全 文 ：表 2 　野生猪苓的 3 种成分的量( n = 3)
Table 2 　Determination of three componentsin wild
P. umbellatus ( n = 3)
产 　地
麦角甾醇
/ (mg ·g - 1 )
麦角甾24 ,6 ,8 (14) ,222
四烯232酮/ (mg ·g - 1 ) 多糖/(mg ·g - 1 )
湖北神农架 01703 01 021 41 739
陕西太白山 01461 01 024 31 965
表 3 　栽培猪苓不同生长年限的 3 种成分的量( n = 3)
Table 3 　Determination of three components in cultivation
P. umbellatus in different growth years ( n = 3)
年 　限
麦角甾醇
/ (mg ·g - 1 )
麦角甾24 ,6 ,8 (14) ,222
四烯232酮/ (mg ·g - 1 ) 多糖/(mg ·g - 1 )
三年生 01708 01 021 41 750
四年生 01589 01 019 41 338
3 　结论
311 　本实验 HPL C 定量测定的方法学研究过程中
分别使用了甲醇20150 % H3 PO4 水溶液 (92 ∶8) 、甲
醇2水溶液 (96 ∶4) 、乙腈2水 (60 ∶40) 等条件进行色
谱分离试验 ,经综合考虑试验结果 ,选择的流动相为
甲醇2水溶液 (96 ∶4) 。其中麦角甾24 ,6 ,8 (14) ,222
四烯232酮在 343 nm 检测波长下与其他组分能达到
基线分离 ;麦角甾醇在 281 nm 检测波长下与其他
组分能达到基线分离。同时对猪苓有效成分不同提
取方法进行了对比试验 ,结果表明用 20 倍量无水乙
醇超声 60 min 的提取方法效果最好。在建立的灵
敏、可靠的 H PL C 定量测定方法的基础上 ,结合多
糖的紫外分光光度法的测定 ,制定了猪苓麦角甾24 ,
6 ,8 (14) ,222四烯232酮、麦角甾醇和多糖 3 种化学成
分为指标的质量评价方法。本方法可系统、全面地
对不同来源的猪苓药材进行质量评价 ,并为规范猪
苓药材标准提供了科学依据。
312 　首次采用 3 种成分为指标的方法考察了不同
地区猪苓商品药材、野生和栽培品的麦角甾醇、麦角
甾24 ,6 ,8 (14) ,222四烯232酮和多糖的量。其中麦角
甾醇最低量为 01091 mg/ g ,最高量为 01963 mg/ g ;
麦角甾24 , 6 , 8 ( 14) , 222四烯232酮最低量为 01005
mg/ g ,最高为 01107 mg/ g ;多糖量最低为 21992
mg/ g ,最高为 121034 mg/ g ;部分药材多糖量高达
111707、121034 mg/ g ,而另两种成分的量却很低。
以上结果表明 ,不同地区猪苓商品药材 3 种成分的
量差异很大 ,反映了猪苓药材存在的质量问题。因
此应及时采用科学的质量评价方法 ,制定出猪苓各
成分量限度标准 ,进行质量控制。本方法的应用和
实施可解决目前猪苓药材市场质量控制标准不规
范、质量差异大的问题 ;另外建议对于多糖量高而另
两种成分量很低的猪苓药材可作为提取猪苓多糖的
原料使用 ,由此可使猪苓资源合理应用。
313 　研究表明 ,野生、栽培猪苓的 3 种成分的量与
不同地区猪苓商品药材 3 种成分的量平均值相近
似 ,但由于试验样品来源数量有限 ,缺乏一定的代表
性 ,还需充分收集试验样品和进一步研究。
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柱前衍生化 RP2HPLC法测定地黄中葡萄糖、半乳糖和蜜二糖
刘有平 ,张佳蕊 ,邵 　华 ,李小童 ,刘永利 ,邸 　欣 3
(沈阳药科大学药学院 ,辽宁 沈阳 　110016)
摘 　要 :目的 　建立同时测定地黄中葡萄糖、半乳糖和蜜二糖的 RP2HPLC 方法 ,为地黄药材的质量控制提供新的
依据。方法 　地黄药材以水超声提取 ,再用 12苯基232甲基252吡唑啉酮 ( PMP)衍生化后 ,采用 Diamonsil C18柱 (150
mm ×416 mm ,5μm)分离 ,流动相为乙腈和 100 mmol/ L 醋酸铵水溶液 (p H 515)进行梯度洗脱 ,体积流量 110 mL/
min ,检测波长为 245 nm ,柱温为 2315 ℃,以内标法定量。结果 　葡萄糖、半乳糖和蜜二糖分别在 90～900μg/ mL
·479· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008208225　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (20445003)
作者简介 :刘有平 (1970 —) ,男 ,山西长治人 ,博士 ,研究方向为药物代谢与药物动力学研究。　
Tel : (024) 23986342 　E2mail :yp2iu @1631com3 通讯作者　邸　欣　E2mail :dixin63 @hot mail1com
( r = 01999 3) 、90～900μg/ mL ( r = 01999 0) 和 27～270μg/ mL ( r = 01999 0) 线性关系良好 ;3 种糖的平均回收率
均 > 9817 %( n = 9) ,RSD < 313 %。结论 　该方法灵敏度高、分离效果好 ,可用于地黄药材的质量控制。
关键词 :地黄 ;葡萄糖 ;半乳糖 ;蜜二糖 ; PMP 衍生 ;高效液相色谱
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620974203
　　地黄为玄参科植物地黄 Rehm anni a gl uti nosa
Libosch1 的块根 ,为我国常用的中药材之一 ,通常
以鲜地黄、生地黄和熟地黄 3 种形式入药。地黄在
我国有悠久的药用历史 ,被《神农本草经》列为上品。
地黄中含有葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、蜜二糖、棉
子糖、水苏糖、甘露三糖、毛蕊花糖及地黄多糖 a、b
等糖类成分 ,其中 ,地黄寡糖类成分为地黄中主要活
性成分。现代研究证明 ,地黄寡糖具有增强免疫、促
进造血、降血糖和抗肿瘤等活性[1 ] 。有关地黄中活
性糖组分分析的研究报道大多是采用比色法测定还
原糖总量[2 ,3 ] 。温学森等[4 ]采用凝胶色谱/ 示差折光
检测法研究了地黄在加工炮制过程中 H PL C 谱图
的变化规律 ,但因凝胶色谱分离效率低 ,糖组分的色
谱峰相互重叠 ,无法准确定量。笔者建立了 12苯基2
32甲基252吡唑啉酮 ( PMP)柱前衍生化 RP2HPL C 法
同时测定地黄中 3 种还原糖的量。该法具有灵敏度
高、专属性强等优点 ,可用于地黄药材的质量控制。
1 　仪器和试药
Aglient HPL C 1100 型液相色谱仪 ,配有四元
梯度泵和 Agilent chemstation 色谱工作站。
D2葡萄糖一水合物 (质量分数 9915 % ,中国医
药上海化学试剂公司) , D2( + )2半乳糖 (质量分数
9910 % ,中国医药上海化学试剂公司) ; D2( + )2蜜二
糖一水合物 (质量分数 9910 % , ACROS 公司) ; D2
( + )2木糖 (质量分数 9910 % , Fluka 公司) ,12苯基2
32甲基252吡唑啉酮 (分析纯 ,上海试剂有限公司分
装) ,乙腈 (色谱纯 ,天津康科德科技有限公司) ,重蒸
水 (自制) 。
生地黄分别购自河南、山东、山西和沈阳 ,经沈
阳药科大学中药学院路金才副教授鉴定为玄参科植
物地黄 R1 gl uti nosa Libosch1 的块根。
2 　方法与结果
211 　色谱条件与系统适用性试验 :色谱柱为 Dia2
monsil C18 柱 (150 mm ×416 mm , 5 μm) ;预柱为
Easy Guard C18保护柱 (8 mm ×410 mm) ;流动相 :A
为乙腈 ,B 为 100 mmol/ L 醋酸铵水溶液 (p H 515) ,
梯度洗脱程序为 0～20 min ,A 由 0 %线性增加至
19 % ,20～27 min ,A 由 19 %线性增加至 22 % ;体积
流量 :110 mL/ min ;检测波长 : 245 nm ;柱温 : 2315
℃;进样量 :20μL 。在上述色谱条件下 ,3 组分峰与
各相邻峰的分离度均大于 115 ,理论塔板数不低于
6 000。
212 　对照品储备液的制备 :分别精密称取葡萄糖一
水合物对照品 124 mg (相当于葡萄糖 11215 mg) ,
半乳糖对照品 11215 mg 和蜜二糖一水合物对照品
3515 mg (相当于蜜二糖 331 5 mg) ,分别置 10 mL
量瓶中 ,加重蒸水溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得。
分别精密量取葡萄糖、半乳糖和蜜二糖对照品
储备液各 5 mL ,置同一 25 mL 量瓶中 ,加重蒸水溶
解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得质量浓度分别为 2125、
2125、0167 mg/ mL 的混合对照品储备液。
213 　内标溶液的制备 :精密称取木糖对照品 1612
mg ,置 10 mL 量瓶中 ,加重蒸水溶解并稀释至刻度 ,
摇匀 ,即得。
214 　供试品溶液的制备 :取已剪成碎末状的地黄样
品 110 g ,精密称定 ,加水 30 mL ,超声提取 3 次 ,每
次 30 min ,滤过 ,合并滤液 ,减压浓缩 ,将浓缩液定
量转移至 10 mL 量瓶中 ,用水稀释至刻度 ,摇匀 ,再
精密量取该溶液 2 mL ,置 10 mL 量瓶中 ,用水稀释
至刻度 ,摇匀 ,即得。
215 　衍生化方法 :取对照品溶液或供试品溶液 50
μL ,置 1 mL 具塞试管中 ,分别加入内标溶液、013
mol/ L NaO H 溶液和 015 mol/ L PMP 甲醇溶液各
50μL ,涡旋混合 ,于 70 ℃下反应 30 min ,取出冷却
至室温 ,加入 013 mol/ L HCl 溶液 50μL 中和反应
液 ,再加入氯仿 200μL ,涡旋、离心 ,弃去下层 ,重复
萃取 3 次 ,将上层溶液用 0145μm 的微孔滤膜滤
过 ,取续滤液备用。
216 　线性关系考察 :精密量取混合对照品储备液
014、112、210、310、410 mL 分别置 10 mL 量瓶中 ,
用重蒸水稀释至刻度 ,摇匀。分别取上述溶液 50
μL ,衍生化后 ,进样分析。以葡萄糖、半乳糖和蜜二
糖衍生物与内标衍生物的峰面积之比为纵坐标
( Y) ,以质量浓度为横坐标 ( X) ,进行线性回归 ,得到
葡萄糖、半乳糖和蜜二糖的回归方程分别为 Y =
21187 4 X - 01018 1 ( r = 01999 3) , Y = 41493 9
X - 01023 1 ( r = 01999 0) 和 Y = 11708 9 X -
01019 3 ( r = 01999 0) 。结果表明 ,葡萄糖、半乳糖和
蜜二糖分别在 90～900μg/ mL 、90～900μg/ mL 和
27～270μg/ mL 线性关系良好。
·579·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
217 　精密度试验 :取一定质量浓度的对照品溶液 ,
衍生化后 ,将所得溶液连续进样 5 次 ,葡萄糖、半乳
糖和蜜二糖衍生物与内标衍生物的峰面积比值的
RSD 分别为 011 %、011 %、014 %。
218 　重现性试验 :取同一批地黄样品 ,平行制备 5
份供试品溶液 ,衍生化后 ,进样分析 ,测得葡萄糖、半
乳糖和蜜二糖质量分数的 RSD 分别为 015 %、
016 %和 015 %。
219 　稳定性试验 :取衍生化后的供试品溶液 ,室温
下放置 ,分别于 0、2、4、6、8、12 h 进样分析 ,求得地
黄中葡萄糖、半乳糖和蜜二糖质量分数的 RSD 均小
于 510 % ,表明待测溶液室温条件放置 12 h 内稳定。
2110 　加样回收率试验 :取地黄样品约 015 g ,精密
称定 ,共称取 9 份 ,3 份为 1 组 ,分别按低、中、高质
量浓度精密加入葡萄糖、半乳糖和蜜二糖对照品溶
液 ,制备供试品溶液 ,衍生化后 ,进样分析 ,计算得葡
萄糖、半乳糖和蜜二糖的平均回收率分别为
10011 %、10018 %、9817 % , RSD 分别为 214 %、
312 %、313 %。
2111 　样品测定 :取所收集的各产地地黄样品 ,制备
供试品溶液 ,衍生化后 ,进样分析 ,用内标法计算地
黄中 3 种还原糖 ,色谱图见图 1 ,结果见表 1。
图 1 　对照品( A)和样品( B)的色谱图
Fig11 　HPLC Chromatograms of reference
substance ( A) and sample ( B)
表 1 　地黄中 3 种还原糖的测定结果( n = 3)
Table 1 　Determination of reducing saccharides
in R1 glutinosa roots ( n = 3)
编号 来源
蜜二糖/
(mg ·g - 1)
葡萄糖/
(mg ·g - 1)
半乳糖/
(mg ·g - 1)
1 河南 21 5 2110 201 9
2 山东 21 6 1218 111 0
3 山西 21 7 1216 151 5
4 沈阳 21 4 813 341 5
3 　讨论
311 　衍生化试剂的选择 :由于糖既没有紫外吸收 ,
也不产生荧光 ,因此发展了许多衍生化方法来对糖
进行分析。目前糖的色谱检测方法 ,大多数采用衍
生化后直接检测的方式。糖自身所具有的衍生化基
团包括羟基、醛基或酮基等 ,可以实现还原或选择性
酰胺化衍生操作 ,还可以通过缩合等反应衍生。常
用的 12苯基232甲基252吡唑啉酮作为衍生化试剂 ,在
碱性条件下 ,通过醛和某些含活泼氢的化合物发生
缩合反应 ,形成新的碳2碳键。该法具有许多独特的
优点 ,如衍生化反应定量进行、反应条件温和、紫外
吸收很强、可用于多种分离模式的分析等等。
312 　流动相的优化 :在已有文献的基础上考察了不
同 p H 值及等度与梯度洗脱对分离结果的影响 ,结
果发现 ,p H 515 时 ,采用梯度洗脱分离效果最好。
313 　采用柱前衍生化 RP2HPLC 法同时测定地黄中
3 种还原糖的量 ,结果表明 ,该方法灵敏度高 ,分离度
好 ,为地黄质量控制提供了理论依据和方法基础。
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·679· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月