全 文 ：·1200· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
红景天苷对大鼠缺血性脑水肿的影响
冉建华1，孙善全，汪克建1，毕恣2，陈 海1，谭 戈1
(1．重庆医科大学解剖学教研室神经生物研究室，重庆400016；2．重庆医科大学应用技术学院附属医院，重庆400016)
摘 要：目的 研究红景天苷(salidroside)对水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)在大鼠缺血性脑组织中表达的影
响。方法采用线拴法制作大鼠局灶性脑缺血模型，实验分为模型组、假手术组、红景天苷组。通过光镜技术观察各
组别脑水肿区的病理变化，干湿质量法检测脑含水量，采用原位杂交、免疫组化方法观察AQP4及其mRNA在脑
组织中的表达，硫代巴比妥酸法和定磷法测定缺血脑组织中丙二醛(MDA)、Na+，K+-ATPase活性。结果缺血
后模型组的细胞及血管周围间隙明显扩大，部分细胞坏死，神经胶质细胞增生；大鼠穹隆下器官、脉络丛、大脑皮
质、视上核、海马等部位AQP4及其mRNA的表达上调，48～72h达峰值，脑组织含水量亦在72h达高峰。红景天
苷组脑组织形态结构无明显改变，脑组织含水量、MDA水平、AQP4及其mRNA的表达明显低于模型组；而Na+，
K+一ATPase活力明显高于模型组。结论红景天苷可抑制缺血性脑水肿组织中AQP4及其mRNA的过表达，防
止脑水肿的发生。
关键词：红景天苷；水通道蛋白4(AQP4)；缺血性脑水肿
中图分类号：R74 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)08—1200一05
Effectofsalidrosidenischemiccerebraledemaofrats
RANJian—hual，SUNShah—quanl，WANGKe—jianl，BIZi2，CHENail，TANGel
(1．DepartmentofAna omy，DepartmentofNeurobiology，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，Chinal
2．AffiliatedHospitalofCollegeofAppliedT chnology，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)
Abstract：ObjectiveTos udytheffectofsalidrosidenaquaporin4(AQP4)expressioninthe
ischemiccerebraltissuesofrats．MethodsAtotalof160healthyadultWistarr tsweredividedintothree
groupsrandomly，themodelgroup，theS amgroup，andthesalidrosidegroup．MCAOodelswere
establishedbyoccludingunilateralmiddlecerebralartery(MCA)oftheratswiththesuturem thod．The
morphologicalchangesw reobservedwithHEstain．Brainwatercontent(BWC)wasmeasuredbyusing
wet—dryweighingmethod．TheexpressionofAQP4anditsmRNAinthecerebraltissuew redetected
withinsituhybridization(ISH)andimmunohistoehemistry(IHC)．ThecontentofMDAandactivityof
Na+．K+一ATPaseweredetected．ResultsThespacearoundtheneuronsa dperivascularspaceb came
larger．Someneuronsshowednecrosisphenotype，andthenumberoftheneurogliocyten reased．The
expressionofAQP4anditsmRNAwereup—regulatedinsubfomicalorgan(SFO)，choroidplexes，brain
cortex，supraopticnucle ，hippocampus，andotherregio s，andreacheditspeakat48—72hinthemodel
groupafterMCAO．TheBWCinischemiccerebraltissuer acheditspeakat72h．Afteroperation，the
morphologicalphenotypewasnotsignificantlyhangedintheShamgroupandthesalidrosidegroup．
BWC，MDAlevel，contentcha gesofAQP4，anditsmRNAexpressionweresignificantly10werthan
thoseinthemodelgroup．However，theactivityofNa+，K+一ATPaseweresiginificanthigherthanthatin
themodelgroup．ConclusionSalidrosidecouldeffecientlysuppresstheover—expressionofAQP4andits
mRNAintheischemiccerebraltissuesofratswhichresultin heformationof schemiccerebraledema．
Keywords：salidroside；aquaporin4(AQP4)；ischemiccerebraledema
脑水肿是继发于多种脑疾病的最终病理现象，
也是造成颅内高压，形成脑疝而致人死亡的关键因
素。因此，脑水肿的诊断和治疗一直是I临床重点探讨
的课题之一。研究发现，脑水肿发生的关键是脑细胞
膜内外水、电解质的分布失衡，从而破坏了脑细胞内
环境的稳定及结构的完整性‘1。。近年来的研究证实，
收稿日期：2008—01—17
基金项目：重庆市教委科技基金资助项目(KJ050307)l重庆医科大学启动基金资助项目(QD200314)
作者简介：冉建华(1974一)，女，四川省攀枝花市人，副教授，博士，主要研究方向为脑水肿形成机制。
Tel：(023)68485763E-mail：ranjianhua2003@yahoo．corn．ca
-通讯作者孙善全Tel：(023)68485763
万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1201·
水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)过表达在脑水
肿形成过程中起重要作用[2]。红景天苷是中药红景
天的主要活性成分，对缺血再灌注损伤的鼠脑组织
具有保护作用，可防止脑水肿的发生发展，但缺乏对
其作用机制的深入研究[3一]。因此，本研究通过制作
大鼠局灶性脑缺血模型，观察红景天苷对于缺血性
脑水肿组织中AQP4表达的影响，为红景天苷治疗
脑水肿的分子机制提供理论依据。
1材料与方法
1．1材料：多通道电子蠕动泵(DDB--300，浙江象
山石浦海天电子仪器厂)、生物研究显微镜(BM—E，
Leica)、原位杂交专用载玻片和盖玻片(武汉博士
德生物有限公司)。
AQP4多克隆抗体(美国Sigma公司)、免疫组
化试剂盒(通用型SABC试剂盒，北京中山生物有
限公司)、BCIP／NBT和AEC试剂盒(北京中山生
物有限公司)、AQP4cRNA探针(上海生工生物技
术公司)、原位杂交专用试剂盒(武汉博士德生物有
限公司)、MDA及Na+，K+-ATPase检测试剂盒
(南京建成科技有限公司)、红景天苷(由昆明同持
生物科技有限公司提供，HPLC测定质量分数
99．6％)。
健康成年Wistar大鼠120只，雌雄兼用，体质
量200～280g，由重庆医科大学实验动物中心提
供，符合国家二级实验动物标准。
1．2动物模型的制备、分组及给药：Wistar大鼠随
机分为模型组、假手术组、红景天苷组，每组动物每
一时相点各30只。模型组、红景天苷组大鼠麻醉
后，取颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内和颈外动
脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，在颈总动脉近分权处
剪一“V”字形切口，将多聚赖氨酸处理过的鱼线
(d=0．26ram)经切口插入颈内动脉约18～20mm
(根据动物大小调整插入鱼线的深度)，阻塞右侧大
脑中动脉，固定外端的鱼线，缝合皮肤，ip青霉素预
防感染，假手术组除不插鱼线外，其余操作相同；红
景天苷组术后ip红景天苷(根据本研究前期不同
红景天苷剂量组对组织形态学改变、脑梗死体积、行
为学症状评价结果选用50mg／kg的剂量)，大鼠清
醒后回笼自由进饮食，给予正常进食饮水，观察神经
症状和体征，依据Zealonga5分制评分标准，神经缺
损评分大于2分者判为造模成功，分别于脑缺血后3
h、24h、48h、3d、7d后取脑。
1．3 病理组织学观察(光镜)：到达预定时相点的大
鼠经左心室生理盐水冲洗，4％多聚甲醛灌注固定，
迅速取脑，4％多聚甲醛后固定，常规石蜡包埋，切
片，HE染色，观察病变区及附近脑组织病理变化。
1．4脑组织含水量(BWC)的测定：采用干湿质量
法。不同时相点大鼠处死后迅速取脑，去除皮质表面
的软脑膜、小脑、脑干，取梗死侧大脑半球置于称量
杯中称湿质量，然后放入电热恒温箱中，100℃烘
烤至恒质量，再称干质量(两次干质量之差≤0．2
mg)。按以下公式计算脑含水量。
脑组织含水量一(湿质量一干质量)／湿质量X100％
1．5免疫组化检测AQP4蛋白的表达变化：造模
成功的大鼠在各相应时间点经灌流固定、后固定后，
在冰冻切片机上做连续冠状切片，片厚20弘m，室温
晾干备用，采用SABC法检测AQP4表达变化。实
验操作步骤按试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗
作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。
1．6 原位杂交检测AQP4tuRNA的表达：用
PrimerPremier5软件设计寡核苷酸探针，序列为：
57一GACTCCTGTTGTCCTCCACCTCCATGTAG—
CTCCCTTTTGTT一37，经DNA合成仪合成探针，采
用地高辛标记试剂盒(上海生工产品)作末端标记。
造模成功的大鼠在各相应时间点经灌流固定、
后固定后，在冰冻切片机上作连续冠状切片，片厚
20弘m，室温晾干备用。原位杂交实验操作步骤按试
剂盒说明书进行，用PBS代替AQP4探针作阴性
对照，已知阳性切片作阳性对照。
1．7缺血脑组织中丙二醛(MDA)水平及Na+，
K+-ATPase活性测定：取损伤侧脑组织50mg，用
匀浆介质配成10％脑组织匀浆进行以下检测。采
用硫代巴比妥酸法测定MDA的量。Na+，K+一
ATPase活性测定采用定磷法，规定每小时每毫克
组织蛋白的ATP酶分解ATP产生1pm01无机磷
的量为一个ATP酶活力单位。蛋白定量采用考马
斯亮蓝法。
1．8图像分析及统计学处理：光学显微镜下，随机
选取原位杂交和免疫组化同一部位切片的10个不
同视野进行观察。采用北航CM一2000B生物医学图
像分析系统进行自动分析。分析结果以细胞平均吸
光度值(以)表示。数据以z士s表示，用SAS8．1统
计分析程序对各组数据进行重复测量数据的方差分
析和相关性检验。
2结果
2．1大鼠生理行为和活动的变化：造模后大鼠活动
减少，精神萎靡，右侧Horner7s征阳性，不能伸左
前肢；行走时向左侧转圈；爬板时，向左侧跌落；提尾
万方数据
·1202· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第g期2008年8月
时，左前肢内收，头弯向左上。有的大鼠完全不能自
主运动，甚至出现大小便失禁。
2．2脑组织含水量的变化：假手术组脑组织含水量
随时间延长，无明显变化。手术3h后，模型组缺血
侧脑组织含水量较假手术组相比明显增加(P<
0．05)，随缺血时间的延长，脑组织含水量增加显著
(Pd0．05)。其中3～24h脑含水量增加较快，48～
72h增加放缓，至72h达到峰值后下降，1周后仍
高于正常水平。手术3h后，红景天苷组脑组织含水
量增加(P时间延长无明显变化。结果见图1。
84
芝82
矍80
加78
墁76
74
+假手术组
--4$,--模掣组
+红景天苷组
图1各组不同时间段脑组织含水量
Fig．1BWCofthreegroupsatdifferenttimes
2．3大鼠脑组织形态学的病理观察：肉眼观察可见
模型组动物缺血侧的脑组织不同程度的肿胀，说明
造模成功，而假手术组及红景天苷组无明显变化。光
镜下，假手术组的脑组织结构完整，神经元和胶质细
胞形态较为正常(图2)。模型组造模后3h可见缺血
组织有水肿改变，星形胶质细胞的胞质淡染，细胞间
隙增宽；24h脑组织变得疏松，部分肿胀的星形胶
质细胞胞膜破裂，细胞间隙和血管周围间隙明显增
宽(图2)；48～72h脑组织疏松更加明显，细胞周围
间隙扩大，病灶中心坏死区可见少量残存的神经元
和大量增生的胶质细胞。红景天苷组大鼠大脑皮层
梗死灶区神经细胞缺失明显少于模型组，其周围可
见部分结构完整的神经细胞(图2)。
2．4免疫组化染色检测AQP4蛋白：阴性对照未
见AQP4蛋白表达。各组中，在海马、室旁核、室上
核、皮质、脑室及脉络丛等处，都可以见到密集排列、
轮廓清楚、胞膜呈紫蓝色或紫红色、胞浆及胞核不着
色的AQP4表达阳性的细胞。AQP4在假手术组的
表达呈弱性，随时间延长无明显变化。造模3h后，
模型组及红景天苷组AQP4表达开始上调(尸<
o．05)，但红景天苷组的表达水平明显低于模型组；
AQP4表达随缺血时间延长上调(P<0．05)，其中
48～72h表达最强，此后逐渐下降，但一周内仍高
于正常水平(P白的表达与脑含水量的变化呈正相关(P结果见表1和图3。
图2 24h大鼠皮质神经元的病理结果
Fig．2Pathologicresultsofneuroninratscortexat24h
表l缺血脑组织AQP4蛋白的表达变化(；士$，一=6)
Table1 ChangesofAQP4proteinxpressionin schemiccerebraltissue(工士s，n--6)
与假手术组比较：6P△P<0．0505Shamgroup；’P<0．05wmodelgroup(3h)，followingtablesaresame
2．5原位杂交检测AQP4mRNA的表达：阴性对示的部位基本一致。但AQP4mRNA在阳性细胞
照未见AQP4mRNA阳性表达。各组AQP4中的表达部位与AQP4tuRNA蛋白的表达略有不
mRNA在脑组织中表达的部位(缺血灶周边的水同：AQP4mRNA阳性产物主要分布在细胞的胞膜
肿区、血管周围及白质的星形胶质细胞、脉络丛、室 和胞浆，染色呈紫蓝色或紫红色，同时胞浆着色明显
管膜、室上核和室旁核、海马等)同免疫组化结果显 比胞膜浅，随缺血时间的延长，在缺血最为严重的组
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1203·
织中可见部分细胞的胞核着色。
假手术组脑组织中AQP4mRNA表达为弱阳
性，随时间延长无明显变化。造模3h后，模型组
AQP4mRNA的表达开始增高(P间的延长染色逐渐增强(P达峰值后，AQP4mRNA表达逐渐回落。造模3h
后，红景天苷组AQP4mRNA的表达开始增高
(P<0．05)，但明显低于模型组，其在24h到达峰
值后下调，1周后基本恢复到正常水平。模型组脑组
织中AQP4mRNA与AQP4的表达变化呈正相
关。结果见图4和表2。
2．6 缺血脑组织中MDA水平、Na+，K+一ATPase
Fig．4ExpressionofAQP4mRNAinratscortexat72h
裘2缺血脑组织AQP4mRNA的表达变化(；土j，矗一6)
Table2 ChangesofAQP4mRNAexpressionIn schemiccerebraltissue(；士s，厅=6)
活性测定：假手术组脑组织MDA量及Na+，K+一
ATPase活性随时间延长，无明显变化。造模3h
后，模型组与红景天苷组缺血侧脑组织MDA量较
假手术组相比明显增加，而Na+，K+一ATPase活性
呈下降趋势(P<0．05)；随缺血时间的延长，脑组织
MDA量增加显著(P下降，1周后仍高于正常水平；而Na+，K+-ATPase
活性下降到72h后开始上升，1周后仍低于正常水
平。其中，红景天苷组脑组织MDA量增加水平明显
低于模型组，并且随时间延长无明显变化；而Na+，
K+一ATPase活性明显高于模型组。结果见表3、4。
3讨论
3．1 AQP4在缺血性脑水肿形成中的作用：脑水肿
是缺血性脑血管最常见的并发症之一，其形成机制
的研究一直是神经科学重点探讨的课题之一。而目
前存在的有关脑水肿形成的众多学说，均无法对脑
组织中水、电解质的平衡机制作出全面的解释。水通
道蛋白(aquaporins，AQPs)的发现为脑水肿形成
机制的研究提供了新的思路[2’5“]。AQPs是一类介
导水分子快速跨膜转运的细胞膜蛋白，其转运受渗
透压梯度驱使。目前在哺乳动物体内发现AQPs有
13个成员(AQP0～AQPl2)，其中，AQP4在脑组
织中的分布广泛，量丰富，推测其参与了脑组织水、
电解质的运输平衡调节。
本研究结果发现，AQP4及其基因在缺血性脑
水肿组织中的表达为一动态变化过程，即从缺血后
3h开始上调，24h内增加显著，至72h到达峰值
后下降，1周后仍高于假手术组，并与脑含水量的增
万方数据
·1204· 中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
表3缺血脑组织MDA量的变化(；士s，一=5)
Table3 ChangesofMDAcontenti ischemiccerebraltissue(；士s，厅=5)
表4缺血脑组织Na+，K+-ATPase活性变化(；土s，甩一5)
Table4 ChangesofNa+，K+．ATPaseactivityinischemiccerebraltissue(；士，，席=5)
加呈显著正相关，这一结果与Taniguchi等哺1研究
结果基本一致。同时，通过对缺血脑组织中MDA水
平、Na+，K+-ATPase活性测定结果显示，造模3h
后，模型组缺血侧脑组织MDA量较假手术组相比
明显增加，而Na+，K+-ATPase活性呈下降趋势
(P<0．05)，MDA量增加提示缺血导致脂质过氧
化，继而损伤到调节质膜两则离子分布的Na+，
K+-ATPase，后者活性的降低是脑缺血损伤病理生
理机制之一，主要导致细胞内Na+堆积，K+丢失，细
胞内外离子分布紊乱，渗透压发生改变，激活了星形
胶质细胞上作为水通道和渗透压受体的AQP4，导致
细胞膜结构发生改变，从而增加细胞膜对水的通透
性，导致细胞内水肿。以上结果表明，AQP4在缺血性
脑水肿的发生和发展过程中起重要作用，抑制AQP4
的过表达可能是防治脑水肿的一种有效途径。
3．2红景天苷对大鼠缺血性脑损伤的保护作用及
其机制的探讨：红景天属于天然珍贵药用植物，素有
“高原人参”和“雪山仙草”之称。人们发现红景天具
有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗辐射、抗肿瘤、抗病毒
等多种功效，且对中枢神经系统及心血管系统有重
要影响，对机体具有双向调节的作用[7]。近年有研
究Ez,4]表明，红景天提取物具有治疗脑水肿的作用，
但其研究仅仅局限于脑含水量变化、酶学变化等指
标间接证实了这一功能，缺乏对其治疗机制的深入
研究。
本研究结果发现，术后注射红景天苷(50rag／
kg)脑组织MDA量增加水平明显下降，并且随时
间延长无明显变化，而Na+，K+一ATPase活性明显
升高。由此推断，红景天苷可能通过抑制脂质过氧
化，阻止活性氧对细胞膜的损伤，保护Na+，K+一
ATPase的正常结构和功能，从而维持细胞内外离
子的正常分布以及渗透压的稳定。同时，红景天苷可
使脑组织含水量增加水平、AQP4及其mRNA的
表达明显下调，并且随时间延长无明显变化，提示红
景天苷可能通过维持细胞内外水、电解质的稳定而
有效抑制AQP4及其mRNA的过表达，减少细胞
膜对水的通适性，防止细胞内水肿的发生。
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万方数据
红景天苷对大鼠缺血性脑水肿的影响
作者： 冉建华， 孙善全， 汪克建， 毕恣， 陈海， 谭戈
作者单位： 冉建华,孙善全,汪克建,陈海,谭戈(重庆医科大学解剖学教研室神经生物研究室,重庆
,400016)， 毕恣(重庆医科大学应用技术学院附属医院,重庆,400016)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(8)
被引用次数： 5次

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