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益母草种质资源遗传多样性的 AFLP 分析
余 　琪2 ,沈晓霞2 ,沈宇峰1 ,2 ,陈加红1 3 ,石从广1 ,王志安2 3
(11 浙江大学农业与生物技术学院 ,浙江 杭州 　310029 ; 21 浙江省中药研究所 ,浙江 杭州 　310023)
摘 　要 :目的 　通过对 9 份益母草种质资源的 A FL P 分析 ,探求各种质间的遗传多样性。方法 　采用扩增片段长
度多态性 (A FL P) 标记 ,在 DNA 水平上进行遗传多样性研究 ,筛选了 32 对选择性扩增引物 ,将扩增出的条带作
为原始矩阵 ,用 N TSYS2PC 软件计算并分析了益母草种质间的相似度 ,构建了遗传系统进化树。结果 　SDS 法提
取的益母草基因组 DNA 质量较佳 ,能够满足 A FL P 分析的要求 ;从 32 对选择性扩增引物中 ,筛选出 10 对多态性
较强、带型较好、分辨率较高的组合 ;构建了益母草 AFL P 指纹图谱 ,将 9 个益母草种质全部区分开来 ;通过构建进化
树 ,把 9 个种质分成 2 类。结论　益母草种质资源有丰富的遗传多样性 ,某些形态特征差异和基因型存在相关性。
关键词 :益母草 ; 种质资源 ; AFL P ; 遗传多样性
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821296204
AFLP Analysis of genetic diversity of Leonurus j a ponicus germplasm resources
YU Qi2 , SH EN Xiao2xia2 , SH EN Yu2feng1 ,2 , CH EN Jia2hong1 , SH I Cong2guang1 , WAN G Zhi2an2
(11 College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , China ;
2. Zhejiang Research Institute of Chinese Materia Medica , Hangzhou 310023 , China)
Abstract : Objective 　The A FL P analysis of nine accessions of L eonurus j a ponicus was conducted to
explore genetic diversities among germplasm. Methods 　Genetic diversities at DNA level among t he germ2
plasm of L . j a ponicus were studied by t he amplified f ragment length polymorp hism (A FL P) marker , and
32 pairs of selective amplification primer were identified. The similarities among the germplasm of L .
j a ponicus were calculated and analyzed by t he sof tware of N TSYS2PC , and genetic evolution t ree was
developed , using amplified f ragment s as p rimary mat rix. Results 　The quality of genomic DNA of L .
j a ponicus ext racted by SDS met hod was good enough to meet t he requirement of A FL P analysis. Ten
combinations wit h multiple morp hologies , clear bands , and high discrimination rate were identified f rom
32 pairs of selective amplification primers. The A FL P fingerp rinting was developed , which could differen2
tiate each of nine accessions of L . j a ponicus. Nine accessions of L . j a ponicus could be classified into two
types based on t he evolution t ree. Conclusion 　There are richer genetic diversities among t he germplasm
resources of L . j a ponicus , and certain relationship s are found between some of morp hological characteris2
tics and genotypes.
·6921· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008211210　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :浙江省科技厅重大项目 (2005C12002202)
作者简介 :余　琪 (1965 —) ,男 ,浙江 ,学士 ,高级工程师 ,研究方向为中药剂工艺和质量标准。
Tel : (0571) 85229698 　E2mail : yuqi917 @hot mail . com3 通讯作者　陈加红　Tel : (0571) 85241074 　E2mail : chenjiahong @hz. cn
Key words : L eonurus j a ponicus Houtt . ; germplasm resources ; amplified f ragment lengt h polymor2
p hism (A FL P) ; genetic diversity
　　益母草 L eonurus j a ponicus Houtt . 为唇形科
益母草属植物的新鲜或干燥地上部分 ,原名茺蔚 ,始
载于《神农本草经》,别名益母艾、苦草、坤草等 ,其味
辛、微苦 ,性微寒 ,入心包、肝经 ,具有活血调瘀、调经
利水的功能[ 1 ] 。益母草属植物全球分布 23 种 ,我
国有 12 种和 2 个变种 ,广泛分布于全国各地[2 ] 。据
了解 ,因益母草为全国广布种 ,各地均就近收购本地
产益母草入药 ,而对于药材是否因产地不同而具有
品质差异的报道[3 ] 表明其所含生物碱量有所差异。
这就严重影响益母草药材质量的稳定性及临床应用
的效果 ,目前益母草的栽培技术不够完善 ,这已经成
为益母草规范化栽培 ( GA P) 及优良品种 (系) 大
面积推广的瓶颈。所以筛选益母草优质种质资源对
解决当前益母草种质资源混杂 ,指导该品种选育具
有重要的意义。
1 　仪器、试药与材料
　　Bio2Rad smart spec2plus 核酸蛋白分析仪 ,Sig2
ma 3 K15 冷冻离心机 , Bio2Rad Dyad P TC —0220
PCR 仪 ,Bio2Rad GS —800 扫描仪 ,Bio2rad T2A 凝
胶成像仪 ,天能 EPS —100 电泳仪。
A FL P 接头和引物均由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。EcoRI (20 000 U/ mL 、0125
mL) 、MseI ( 10 000 U/ mL 、01025 mL ) 、BSA ( 10
mg/ mL 、0125 mL) 和 T4 DNA Ligase (400 000 U/
mL 、01025 mL) 由纽英伦生物技术 (北京) 有限公
司生产 , T aq DNA 聚合酶 (2 U/μL 、1 000 U) 有北
京鼎国生物技术有限责任公司生产。
实验材料为 9 个益母草种质资源包括采自浙江
义乌、浙江泰顺、山东东营、云南陆良、浙江杭州、福
建龙岩、江西万年、陕西渭南、安徽蚌埠 (依次编号
为 1～9 号) 。由浙江省中药研究所药材资源室教
授俞旭平鉴定为益母草种质。
取新鲜幼嫩叶片提取基因组 DNA。9 份种质
植株地上部分生物学特性、产量、质量分数的相关参
数见表 1 (每份种质测量 10 个单株 ,取平均值) 。
2 　方法
211 　采用 CTAB 法、SDS 法、尿素法 ,对益母草幼
嫩叶片进行基因组 DNA 的提取 ,提取方法参考《植
物基因工程》[4 ] 。
212 　酶切 :每个反应总体积为 20μL ,其中包括 :益
母草基因组 DNA (100 ng/μL) 10μL , EcoRⅠ015μL ,
表 1 　不同来源益母草品系生物学及盐酸水苏碱量相关参数
Table 1 　Correlation parameter of biological characters
and stachydrine hydrochloride content
in L. j a ponicus from different origins
序号
品系
来源
当日最低温度
≥4 ℃ ≤- 4 ℃
产量/
(kg ·hm - 2 )
盐酸水苏碱/
% (开花干草)
1 浙江义乌 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 280 11895
2 浙江泰顺 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 227 11689
3 山东东营 稍冻蔫 　 冻蔫 ,未恢复 693 01976
4 云南陆良 稍冻蔫 　 冻蔫 ,未恢复 1 147 11368
5 浙江杭州 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 227 11489
6 福建龙岩 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 200 01627
7 江西万年 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 173 01693
8 陕西渭南 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 120 01968
9 安徽蚌埠 生长良好 冻蔫 ,后恢复 1 067 11448
Mse Ⅰ 015 μL ,BSA 012 μL , EcoR ⅠBuffer 2. 0
μL ,dd H2 O 618μL 。37 ℃酶切 5 h ,酶切后 70 ℃
反应 15 min ,使酶失活 ,再次离心后放置在冰上。
213 　连接 :酶切后 ,在酶切体系中加入接头连接反
应液。 EcoRI 接 头 的 上 游 接 头 为 5′2CTCG2
TA GACT GCGCGTACC23′,下游接头为 5′2AA T2
T GGTACGCA GTCTAC23′; Mse Ⅰ接头的上游接
头为 5′2GACGA T GA GTCCT GA G23′,下游接头为
5′2TACTCA GGACTCA T23′。接头连接反应液包
括 :5μmol/ L EcoR Ⅰ上游接头 215μL ,5μM EcoR
Ⅰ下游接头 215μL ,50μmol/ L Mse Ⅰ上游接头
215μL , 50 μmol/ L MseI 下游接头 215 μL , T4
DNA Ligase 1. 0 μL , T4 DNA Ligase Buffer (含
dA TP) 410μL ,dd H2 O 510μL ,共 2010μL 。
室温下混匀 ,离心 ,16 ℃或室温下反应 15 h ;
反应结束后 70 ℃反应 15 min ,使酶失活 ;将上述反
应液稀释 10 倍 ,不用的部分保存在 - 20 ℃冰
箱中。
214 　预扩增 : EcoR Ⅰ预扩增引物 ( E pre2primer)
为 5′2GACT GCGTACCAA T TC23′; Mse Ⅰ预扩增
引物 (M pre2primer) 为 5′2GA T GA GTCCT GA G2
TAA23′。取 310μL 连接后并稀释过的 DNA 样
品 ,加入 2710μL 反应液 :10 ×PCR Buffer 3. 0μL ,
10 mmol/ L 的 dN TP 混合液 016 μL , 10 μmol/ L
EcoR Ⅰ端预扩增引物 110μL ,10μmol/ L Mse Ⅰ
端预扩增引物 110μL ,210 U/μL 的 T aq DNA 聚
合酶 110μL ,dd H2 O 2014μL 。
混匀后 ,在 PCR 仪上扩增 :94 ℃、5 min ;94 ℃、
30 s ,55 ℃ (退火温度) 30 s ,72 ℃80 s ,共 31 个循
·7921·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
环 ;72 ℃延伸 10 min ;4 ℃保温。预扩增产物稀释
20 倍 , - 20 ℃保存备用。
215 　选择性扩增 :取 5μL 预扩增稀释混合液 ,加入
1510μL 反应液 :10 ×PCR Buffer 2. 0μL ,10 mmol/ L
的 dN TP 混合液 014μL ,10μmol/ L MseⅠ端引物和
EcoRⅠ端引物各 0125μL ,5 U/μL 的 Taq DNA 聚合
酶 0175μL ,ddH2 O 11. 35μL。
混匀后 ,在 PCR 仪上扩增 :94 ℃、5 min ;94 ℃、
30 s ,65 ℃、30 s ,72 ℃、60 s ,以后每个循环温度递
减 017 ℃,扩增 12 个循环 ; 然后按 94 ℃、30 s ,
55 ℃、30 s ,72 ℃、60 s 扩增 23 个循环 ;72 ℃延伸
10 min ,4 ℃保温。
216 　电泳和银染 : 用 40 mL 的 page 溶液在
110 mm 胶版上制胶一块 ,静置 3 h 后点样 ,在电泳
仪上以 200 V 的电压电泳 3 h ,然后在醋酸溶液中
固定 30 min ,纯水中清洗 10 min 后 ,银染 30 min ,
再放入显影液中显影 ,显影完成后放回醋酸固定液
中。用扫描仪扫描胶片。
3 　结果与分析
311 　益母草基因组 DNA 的提取和质量分析 :本研
究比较了 SDS 法、CTAB 法和尿素法提取的益母草
基因组 DNA 的产量和质量 ,结果表明 ,3 种方法都
能获得益母草基因组 DNA ,但 DNA 的产量和质量
有明显差异 ,其中 SDS 法提取的 DNA , A 260 / A 280为
1169～1191 ,质量较佳 ,产量也是 3 种方法中最高
的 ;而 CTAB 法、尿素法所获得的 DNA , A 260 / A 280
为 1125～1172 ,且多数低于 1160 ,表明 DNA 样品
中有较多杂质。
312 　A FL P 指纹图谱的建立和鉴别效率 :选择性扩
增引物为预扩增引物 3′末端添加 3 个碱基 ,共筛选
了 32 对引物。
经过对各个实验参数反复的比较和优化 ,建立
了简便、高效的益母草 A FL P 分析体系。从 32 对
引物组合中筛选了 10 对多态性较强、带型较好、分
辨率较高的引物组合进行分析 ,10 对引物组合对 9
个益母草种质扩增结果见表 2。
　　由表 2 可知 ,10 对引物组合共在 897 个位点上
扩增出条带 ,平均每对引物组合扩增位点为 89170
个。平均每个种质扩增位点为 99167 个。扩增位
点数量最多是 18 号引物组合 ,共扩增出位点 105
个 ;扩增位点数量最少是 10 号引物组合 ,共扩增出的
位点为 75 个。10 对引物组合共扩增出多态性位点
789 个 ,多态性位点占总扩增位点的比例平均为
87196 % ,平均每对引物扩增多态性位点为 78190 个。
表 2 　10 对 AFLP 引物对 9 个益母草种质的扩增结果
Table 2 　Amplif ication of nine L. j a ponicus germplasm
by ten pairs of AFLP primers
引物组合序号
( EcoR Ⅰ2MseⅠ) 选择碱基( EcoR Ⅰ- MseⅠ) 扩增位点/个 多态性位点/个 多态性位点比例/ %
3 AAC2CCT 98 89 90181
7 AAC2CTA 85 85 100100
9 AA G2CAA 86 77 89153
10 AA G2CCA 75 57 76100
15 A TC2CCT 90 81 90100
18 A GC2CCA 105 87 82186
21 A GC2CA G 84 75 89129
25 ACG2CAA 79 70 88161
28 ACG2CAC 93 84 90132
32 ACG2CTC 102 84 84135
总计 897 789 87196
313 　9 个益母草种质的 A FL P 指纹图谱 :在 9 个益
母草种质中 ,共有多态性位点 789 个 ,平均每对引
物组合扩增的每个种质的多态性位点为 8177 个 ,
这些条带组合对于特定的材料和引物位点是稳定
的 ,利用这些条带 ,可以将生物学特性相近的种质区
分开来 (图 1) ,把有条带标记为 1 ,无条带标记为 0 ,
通过这些位点的不同条带组合 ,可以构建益母草的
A FL P 指纹图谱 ,将 9 个益母草种质全部区分开来。
图 1 　引物组合 E2AAG/ M2CAA 选择性扩增产物
电泳后的银染结果
Fig. 1 　Staining result of selective PCR amplif ied
by primer pairs of E2AAG/ M2CAA
314 　基于 AFL P 分子标记的益母草种质分类 :将 10
对引物组合在 897 个位点上扩增出的条带作为原始
矩阵 ,用 N TSYS2PC 软件计算并分析了 9 个益母草
种质间的相似度 (图 2) ,其中品系 3 和 4 相似系数最
大 ,为 0176 ,最小的是品系 1、2、5 和其他品系间的相
似系数 ,只有 0152 ,以相似系数 0152 为阈值 ,这些益
母草品系可分为两个类型 ,第一类型包括品系 1、2、
5 ;第二类型包括品系 3、4、6、7、8、9 ,这个分类可以看
出 ,浙江的 3 个品系在亲缘关系上相对较近。
·8921· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
图 2 　基于 AFLP 标记的 9 份益母草种质的聚类图
Fig. 2 　Dendrogram of nine L. j a ponicus
germplasm based on AFLP marker
4 　讨论
411 　对地上部分生物学特性、产量及含量相关参数
的测定表明 ,云南品系抗冻性很差 ,其次是山东东营
品系。因为各地气候差异较大 ,对浙江的气候适应
性较差 ;A FL P 结果中也可看出山东与云南品系的
相似系数为 0176 ,十分接近。这与 N TSYS2PC 软
件分析得到的遗传系统进化树聚类结果基本一致 ,
即山东东营与云南陆良地方品系亲缘关系较近。
9 个地方品系益母草盐酸水苏碱的平均质量分
数为 11261 % ,其标准差为 01421 ,最小值是福建龙
岩品系 01627 % ,按单个样本均数与总体样本均数
统计划分 ,浙江义乌、浙江泰顺、浙江杭州和安徽蚌
埠的盐酸水苏碱量较高 ,福建龙岩和江西万年量最
低 ,这与 A FL P 聚类结果是相似的。
9 个地方品系的产量平均数为 1 123 kg/ hm2 ,
按单个样本均数与总体样本均数统计划分 ,浙江杭
州、浙江泰顺、浙江义乌和福建龙岩产量在 1 200
kg/ hm2 以上 , 山东东营产量最低 , 这个结果和
A FL P 聚类结果也是基本吻合的。
以上结果与 N TSYS2PC 软件分析得到的遗传
系统进化树聚类结果基本一致。根据生物学特性、
产量、含量加以区分 ,性状和基因型存在相关性。
412 　由于可供选择的特征性状有限 ,本研究利用
A FL P 方法分析 9 份益母草地方品系的遗传多样
性 ,不仅说明该方法对益母草种质的遗传多样性的
检测效应很高 ,而且揭示了益母草种质资源及其丰
富的遗传多样性 ,其多态性位点占总扩增位点的比
例高达 87196 % ,即使同一产地的益母草也表现出
丰富的遗传变异性 ,说明益母草的人工选择程度很
低。
413 　A FL P 是一种广泛用于研究遗传多样性分析、
作物品种鉴定、基因定位等方面的分子标记方
法[5～9 ] 。目前 ,尚未见到 A FL P 用于益母草种质资
源遗传多样性研究的报道。本研究利用 A FL P 分
子标记技术对益母草种质资源进行遗传多样性分
析 ,从分子水平揭示这些益母草种质的遗传基础 ,为
益母草种质资源的收集保存、分类鉴定、合理开发利
用与品种选育等提供科学的理论依据 ,对有效利用
益母草种质资源、促进益母草 GA P 基地的建设具
有重要意义。
综上所述 ,本研究主要从广泛收集益母草种质
资源着手 ,利用 A FL P 标记研究植物种质资源遗传
多样性 ,探明种质资源的遗传背景和亲缘关系 ,从而
为益母草种质资源的分析、评价与筛选提供分子水
平上的理论依据。
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