全 文 ：　图 2 　4 个产地赤芍干叶片提取 DNA的 PCR扩增电泳谱图
Fig. 2 　Electrophoretogram of DNA extracted from dry
leaves of Radix Paeoniae Rubra in four different
habitats by PCR amplif ication
究方法提取的 DNA 做 PCR 扩增时 ,结果都较清
晰 ,稳定效果好 ,说明该方法提取的 DNA 能用于
PCR 等生物技术 ,适用于毛茛科植物的遗传多样性
分析。
3 　讨论
高质量 DNA 的快速提取是决定分子生物学实
验成败的关键因素。由于不同植物所含化学成分差
异较大 ,因此对不同植物 DNA 提取应采取不同的
方法。有时受条件限制 ,植物材料只能以干燥方式
保存 ,其提取方法又应不同。由于要对不同产地的
赤芍作比较 ,赤芍叶片只能以干燥方式保存 ,且因其
含较多多糖、蛋白质和小分子杂质 ,常规方法不能很
好地将杂质去除干净 ,影响后续的分子生物学实验
结果。因此本研究在常规 SDS 法基础上 ,优化各提
取步骤 ,获得了一种快速提取赤芍干叶片 DNA 的
方法。用该方法所提取的 DNA 完全能够达到分子
生物学实验要求 ,应用于 PCR 分析 ,结果满意。说
明如果受野外采集条件限制 ,用硅胶干燥叶片保存
后带回实验室再提取也不失为一种补充手段 ,但硅
胶干燥叶片不宜久存 ,否则 DNA 得率会降低。本
方法的一大特点就是快速 ,因为提取时间越长 ,
DNA 越易受环境污染 ,快速有利于提高纯度。结果
表明 :该方法可快速地从富含多糖、蛋白质和小分子
杂质的毛茛科药用植物干叶片中分离出高质量的
DNA。
使用此方法时应注意 : PV P 以固体形式加入最
好 ,PV P 与样品在液氮环境中共研要迅速和充分 ,
磨碎后要尽快加入预热的提取缓冲液 ,以防止氧化 ;
高浓度 SDS 可去除多糖 ,改良方法中提高了 SDS 浓
度 ,多糖去除较干净 ;离心速度不宜太快 ,时间和次
数也要尽量减少 ,以保证 DNA 的完整性 ; 沉淀
DNA 不采用离心 ,而采用玻棒直接挑出也有利于提
高 DNA 纯度 ;沉淀时间也要尽量缩短以防小分子
盐共沉淀和 DNA 颜色变深而影响提取结果 ;用乙
醇反复沉淀 3 次减少了 RNA 的污染 ;纯化后的
DNA 用氮气吹干以减少乙醇污染。
参考文献 :
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吴茱萸多糖的分离和组成研究
徐继华1 ,2 ,刘文英1 3 ,屠旦来1
(1. 中国药科大学 药物分析教研室 ,江苏 南京 　210009 ; 2. 江苏省南通市药品检验所 ,江苏 南通 　226006)
摘 　要 :目的 　对吴茱萸中多糖进行提取、分离和纯化 ,进一步研究吴茱萸多糖主要组分的单糖组成。方法 　采用
水提醇沉法提取粗多糖 , H2 O2 脱色、Sevag 法除蛋白、透析制备精制品 ,用 DEA E232 纤维素阴离子交换柱、
Sephacryl S2400 SF 型凝胶柱分离纯化多糖 ,经酸水解后 ,12苯基232甲基252吡唑啉酮 ( PMP)柱前衍生化 HPLC 法分
析单糖组成。结果 　从吴茱萸中分离纯化得两个主要多糖组分 ERPS2a、ERPS3 ,二者的单糖组成均为甘露糖、鼠
·375·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008207204　　　
作者简介 :徐继华 (1978 —) ,男 ,江苏南通人 ,硕士研究生。Tel : 13912274510 　E2mail :xujihua45 @hot mail . com3 通讯作者　刘文英　Tel : (025) 83271251 　E2mail :lwcpu @126. com
李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖 , ERPS2a 的单糖物质的量比为 211 ∶216 ∶314 ∶110 ∶719 ∶419 ,
ERPS3 的单糖物质的量比为 110 ∶1716 ∶217 ∶312 ∶1918 ∶914。结论 　吴茱萸多糖得到有效分离纯化 ,两纯组
分所含单糖种类相同 ,仅各单糖的组成比例不同。
关键词 :吴茱萸 ;多糖 ;柱前衍生化 HPLC ;单糖组成
中图分类号 :R284. 2 ; R286. 02 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0420573204
　　吴茱萸为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸 Evodi a
rut aecarp a (J uss. ) Bent h. 、石虎 E. rut aecar p a
(J uss. ) Bent h. var . of f ici nal is (Dode) Huang 或
疏毛吴茱萸 E. rut aecar p a (J uss. ) Bent h. var .
bodi nieri (Dode) Huang 的干燥近成熟果实 ,为《中
国药典》2005 年版一部收载品种 ,始载于《神农本草
经》,列为中品 ,具散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等
功效。吴茱萸中含有生物碱、苦味素、挥发油、多糖、
氨基酸和黄酮等多种有效成分 ,其中多糖的量丰
富[1 ] 。初步研究表明吴茱萸多糖具有抗氧化作
用[2 ] ,预示其作为抗衰老作用新药或保健品开发的
可能性。本实验对吴茱萸中多糖进行提取、分离和
纯化研究 ,同时分析吴茱萸多糖中主要组分的单糖
组成。
1 　仪器与试药
B T00 —100M 兰格蠕动泵 , YZ1515 泵头 (保定
兰格恒流泵有限公司) ;UV —260 紫外2可见分光光
度计 (日本岛津) ; H P1050 高效液相色谱仪 (美国) ;
SEDEX 75 L T2EL SD 蒸发光散射检测器 (法国) ;江
申 J S - 3050 型色谱工作站 (含 GPC 软件) ; Agilent
1100 Series 高效液相色谱仪 ,ChemStations 色谱工
作站。
吴茱萸药材购于先声药店 ,产地为贵州 ,经中国
药科大学中药学院生药研究室张朝凤副教授鉴定
为芸香科吴茱萸 E. rut aecar p a (J uss. ) Bent h. 的
干燥近成熟果实 ; D EA E232 纤维素 ( Whatman 公
司) ; Sep hacryl S2400 Super Fine ( Pharmacia Fine
Chemicals AB 公司) ; D2葡萄糖 ( D2glucose , Glu ,
AR ,上海惠兴生化试剂有限公司) ; L2阿拉伯糖 ( L2
arabinose , Arab , Sigma 公司 ) 、D2半乳糖 ( D2
galactose , Gal) ( Amresco 公司 ,北京经科公司分
装) ; L2鼠李糖[ L ( + ) rhamnose , Rha , England B.
D. H Laboratory Chemicals Group ] ; D2甘露糖 ( D2
mannose , Man) (Supelco 公司) ;半乳糖醛酸 (galac2
t uronic acid , GalA , Fluka 公司) ; 12苯基232甲基252
吡唑啉酮 ( PMP) (甲醇重结晶两次 ,上海化学试剂
采购供应站试剂厂) ;乙腈 (色谱纯 ,Merck 公司) ,其
他试剂均为分析纯 ,重蒸水 (自制) 。
2 　方法与结果
211 　粗多糖的提取 :将吴茱萸药材粉碎 ,过 24 目
筛。称取药材粉末 100 g ,5 倍量石油醚回流脱脂 ,
挥干药粉 ,分别加 15、12、10 倍量水 ,分 3 次采用 90
℃水浴浸提 2 h ,用 2 层纱布滤过。收集 3 次滤液 ,
减压浓缩至 200 mL , 离心 , 取上清液加乙醇至
80 % ,静置沉降 ,抽滤 ,沉淀物加水 200 mL 溶解 ,加
乙醇至 80 %再醇沉 1 次 ,依次用无水乙醇、丙酮、无
水乙醚洗涤 ,沉淀物 60 ℃真空干燥 ,得灰褐色粗多
糖约 5 g。
212 　粗多糖的精制 :取吴茱萸多糖粗品 ,加水 500
mL ,加热使完全溶解 ,加氨水调 p H 718 ,有沉淀产
生 ,继续滴加氨水至不再产生沉淀 ,此时溶液 p H 值
维持在 718 ,4 000 r/ min 离心。取上清液加 30 %
H2 O2 (糖溶液体积的 20 %) [3 ] ,于 40 ℃保温 4 h ,溶
液由褐色转为淡黄色透明液 ,放冷至室温。脱色素
后的糖溶液 ,加入 1/ 4 体积的氯仿2正丁醇 (1 ∶4) 振
摇 ,弃去下层凝胶样物质。取上层溶液同法处理 ,直
至下层溶液不再出现白色凝胶样物质。将除完蛋白
的糖溶液置透析袋中流水透析 24 h ,蒸馏水透析过
夜。将保留液 (透析内液) 浓缩至原体积的 1/ 3。透
析内液加入乙醇 ,使含醇量达到 80 % ,静置沉降 ,抽
滤 ,依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤 ,沉淀物
60 ℃真空干燥 ,得类白色多糖精制品[4 ] 。
213 　多糖组分的分离纯化[5 ,6 ] :取吴茱萸多糖精制
品约 100 mg ,加蒸馏水 5 mL 溶解 ,采用 DEA E232
纤维素柱 (22 cm ×215 cm) ,先用蒸馏水洗脱 ,自动
收集器收集 , 2 mL/ 管 ,每管 5 min ,然后依次用
0105、011、012、015、2 mol/ L NaCl 溶液做阶段洗
脱 ,用苯酚2硫酸法逐管测定多糖 ,直至多糖呈阴性
反应 ,洗脱曲线见图 1。合并主峰部分 ,透析除盐 ,
减压浓缩至小体积 ,80 %乙醇沉淀 ,砂芯漏斗抽滤 ,
用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤 ,60 ℃真空干燥 ,
得主要组分 ERPS2、ERPS3。ERPS2、ERPS3 分别
为 012、015 mol/ L NaCl 溶液洗脱部分。
214 　高效凝胶色谱 ( HP GPC)检查质量分数
21411 　色谱条件 :色谱柱为 Shodex Ohpak SB2805
HQ 与 Shodex Ohpak SB2804 HQ 串联 (300 mm ×
8 mm ,日本昭和电工) ;流动相 :重蒸水 ;体积流量 :
016 mL/ min ; EL SD 检测器漂移管温度 : 50 ℃,
·475· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
洗脱管数
图 1 　DEAE232 纤维素阴离子交换柱对多糖的洗脱曲线
Fig. 1 　Eluting curve of polysaccharides on DEAE232
cellulose anion exchange column
ELSD 检测器压力 :315 ×105 Pa , EL SD 检测器 gain
值 7。
21412 　结果 : ERPS3 为均一性成分 ,色谱图见图 2。
ERPS2 含相对分子质量不同的两个组分 ,色谱图见
图 2。
21413 　进一步纯化、鉴定 :采用 Sep hacryl S2400 SF
凝胶对 ERPS2 进行纯化。取 ERPS2 100 mg ,溶解
于 1 mL 水中 ,高速离心 ,取上清液上样 ,重蒸水以
16 mL/ h 洗脱 , 分部收集洗脱液 , 2 mL/ 管 , 以
H P GPC 跟踪检测 ,合并主峰部分 ,透析除盐 ,减压
浓缩至小体积 ,80 %乙醇沉淀 ,砂芯漏斗抽滤 ,用无
水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤 ,60 ℃真空干燥 ,得主
要组分 ERPS2a ,色谱图见图 2。
t/ min
图 2 　ERPS3 ( A) 、ERPS2 ( B)和 ERPS2a ( C)高效凝胶色谱图
Fig. 2 　HPGPC of ERPS3 ( A) , ERPS2 ( B) , and ERPS2a ( C)
215 　理化性状 : ERPS2a 为白色粉末 , ERPS3 为灰
白色粉末 ,都溶于水 ,尤其是热水 ,而不溶于丙酮、乙
醇、乙醚 ,苯酚2硫酸反应呈阳性 ,糖醛酸检查呈
阳性。
216 　柱前衍生化 HPL C 法测定单糖的组成
21611 　完全酸水解溶液的制备 :取多糖组分各 20
mg 分别置于安瓿中 ,各加入 1 mol/ L H2 SO4 2 mL
溶解后封管 ,于 105 ℃条件下水解 8 h。切开封管 ,
用 BaCO3 中和水解液 ,4 000 r/ min 离心 ,即得组分
的完全酸水解溶液。
21612 　样品的衍生化处理[ 7 ,8 ] :取单糖对照品或样
品完全酸水解溶液 80μL ,置于 2 mL 离心管中 ,加
入 80μL 0125 mol/ L PMP 甲醇溶液和 80μL 012
mol/ L NaO H 溶液 ,涡旋 30 s 后置于 70 ℃水浴 30
min ,取出 ,室温放置 10 min ,再加入 80 μL 012
mol/ L 盐酸溶液中和 ,涡旋 30 s 后 ,用 0164 mL 乙
酸异戊酯萃取 ,涡旋 3 min ,12 000 r/ min 高速离心
5 min ,小心弃去上层有机层 ,取水层再用乙酸异戊
酯萃取 1 次得下层水层 ,加 0164 mL 氯仿 ,同法萃
取 1 次 ,小心弃去下层氯仿层 ,取上层水层进行
HPL C 法分析。
21613 　色谱条件与系统适用性试验 : Phenomenex
C18色谱柱 (250 mm ×416 mm , 5μm) ,柱温 30 ℃;
流动相 : A 乙腈220 mmol/ L 乙酸铵水溶液 (15 ∶
85) ,B 乙腈220 mmol/ L 乙酸铵水溶液 (40 ∶60) ,
0 →25 min ,B : 0 % →50 % ;检测波长 : 250nm ;体积
流量 :112 mL/ min ;进样量 :20μL 。
21614 　试验结果 :取 1 mmol/ L 单糖对照品溶液、
单糖混合对照品溶液和样品完全酸水解溶液 ,衍生
化后进行 HPL C 分析 , H PL C 图见图 3。
t/ min
图 3 　混合单糖对照品溶液( A)和样品水解液( B)衍生化后的
HPLC图
Fig. 3 　HPLC of mixed monosaccharide reference
solution ( A) and monosaccharide derivatives
in acidic hydrolysis sample ( B)
217 　样品单糖组成分析 :取组分 ERPS2a、ERPS3
完全酸水解溶液 80μL ,进行衍生化和 HPL C 分析。
同时取 1 mmol/ L 混合单糖对照品溶液进行衍生化
和 HPL C 分析。将样品水解液衍生化后 H PL C 图
与混合单糖对照品溶液衍生化后 H PL C 图进行对
照 ,判断单糖组成。计算样品中各单糖的浓度 ,根据
所得各单糖浓度 ,以浓度最小者比值设为 1 ,从而得
出样 品 中 各 单 糖 组 成 比 例。结 果 多 糖 组 分
ERPS2a、ERPS3 的单糖组成均为甘露糖、鼠李糖、
半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖 , ERPS2a 的
单糖物质的量比为 211 ∶216 ∶314 ∶110 ∶719 ∶
419 ,组分 ERPS3 的单糖物质的量比为 110 ∶171 6 ∶
217 ∶312 ∶1918 ∶914。
·575·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 　讨论
由于药材中可能含有黏液质 ,粗多糖提取前药
材粉碎不可过细 ,否则细胞壁破裂黏液质流出难以
滤过。多糖在高温下容易发生裂解 ,因此提取和浓
缩时温度不可过高 ,否则多糖可能易被破坏 ,本实验
采用 90 ℃水浴浸提。
粗多糖精制中 ,采用 H2 O2 脱色法可以脱除与
蛋白质、多糖等大分子结合的色素 , 效果明显。
H2 O2 脱色时温度为 40～50 ℃,温度过高多糖易被
破坏 ;温度过低达不到脱色的效果。除蛋白采用经
典的 Sevag 法 ,效果较明显 ,Sevag 法除蛋白需反复
多次 ,直至分层处无白色凝胶状物质出现。
本实验采用 DEA E232 纤维素阴离子交换柱、
Sep hacryl S2400 SF 凝胶柱分离纯化了吴茱萸多糖
主要组分 ,得到两个多糖组分 ERPS2a、ERPS3。蒸
馏水洗脱部分未见多糖组分 , ERPS2a、ERPS3 分别
为 012、015 mol/ L NaCl 溶液洗脱组分。推断吴茱
萸多糖中基本不含中性多糖 ,含有酸性多糖 ,该结果
与预试中季铵盐 CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)沉
淀法结果吻合。从组分单糖组成测定结果看
ERPS2a、ERPS3 中均含有一定量的半乳糖醛酸 ,也
证实了组分为酸性多糖。
在单糖组成分析方法中 ,气相色谱法分离单糖
繁琐费时 ,易出现色谱峰异构化裂分。H PL C 法测
定单糖可用糖分析柱和氨基键合相柱 ,但其价格昂
贵 ,分析成本高。同时单糖没有 C = C 双键和共轭
结构等生色团 ,分离后直接进行紫外检测比较困难。
本实验采用 PMP 衍生化方法将单糖转化成具有紫
外活性的物质 ,然后采用反相 H PL C2UV 法进行单
糖组成研究 ,同时分离测定了 6 种单糖和 1 种糖醛
酸 ,改善了分离特性 ,提高了检测灵敏度。同时
PMP 与单糖衍生时条件温和 ,操作简单 ,该方法可
推广应用到其他多糖。
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HPLC法测定复方紫草颗粒中咖啡酸四聚体异构体
秦冬梅1 ,买尔旦2 3 ,李 　静3 ,王新兵1
(1.石河子大学药学院 ,新疆 石河子 　832000 ; 2. 新疆医科大学附属肿瘤医院 ,新疆 乌鲁木齐 　830011 ;
3. 石河子大学第一附属医院 ,新疆 石河子 　832000)
摘 　要 :目的 　建立 HPLC 法测定复方紫草颗粒剂中咖啡酸四聚体异构体的方法。方法 　YMC ODS2A C218 色谱
柱 (250 mm ×416 mm , 5μm) ;流动相 :甲醇2015 %磷酸水 (40 ∶60) ;体积流量 :1 mL/ min ;检测波长 :252 nm ,柱温 :
室温 ;进样量 :10μL 。结果 　咖啡酸四聚体异构体在 01052～1165μg 与峰面积值呈良好的线性关系。平均回收率
为 1011 8 % , RSD 为 2146 %。结论 　本方法简便可靠 ,结果稳定 ,重复性好 ,可用于测定复方紫草颗粒剂中咖啡酸
四聚体异构体。
关键词 :复方紫草颗粒 ;咖啡酸四聚体异构体 ;高效液相色谱
中图分类号 :R286. 02 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0420576203
　　复方紫草颗粒是由紫草、丹参、黄芪、人参组成 ,
具有抗病毒、增强机体免疫之功效。咖啡酸四聚体
及其旋光异构体是紫草中的活性成分。经体外抗
HIV 药效筛选发现 :咖啡酸四聚体及其旋光异构体
·675· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008207228　　　
作者简介 :秦冬梅 (1976 —) ,女 ,江苏省赣榆县人 ,讲师 ,2007 年获新疆医科大学药学院医学硕士 ,主要从事药剂学教学及中药民族药研
究。Tel : 13999738518 　E2mail :dongmeiqinli @163. com3 通讯作者　买尔旦