全 文 ：对脂蛋白的水解, 及提高机体抗氧化能力有关, 其确
切机制有待进一步研究。
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二氢杨梅素对痤疮丙酸杆菌和脂多糖诱发小鼠肝损伤的保护作用
及对中性粒细胞释放白三烯的影响
梁　婷1 ,吴春福1* ,吕艳青2 ,李满妹2,王璐璐2,张　坤2,栗原博2X
( 1. 沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳　110016; 2. 暨南大学 中药及天然药物研究所, 广东 广州　510632)
摘　要: 目的　研究二氢杨梅素 ( DMY) 对痤疮丙酸杆菌与脂多糖 (P . acnes-LPS) 诱发小鼠肝损伤的保护作用及
对小鼠腹腔中性粒细胞释放白三烯的影响。方法　通过对 10 mg/ kg P . acnes 负荷 5 d 的小鼠 iv 3 Lg/ kg LPS 建
立 P . acnes-LPS 肝损伤模型 ,用酶标仪测定血浆丙氨酸氨基转移酶 ( ALT ) 活性, RP-HPLC 法测定小鼠腹腔中性
粒细胞释放白三烯 B4( LTB4) 和白三烯 C4 ( LTC4) 的水平。结果　与模型组相比, 125、250、500 mg / kg DMY 均能
显著抑制由 P . acnes-LPS 诱发的小鼠血浆 ALT 活性升高, 其抑制率分别为 38. 7%、45. 1%、49. 8% , 并对小鼠腹
腔中性粒细胞 LTB4和 LT C4的分泌呈剂量依赖性抑制作用。结论　DMY 对 P . acnes-LPS 诱发小鼠肝损伤具有一
定的保护作用, 其部分作用机制可能与抑制白三烯释放有关。
关键词: 二氢杨梅素; 痤疮丙酸杆菌; 脂多糖; 肝损伤; 白三烯
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253-2670( 2008) 01-0083-05
Protection of dihydromyricetin on liver injured mice induced by Propionibacterium acnes-
lipopolysaccharide and its effect on release of leukotrienes from neutrophil
LIANG Ting
1
, WU Chun-fu
1
, LU
　 ¨
Yan-qing
2
, L I M an-mei
2
, WANG Lu-lu
2
,
ZHANG Kun
2
, KURIHARA Hiro shi
2
( 1. School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceutical Univ ersit y, Shenyang 110016, China; 2. I nstitute of T raditional
Chinese Medicine and Natur al P roducts, Jinan Univ ersit y, Guangzhou 510632, China)
Abstract: Objective　T o observ e the pro tect ion of dihydromy ricet in ( DMY) on liv er injured mice in-
duced by Prop ionibacterium acnes-lipopolysaccharide ( P . acnes-LPS ) and its ef fect on release of
leukot rienes f rom murine per itoneal neutrophil. Methods　The liver injured model w as established by iv 3
Lg/ kg of LPS into 5 d 10 Lg / kg P . acnes-primed mice. Hepatic funct ion w as evaluated by assessing alanine
aminot ransferase ( ALT ) level in plasma w ith ELISA. HPLC M ethods w ere performed to detect the r elease
levels of leukot riene B4 ( LTB4) and leukot riene C4 ( LT C4) in murine peritoneal neutrophil . Results　Com-
pared w ith the model groups, 125, 250, and 500 mg/ kg DMY inhibited the act ivit ies of ALT at 38. 7% ,
45. 1% , and 49. 8% , respect ively. DMY also inhibited the release o f LTB4 and LT C4 in murine peritoneal
·83·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
X 收稿日期: 2007-05-16作者简介:梁　婷( 1980—) ,女,硕士生,研究方向为中药药理学。T el: ( 020) 85227797　E-m ail : li angt ing 818@ tom. com
* 通讯作者　栗原博　Tel: ( 020) 33033306　E-mail: Hirosh i Kurih ara@ 163. com吴春福　Tel: ( 024) 23843567　E-mail: w ucf@ syphu. edu . cn　w uchunf@ 21cn. com
neutrophil in a do se-dependent manner. Conclusion　T he results indicate that DMY has the protect ion to
liver injur ed mice induced by P . acnes-LPS and the mechanisms may be part ly related to it s inhibitory ef-
fect on release of leukot rienes in neutrophil.
Key words: dihydromy ricet in ( DMY ) ; P rop ionibacterium acnes; lipopolysaccharide ( LPS ) ; liver
injury ; leukot rienes
　　二氢杨梅素 ( 3, 5, 7, 3′, 4′, 5′-六羟基-2, 3
双氢黄酮醇, dihydromyricet in, DMY ) 又名双氢杨
梅素、双氢杨梅树皮素、蛇树皮素等,属黄酮类化合
物,广泛存在于葡萄科等植物中。近年来的研究证明
二氢杨梅素具有降血糖、调血脂、抗氧化及增强免疫
等作用[ 1]。Hase 等[ 2]的研究证明 DMY 对 D -半乳
糖胺和脂多糖 ( LPS ) 诱发的小鼠肝损伤有显著的
保护作用, 但尚未见 DMY 对白三烯 B4 ( LT B4 ) 及
白三烯 C4( LT C4) 等炎症介质影响的研究报道。
　　热灭活的痤疮丙酸杆菌 ( P rop ionibacterium
acnes, P . acnes) 和脂多糖 ( LPS) 共同诱发的肝损
伤是目前较为常用的自身免疫型肝损伤动物模
型[ 3, 4]。当 LPS iv 给予 P . acnes 负荷小鼠后, 激活
肝脏枯否氏细胞 ( Kupf fer cell) , 活化巨噬细胞及各
种细胞因子, 继而引起炎症反应[ 5]。与其他肝损伤动
物模型相比, P . acnes-LPS 诱发的肝损伤更近似自
身免疫性肝炎的病理过程,其病变与慢性肝炎非常
接近[ 2]。Kur ihara 等[ 6]的研究证明组胺等炎症介质
及外周免疫担当细胞参与 P. acnes-LPS 诱发小鼠
肝损伤的病理过程。Matuschak 等 [ 7]在研究中确认
白三烯是肝损伤过程中的重要炎症介质。本研究通
过 P . acnes-LPS 负荷小鼠肝损伤模型, 观察 DMY
对 P . acnes-LPS 诱发肝损伤小鼠血浆中丙氨酸氨
基转移酶 ( ALT ) 的影响,并结合抑制小鼠腹腔中
性粒细胞释放炎症介质 LTB4、LT C4活性来评价
DMY 对 P . acnes-LPS 诱发肝损伤的保护作用及
可能的作用机制。
1　材料与方法
1. 1　试剂与仪器: DMY 由日本 Suntory 公司研究
中心深见治一博士提供,质量分数≥97. 2%; P. ac-
nes 菌株 ( ATCC6919) 由日本 Suntory 公司研究中
心提供;环孢菌素 A ( CsA ) 购自杭州中美华东制药
有限公司;醋酸地塞米松 ( DEX) 为天津药业集团
新郑股份有限公司产品; 血浆 ALT 测定试剂盒购
自南京建成生物工程研究所; LPS、LTB4、LTC4、花
生四烯酸 ( A A) 及钙离子载体 A 23187均为 Sigma 产
品;前列腺素 B2( PGB2) 购自 Calbiochem Co . L td,
美国;蛋白胨购自广东环凯微生物科技有限公司;
脑-心浸萃液态培养基购自 Difco Labor ator ies, De-
troit , M I, 美国。甲醇 (色谱纯) 购自美国 Fishier
试剂公司;其他试剂均为国产分析纯。
　　Mult iskan MK 3 型酶标仪 ( T hermo Labsy s-
tems Inc. , 芬兰) ;日本 HIT ACHI 高效液相色谱系
统 (包括 L-6000 型输液泵、L-5025 型柱温箱, L-
4000 型紫外检测器, N2000 色谱数据工作站) ;色谱
柱为日本 KANTO CHEM ICAL 公司 RPC18柱
( 4. 6 mm×150 mm , 5 Lm) ; Str ata C18-E 小柱为
Phenomenx 公司产品。厌氧培养装置购自 Fo rma
Scient if ic, Inc. , OH, 美国。3-18K 型台式高速冷冻
离心机。BS210S 电子分析天平均为 Sigma 公司产
品; pH S-25 型酸度计购自上海伟业仪器厂。
1. 2　热灭活 P . acnes 干粉的制备[ 6] : P . acnes 菌
株接种在添加 0. 03% L -半胱氨酸和 0. 03% 聚山
梨酯-80 的脑-心浸萃液态培养基培养液中,置于厌
氧培养装置内 37 ℃ 条件下培养 48 h。培养后回收
菌液在 4 ℃、10 000×g 下离心 15 m in, 并以 PBS
清洗。清洗后的菌细胞重新以 PBS 分散, 80℃加热
30 m in 灭活后冷冻干燥,并回收得 P . acnes 干粉用
于本研究。
1. 3　P . acnes-LPS 肝炎模型制备及给药方法[ 6] : 7
周龄 18～22 g 雄性清洁级昆明种小鼠[购自广东省
医学 实 验动 物 中心, 合 格 证号 SCXK ( 粤 )
2005A 012 ] , 在清洁级层流架中饲养, 饲养温度
( 23±2) ℃, 照明时间 12 h/ d。饲养 1周后进行实
验。P. acnes-LPS 肝炎模型制备通过小鼠尾 iv 10
mg/ kg 热灭活 P . acnes-PBS 溶液, P. acnes 负荷 5
d 后尾 iv 3 Lg/ kg LPS-PBS 溶液。实验动物在 LPS
注射 5 h 后乙醚麻醉下心脏取血,置于肝素处理后
的离心管中, 5 000 r/ m in离心 5 min,回收上清液储
存于 - 20 ℃用于 ALT 分析。
　　实验动物随机分为对照组、模型组、CsA 组 ( 25
mg/ kg )、DMY 高、中、低剂量组 ( 500、250、125 mg /
kg ) ,共6组,每组7只小鼠。P. acnes 负荷前1天起
每天1次连续 7 d ig 给予 DMY 水溶液,末次给药
在 LPS 注射前 30 m in, 对照组给予等容量水溶液。
CsA 给药为 P. acnes 负荷后1天起隔日 ip给药, 共
·84· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
2次。
1. 4　ALT 活性测定: 小鼠血浆 ALT 活性通过赖
氏法检测试剂盒使用酶标仪测定。
1. 5　DMY 对中性粒细胞释放白三烯的影响: 参照
Hashimoto 等[ 8]的方法,略作改进。取7周龄 18～22
g 雄性清洁级昆明种小鼠 48 只, 随机分成 6组,每
组8只。分别为对照组、模型组、DMY 高、中、低剂量
组 ( 500、250、125 mg/ kg ) 及 DEX ( 1 mg/ kg ) 组。
DMY 每天 ig 给药1次,连续 5 d,对照组及模型组
给予等容量水溶液, DEX 组隔日 ig 给药。给药第2
天除对照组外, 其余各组 ip 10% 蛋白胨 0. 5 mL/
只,末次给药 1 h 后脱颈处死小鼠。
1. 5. 1　中性粒细胞制备:每只小鼠 ip 2. 5 mL Han-
ks 溶液,收集腹腔内液体, 500 r / min 离心 10 min
后弃去上清液, 洗2次后,取沉淀悬浮于无钙、镁的
Dulbecooøs 缓冲液 ( pH 7. 4) 后取细胞悬液置玻片
上,室温吹干后用 Wright-Giemsa 染色液染色, 显
微镜下计数中性粒细胞, 并将细胞数调整至 1×
10
7
/ mL。
1. 5. 2　白三烯合成与提取过程:将 1 mL 中性粒细
胞悬液添加到每个试管中,每组设3个平行对照管,
37 ℃ 孵育 5 min 后添加 100 Lmol/ L AA 及 10
Lmol/ L A 23187, 37℃孵育 10 min 后 5 000 r/ m in 离
心 10 min,取上清液。每管加入 2 mL 无水乙醇终止
反应后添加内标 PGB2100 ng ,再加入蒸馏水 5 mL,
4 ℃条件下 5 000 r/ m in离心 10 min 沉淀蛋白。取
上清液添加蒸馏水使乙醇体积分数为 15% , 用 1
mol / L HCl调 pH 至 3. 5后,添附在 Sep-Pak C18小
柱上,并依次用 0. 1% EDTA、蒸馏水、15% 乙醇、
石油醚、甲醇各 10 mL 连续洗脱, 收集甲醇组分后
氮气吹干, - 80 ℃ 冷冻保存作为样品用于白三烯
分析。HPLC 分析前每管用 50 LL 甲醇复溶。
1. 5. 3　RP-HPLC 色谱条件: 流动相组成为甲醇-
水-醋酸 ( 70∶30∶0. 01, 用 NH4OH 调 pH 值至
5. 6) , 体积流量 1. 0 mL/ m in, 检测波长为 280 nm,
柱温 35 ℃,进样量为 20 LL。
1. 5. 4　定性及定量: 用 LTB4及 LTC4的对照品溶
液根据 HPLC 保留时间对 LTB4及 LTC4进行定性,
以内标法根据峰面积比进行定量, 并用浓度对峰面
积比绘制标准曲线。实验样品中 LTB4及 LTC4的量
测定根据其峰面积的比值,代入标准曲线中通过计
算得出[ 8]。
1. 6　统计学处理:实验数据以 x±s 表示, 采用 t 检
验进行统计学分析。
2　结果
2. 1　DMY 对 P . acnes-LPS 诱发肝损伤小鼠血浆
ALT 水平的影响: P . acnes-LPS 诱发小鼠血浆
ALT 活性显著升高 ( P< 0. 001)。与模型组相比, 不
同剂量 DMY 均显示降低 P . acnes-LPS 负荷小鼠
血浆 ALT 水平, 且呈一定量效关系。对照药 CsA
也同样显著抑制因 P . acnes-LPS 负荷而引起的小
鼠血浆 ALT 活性的升高 (表1)。
表1　DMY 对 P . acnes-LPS 诱发肝损伤小鼠血浆 ALT
水平的影响 ( x±s, n= 7)
Table 1　Effect of DMY on plasma ALT levels in liver-
injured mice induced by P . acnes-LPS
( x±s, n= 7)
组　别 剂量/ ( mg·kg - 1) ALT 活性/ ( U·L- 1) 抑制率/ %
对照 - 24. 72± 3. 77 -
模型 - 259. 14± 9. 51# # # -
DMY 125 158. 73± 6. 51* 38. 7
250 142. 24±10. 41* * 45. 1
500 130. 01± 9. 20* * * 49. 8
CsA 25 83. 92± 6. 23* * * 67. 9
　　与对照组比较: # # # P< 0. 001
　　与模型组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　# # # P < 0. 001 v s cont rol group
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P< 0. 001 v s model g roup
2. 2　LTB4、LT C4对照品及中性粒细胞释放白三烯
色谱图:参照对照品的结果证明,中性粒细胞样品中
的 PGB2、LT B4和 LT C4在 RP-HPLC 色谱柱的保留
时间分别为 6. 148、11. 265、25. 732 m in, 液相条件
达到了分离检测 LT B4和 LT C4的效果 (图1)。
2. 3　DMY 对小鼠腹腔中性粒细胞释放 LT B4及
LT C4的影响: 如表2所示,小鼠 ip 0. 5 mL 10% 蛋
白胨后, 其腹腔中性粒细胞释放 LT B4及 LTC4水平
显著升高,诱发腹腔炎症发生。与模型组相比, 125、
250、500 mg / kg DMY 连续 5 d ig 后小鼠腹腔中性
粒细胞释放 LTB4及 LT C4水平显著降低, 且呈一定
量效关系。1 mg / kg DEX 组隔日 ig 后也显著抑制
中性粒细胞释放 LT B4及 LT C4。
3　讨论
　　与对照组相比, P. acnes-LPS 负荷小鼠的血浆
ALT 水平显著升高, 诱发小鼠肝损伤。Matsui等 [ 9]
的研究证明 P . acnes 负荷小鼠引起 Kupf fer 细胞、
巨噬细胞及外周淋巴细胞等在肝脏蓄积,当 iv LPS
后激活蓄积在肝脏中的 Kupffer 细胞等免疫反应细
胞引发炎症反应[ 10, 5]。由于 P . acnes-LPS 诱发肝损
伤可以被 CsA 等免疫抑制剂所抑制[ 11] , 因此认为
P . acnes-LPS肝损伤模型近似自身免疫性肝炎的
·85·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
图 1　LTB4对照品 ( A)、LTC4对照品 (B) 及小鼠腹腔中性粒细胞样品 (C) RP-HPLC 色谱图
Fig. 1　RP-HPLC Chromatograms of LTB4 ref erence substance (A) , LTC4 reference
substance (B) , and sample of peritoneal neutrophils in mice (C)
表 2　DMY 对小鼠腹腔中性粒细胞释放 LTB4及 LTC4的
抑制作用 ( x±s, n= 8)
Table 2　Inhibition of DMY on release of LTB4 and LTC4
f rom peritoneal neutrophils in mice ( x±s, n= 8)
组　别 剂量/
( mg·kg- 1)
LTB4( 1×107个) /
n g
抑制率/
%
LTC4( 1×107个) /
ng
抑制率/
%
对照 - 43. 34±3. 54 - 7. 97±1. 06 -
模型 - 276. 90±3. 69# # # - 23. 95±0. 45# # # -
DMY 125 190. 02±4. 50* 31. 3 21. 79±0. 80* 9. 0
250 146. 12±3. 29* * 47. 2 20. 27±0. 61* 15. 3
500 106. 25±4. 13* * * 61. 6 17. 46±0. 73* * 27. 0
DEX 　1 63. 83±1. 11* * * 76. 9 11. 03±0. 37* * * 53. 9
　　与对照组比较: # # # P < 0. 001
　　与模型组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　# # # P < 0. 001 v s con tol group
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01　* * * P < 0. 001 v s m odel group
病理过程,其病变与慢性肝炎非常接近。与模型组相
比, DMY 可以显著改善因 P . acnes-LPS 负荷导致
的小鼠血浆 ALT 水平增高, 有效减轻 P. acnes-
LPS 负荷引起的肝损伤的程度。DMY 是一种含有
6-酚羟基的黄酮类化合物,该化合物因带有多个酚
羟基而具有较强的清除自由基活性[ 12]。Winrow
等[ 13 ] 的研究证明在炎症反应过程中伴有大量
自由基产生, Po li[ 14]认为肝损伤病理过程多为自由
基参与下的炎症反应, 过多的活性氧自由基攻击生
物膜中的不饱和脂肪酸而发生脂质过氧化反应,
破坏脂肪酸链和细胞膜的完整性, 损伤肝脏中的各
种细胞, 引起血浆 ALT 活性的增高。郑洁静等[ 15]
的研究证明包括 DMY 在内的藤茶总黄酮可以通过
缓解肝脏脂质过氧化状态, 降低应激负荷导致的
小鼠血浆 ALT 水平升高,改善应激性肝损伤。他们
在测定 DMY 的抗氧化能力指数活性时发现这类
黄酮类化合物能明显延缓荧光物质被活性氧自由基
淬灭的速度, 确认 DMY 具有清除羟自由基和超氧
自由基的能力。基于文献资料和本实验结果可以
认为 DMY 对 P . acnes-LPS 负荷引起的肝损伤
的保护作用可能部分与其清除自由基, 减少氧自由
基介导的细胞损害, 以及抑制脂质过氧化损伤等
有关。
　　近年来人们发现 P. acnes-LPS 诱发炎症过程
中伴有白三烯及组胺等炎症介质的参与 [ 6, 16]。Kuri-
hara 等[ 6]的研究确认组胺抑制剂可以影响 P . ac-
nes-LPS 诱发肝损伤的病理过程。从制备中性粒细
胞角度上考虑, 人们一般采用蛋白胨诱发腹腔炎症
模型来评价中性粒细胞释放白三烯的量。本实验发
现 DMY 对注射蛋白胨诱发腹腔炎症的小鼠中的中
性粒细胞释放 LT B4及 LT C4有明显的抑制作用。实
际上, P . acnes-LPS 诱发肝损伤与中性粒细胞释放
白三烯共属炎症基本过程。白三烯作为 AA 经 5-脂
氧酶途径生成的一族脂类介质,广泛参与炎症等病
理生理过程。白三烯在炎症细胞受到刺激因素的激
活后合成, 其中 LTB4主要由中性粒细胞和巨噬细
胞产生,具有较强的促进中性粒细胞趋化、聚集和使
之脱颗粒及促进溶酶体酶释放等作用。LTC4主要通
过介导平滑肌收缩,增加血管通透性等生物活性而
参与炎症反应, 是炎症过程中的主要化学介质之一。
本研究证明 DMY 对 P. acnes-LPS 诱发小鼠肝损
伤具有保护作用, 同时明显抑制中性粒细胞释放
LT B4及 LT C4,因此推测其保护 P . acnes-LPS 性肝
损伤的机制可能与其抑制白三烯释放的作用部分相
关。近年来从天然资源中寻找活性物质用于防治疾
病和维持机体健康已成为人们关注的话题。本实验
证明 DMY 通过清除自由基及抑制炎症介质来改善
P . acnes-LPS 诱发的肝损伤,提示 DMY 可能在改
善氧自由基引起的多种生活习惯病方面具有广泛的
潜在应用价值。
·86· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
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密蒙花正丁醇提取物对糖尿病大鼠血糖和醛糖还原酶的影响
李海岛1 ,冯苏秀1 ,叶　儒1,郭洪祝1, 2X ,果德安1
( 1. 北京大学药学院,北京　100083; 2. 北京市药品检验所,北京　100035)
摘　要: 目的　观察密蒙花正丁醇提取物对糖尿病大鼠的血糖和醛糖还原酶 ( AR ) 活性的影响。方法　通过 ip 链
脲佐菌素 ( STZ ) 60 mg / kg 建立糖尿病大鼠模型, 随机分成5 组, 分别 ig 给予氨基胍和高、中、低剂量 ( 200、400、
800 mg / kg ) 的密蒙花正丁醇提取物,糖尿病模型组则给予等体积的蒸馏水,实验过程中每3 天测1 次体重, 每周测
定血糖, 并于实验第30天和第90 天测定 AR 活性。结果　密蒙花正丁醇提取物的高剂量组大鼠的血糖显著低于模
型组, 其第1个月的 AR 活性也显著低于模型组。结论　密蒙花正丁醇提取物可降低糖尿病大鼠血糖水平,且短期
内具有 AR 抑制活性。
关键词: 密蒙花; 糖尿病; 醛糖还原酶
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253-2670( 2008) 01-0087-04
　　密蒙花为常用中药,《中国药典》2005年版收载
密蒙花为马钱科植物密蒙花 Buddlej a of f icinal is
Max im. 的干燥花蕾及其花序, 用于眼部疾病的治
疗。根据前期研究结果 [ 1] ,密蒙花正丁醇提取物在体
外有较强的醛糖还原酶抑制活性,但其体内活性尚
未有研究报道。在糖尿病并发症中,糖尿病性白内障
的发病机制与多元醇通路的异常有关, 多元醇通路
和关键限速酶——醛糖还原酶 ( aldose reductase,
·87·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
X 收稿日期: 2007-05-02基金项目:国家教育部归国人员启动基金作者简介:李海岛( 1983—) ,男,江苏徐州人,硕士,主要研究方向为中药及天然药物有效成分及活性研究,现工作于鲁南制药集团。
E-mail: haidaolee@ 126. com
* 通讯作者　郭洪祝　Tel: ( 010) 66124434　E-mail: guohz@b jmu. edu. cn