病毒病十分重要。而国外有关 CarMV 的报道，
CAIZARES等研究不同地区 CarMV 的分子差异
性［5］及 GARCA-CASTILLO 等有关 CarMV 侵染植
株后其 P7 运动蛋白及 cp 蛋白在植株内随时间的
推移的分布情况［6］，较少涉及 cp 基因。本研究利
用制备的 CarMV cp抗血清进行 Western-bolt检测，
结果显示，该抗血清能高效检测 CarMV，为 Car-
MV检测奠定良好基础。
卜云萍［7］、李婷婷［8］等研究了通过提纯 Car-
MV病毒粒子制备抗血清的方法。但是利用提纯
病毒制备的抗血清中往往含有寄主蛋白的抗体，
容易导致假阳性反应［9］，而且一些病毒难以提纯
且很难获得高纯度的病毒。此外，病毒扩大繁殖
需要温室和大量的植物材料，难于管理，时间周
期很长，不利于大规模制备抗血清。张爱平［10］等
研究 CarMV外壳蛋白基因克隆及原核表达，但是
尚无抗血清制备和病毒检测的研究。吴建祥［11］等
研究香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备用于病毒
检测，虽然单克隆抗体具有特异性高的特点，但
是生产和检测费用比多克隆抗体高，不适合生产
上大规模使用。本研究通过构建 cp 原核表达载
体，采用原核表达的方法表达 CarMV 的外壳蛋
白，优化了表达条件，通过免疫小鼠制备多克隆
抗体，抗体经Western-blot检测能高效特异检测出
香石竹中的 CarMV，对昆明地区香石竹样品进行
的初步抽检中有良好的检测效果，表明本研究建
立的方法体系能够很好地服务于生产。因此本研
究对于大规模生产的香石竹样品进行病毒检测具
有重要的应用价值，同时为研究 CarMV 的 cp 与
寄主的互作奠定了基础。
致谢: 试验得到英茂花卉公司杨泮川先生、云南
农业科学院花卉研究所王继华所长的大力支持，
提供试验样品和种苗。在此表示衷心感谢!
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