全 文 ：·1246· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8,El
源反转录酶(M—MLVRTase)并应用高效置换合
成法反转录双链cDNA，预先将RNA溶于65℃
加热5min，有效地提高了逆转录的反应效率，得到
的完整cDNA满足红花eDNA—AFLP的需要。根据
实验结果，“两步法”在连接时可不用担心酶的过度
消化，提高了连接效率，分别在限制性内切酶和T。
连接酶的最佳温度下，完成酶切和连接反应。采用
E+：／M+。的引物组合，在cDNA—AFLP两次的扩增
中，产物稀释10倍进行预扩增，再稀释150倍进行选
择性扩增，扩增效果较好。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
是非常关键的一步，也是较难操作的步骤，染色后的
洗涤时间需要根据不同的物种摸索合适的洗涤时
间，如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，
产生很少或没有序列信号，如果洗涤时间过长，染色
步骤需要重新进行。本研究的银染检测系统一次可
扩增约分辨出50～70条扩增带。在建立cDNA-
AFLP体系的PCR扩增中，除扩增程序相对稳定不
需要对其进行较大变动外，聚合酶的特异性，M92+
引物的浓度对结果的影响都很大，某一个试剂用量
的偏差都有可能导致整个实验的失败，因此保证每
一个试剂的质量和工作液浓度的准确也至关重要。
本研究获得了高质量的红花cDNA模板，建立
了红花的cDNA—AFLP特异性反应体系，为筛选与
红花重要性状相关的功能基因乃至直接的调控基因
奠定了基础。
参考文献：
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菝葜药材脂溶性成分指纹图谱研究
周艳林·一，严 海2，钟小清2，王力生2，邹节明Ⅵ。
(1．北京中医药大学中药学院，北京 100102I2．桂林三金药业股份有限公司，广西桂林541004)
摘要：目的 建立菝葜药材的脂溶性成分的HPLC指纹图谱分析方法。方法采用PhenomenexC。。柱
(250mm×4．6mm，5Urn)，以甲醇一0．1％的磷酸溶液梯度洗脱，体积流量1．0mL／min，柱温35℃，检测波长303
nm。结果不同产地菝葜药材的指纹图谱有较好的相似度，通过比较对应了山龙眼苷A、落新妇苷、白藜芦醇及黄
杞苷4个对照品。结论建立的方法能较好地反映了菝葜中二氢黄酮醇苷及二苯乙烯两类主要成分。
关键词：菝葜；脂溶性成分；指纹图谱；梯度洗脱
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)08—1246一03
Fingerprintofhydropholicc mponentsinSmilaxchina
ZHOUYan—linl2，YANHai2，ZHONGXiao—qin92，WANGLi—shen92，ZOUJie—min91t2
(1．InstituteofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100102，China；
2．GuilinSa jinPharmaceuticalCo．，Ltd．，Guilin541004，China)
收稿日期：2008—01—06
基金项目：广西优势中草药产业化资助项目(桂科产0444002—1)
作者简介：周艳林(1972一)，男，江西资溪人，在读博士，研究方向为中药化学与质量控制。E—mail：zhouyanlinzhou@yahoo．corn．ca
*通讯作者邹节明，男，教授级高工，博士生导师。Tel：(0773)5842588E—mail：Sanjin@91．gx．cninfo．net
万方数据
中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1247·
Abstract：ObjectiveToestablishafingerprintofhydropholicc mponentsinSmilaxchinabyRP—
HPLC．MethodsThesamplesw reseparatedona PhenomenexC18columnwithgradientelutionof
methan01and0．1％phosphoricacidataflowrateof1．0mL／mina detectedwavelengthat303nm．
ResultsThesimilarityofS．chinafingerprintsfromdifferenthabitatsisbetterandfourmajoractive
constituentsinS．chinacanbedetectedsimultaneously，whichnamedhel iosideA，astilbin，resveratr01，
andengeletin．ConclusionThefingerprintscabeu edasaqualitycontrolmethodf rihydroflavonoids
andstilbenesiilS．china．
Keywords：SmilaxchinaL．；hydropholiccomponents；fingerprints；gradientelution
菝葜为百合科植物菝葜SmilaxchinaL．的干
燥根茎，俗称金刚藤、金刚刺。具有祛风利湿，解毒散
瘀之功效，主治筋骨酸痛，小便淋漓，带下量多，疔疮
痈肿。系《中国药典》2005年版收载品种，也是三金
片、金刚藤糖浆、银屑颗粒及血尿胶囊等名优中成药
的主要原料，《中国药典》采用水解产物薯蓣皂苷元
为指标对菝葜进行质量控制[¨。文献报道[2。，菝葜的
醋酸乙酯提取物是其抗炎、镇痛的活性部位，笔者对
菝葜根茎进行了系统的化学成分研究，从醋酸乙酯
部位分离得到一系列二氢黄酮醇苷类成分，其中落
新妇苷、黄杞苷和山龙眼苷A，以及二苯乙烯类化合
物白藜芦醇为其中量较大的成分。采用HPLC法建
立了菝葜药材脂溶性成分的指纹图谱，并以上述4
个主成分作为参照指标，为进一步研究菝葜的药材
质量标准提供依据。
1仪器与试药
美国Waters2690色谱仪，996DAD检测器，
Empower液相色谱工作站；不同批次药材来源见表
1(药材经专人采集，经笔者邹节明教授鉴定为正品
菝葜SmilaxchinaL．)。甲醇、乙腈(色谱纯)；水
(超纯水)；磷酸(分析纯)。山龙眼苷A、落新妇苷、
黄杞苷及白藜芦醇对照品(自制，HPLC检测质量
分数>98％，归一化法)。
表1 10批药材来源
TableOriginsoftenbatchesofsamples
No． 采集地点 采集时间 No． 采集地点 采集时间
s1 广西桂林 2006—09S6 贵州凯里 2005—06
S2 广西永福 2006—09S7 云南昆明 2005—06
S3 湖北赤壁 2006—09S8 广西河池 2005—06
S4 湖南邵阳 2006—09S9 广西柳州 2005—06
S5 湖北通城 2006—09S10江西新余 2005—06
2方法与结果
2．1 色谱条件：色谱柱PhenomenexC18(250mm×
4．6mm，5pm)；以甲醇为流动相A，0．1％磷酸溶
液为流动相B，时间0～35min，A：20％；35～45
rain，A：20oA～32％；45rain以后，A：32％；体积流
量为1．0mL／min；柱温为35℃；检测波长为303
nm。理论板数按落新妇苷计算应不低于6000。
2．2对照品溶液的制备：分别精密称取山龙眼苷
A、落新妇苷、黄杞苷及白藜芦醇对照品适量，加甲
醇制成质量浓度分别约为0．02mg／mL的混合对
照品溶液。
2．3供试品溶液的制备：取药材粉末(过2号筛)
各约2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加
入70％丙酮50mL，密塞，摇匀，称定质量，超声提
取30min，加入70％丙酮补足减失质量，滤过，取
续滤液25mL蒸干，加水25mL使溶解，用醋酸乙
酯振摇提取2次，每次20mL，合并醋酸乙酯液，蒸
于，残渣加甲醇溶解，定容至5mL，即得。
2．4测定方法：精密吸取上述混合对照品溶液和供
试品溶液各10弘L，注入液相色谱仪，记录100rain
的色谱图，即得。
2．5精密度试验：精密吸取同一供试品溶液，连续
进样5次，结果保留时间28min(山龙眼苷A)、58
min(落新妇苷)、67min(白藜芦醇)、77rain(黄杞
苷)4个对照峰峰面积的RSD分别为0．79％、
0．87％、0．45％和1．04％，符合指纹图谱要求。
2．6稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、4、
8、12、16、20、24h进样分析，考察4个对照峰相对保
留时间和峰面积的稳定性，各对照峰相对保留时间
RSD均小于0．2％；峰面积RSD均小于2．0％，表
明供试品溶液在24h内基本稳定。
2．7重现性试验：称取同批号的菝葜药材(广西桂
林)粉末(过2号筛)约2g共6份，精密称定，制备
供试品溶液，分别对4个对照峰的相对保留时间和
峰面积进行考察，各对照峰相对保留时间RSD均
小于0．2％；峰面积RSD均小于3．O％，表明重现
性良好。
2．8指纹图谱分析软件：计算软件：采用国家药典
委员会编的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统
2004A版”。参数设置：(1)参照谱图：采用湖北通城
的菝葜的色谱图作为相似度计算时校正的参照谱
图。(2)时间窗宽度：0．20。(3)数据剪切：剪切前10
万方数据
·1248· 中革菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
rain。(4)校正方式：多点校正。校正色谱峰的确定：
本品色谱图中主要色谱峰在o～90min内基本分布
均匀，为保证不同批次指纹图谱匹配时校正的准确
性，选择了4个主要指纹峰作为校正的Mark峰，其
中保留时间28min为山龙眼苷A、58rain为落新妇
苷、67min为白藜芦醇、77rain为黄杞苷。(5)指纹
谱图的生成：采用平均值法，由10批菝葜药材指纹
图谱生成，见图1；4个对照品的色谱图见图2。(6)指
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，／min
图1菝葜药材指纹图谱
Fig．1FingerprintsofS．china
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
r，min
1一山龙眼苷A2-落新妇苷3一白黎芦醇4一黄杞苷
1-heliciosideA 2-astilbin3-resveratro[4-engeletin
圈2菝葜4个主要成分对照指纹图谱 ‘
Fig．2HPLCChromatogramsoffourmainconstituent≥
纹图谱相似度计算结果：以对照谱图为参照，各样品
指纹图谱与对照谱图进行比较，计算得各批次菝葜
药材指纹图谱相似系数，均大于0．9，见表2。
3讨论
3．1 因菝葜脂溶性成分主要是多羟基酚类化合物，
在流动相中加入适量的磷酸，能使相似组分有较好
的峰形和分离度；供试品溶液制备时，对比了甲醇、
表2 10批不同产地菝葜药材之间相似系数
Table2 SimilarityoftenbatchesofS．chinafromdifferenthabitats
乙醇及70％丙酮溶液超声处理效果，均能较好提
取相关成分，但以70％丙酮提取杂质较少，继以醋
酸乙酯提取能较好地实现富集纯化，操作简单，重现
性好。
3。2 比较了不同流动相等度洗脱及梯度洗脱的影
响，结果以选定的甲醇一磷酸溶液梯度洗脱，菝葜中
的主要成分与其他色谱峰能较好地分离。
3．3 由DAD检测器比较了波长在210～400nm
所测得的图谱，可知山龙眼苷A、落新妇苷、白藜芦醇
和黄杞苷的最大吸收波长分别为283、290、306、292
ilm，而在303nm下，基线平稳，各目标峰均有较好
的峰形及分离度，故选取303nm作为测定波长。
3．4不同产地的菝葜的指纹图谱有较好的相似性，
样品间的相似度均在0．9以上，且4个主成分均能
检测出来，只是量有较大的差异，可以作为药材品质
优劣的判断标准。
3．5从菝葜正丁醇部位的成分分离中，得到的主要
是甾体皂苷类成分，这些成分大多只有紫外末端吸
收，其醇溶性部位的指纹图谱研究，有待用ELSD
检测器做进一步的研究，以对菝葜的质量做更为全
面的评价。
参考文献：
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万方数据
菝葜药材脂溶性成分指纹图谱研究
作者： 周艳林， 严海， 钟小清， 王力生， 邹节明
作者单位： 周艳林,邹节明(北京中医药大学中药学院,北京,100102;桂林三金药业股份有限公司,广西桂
林,541004)， 严海,钟小清,王力生(桂林三金药业股份有限公司,广西桂林,541004)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(8)
被引用次数： 5次

参考文献(2条)
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本文读者也读过(10条)
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2. 周艳林.钟小清.吕高荣.邹节明 RP-HPLC同时测定菝葜中落新妇苷和黄杞苷的含量[期刊论文]-中国药学杂志
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引证文献(5条)
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2013(1)
3.李进.陈涛.王洋.宋洁瑾.马志平.孟萌 陇西产黄芪药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的研究[期刊论文]-中草药
2009(5)
4.杨立勇.李雨生.王祥培.杨烨.吴红梅.靳凤云 菝葜药材HPLC指纹图谱的鉴别[期刊论文]-中国实验方剂学杂志
2011(8)
5.杨安金.郭晓秋 长托菝葜化学成分研究[期刊论文]-中国中药杂志 2010(17)


本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200808042.aspx