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Effect of piperlonguminine on blood lipid metabolism and its related genes expression in hyperlipidemia rats

荜茇宁对高脂血症大鼠血脂代谢及其相关基因表达的影响



全 文 :中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月·1039·
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荜茇宁对高脂血症大鼠血脂代谢及其相关基因表达的影响
麻春杰1,哈斯阿古拉2,张立全2,博日吉汗格日勒图”,苏日娜1
(1.内蒙古大学高分子化学及蒙药研究所,内蒙古呼和浩特010021I2.内蒙古大学
生物工程中心,内蒙古呼和浩特010021)
搐要:目的 观察荜茇宁对实验性高脂血症大鼠血脂代谢及其相关基因表达的影响。方法 饲喂高脂饲料建立
高脂血症大鼠模型,荜茇宁分别按2.5、5、10mg/kg给大鼠连续ig4周。实验结束,取空腹血,检测血清总胆固醇
(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDI。一C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL—C)、载脂蛋白A1(ApoAl)、
载脂蛋白B(ApoB);利用反转录聚合酶链反应(RT—PCR)测定大鼠肝脏低密度脂蛋白受体(LI)I,R)、ApoB和3一
羟基一3一甲基一戊二酰辅酶A还原酶(HMG—CoAR)mRNA的表达。结果与模型组相比,荜茇宁能降低血清TC、
TG、LDL—C、ApoB水平及ApoB/ApoAl的值(P<0.05),升高HDL—C、ApoAl(尸<0.05),能增强高脂血症大鼠
LDI,RmRNA表达(P<0.05),降低ApoBmRN 表达(尸<0.05).但对HMG—CoARmRNA的影响不明显
(P>o.05)。结论荜茇宁具有调节高脂血症大鼠血脂代谢的作用,其机制可能与提高LDI。R基因转录水平,降低
ApoBmRNA表达有关。
关键词:荜茇宁;脂代谢;高脂血症
中图分类号:R286.26 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)07—1039—05
Effectofpiperlonguminineonbloodlipidmetabolismanditsrelated
genesxpressioninhyperlipidemiarats
MAChun—jiel,HASIAgula2,ZHANGLi—quan2,BORIJIHANGereltul,Surinal
(1.InstituteofMacromolecularChemistryandMongolianMedicine,InnerMo goliaUniversity,Huhhot010021,China;
2.BioteehnologyCenter,InnerMo goliaUniversity,Huhhot010021,China)
Abstract:ObjectiveToobserveth ffectsofpiperlonguminineonthebloodlipidmetabolismandits
relatedg nesxpressioninhyperlipidemiarats.MethodsThehyperlipidemiamodelsinducedbyhigh—fat
feedingwereestablished.Thepiperlongumininegroupwasf dcontinuouslywithpiperlonguminine(2.5,
5,and10mg/kg)forfouweeks.Atthe1astday,alltheratsfastedforatleast12handthebloodwas
drawnforthemeasurementoftotalcholesterol(TC),triglyceride(TG),high—densitylipoprotein
cholesterol(HDL-C),lowdensitylipoproteincholesterol(LDL—C),apolipoproteinA1(ApoA1),and
apolipoproteinB(ApoB):ThemRNAexpressionofl wdensitylipoproteincholesterolr ceptor(LDLR),
ApoB,and3-hydroxy3一methyIgIutarylco—enaymeAr ductase(HMG-CoAR)weremeasuredby T一
收稿El期:2007—09—25
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30160103)
作者简介:麻春杰(1965一),女,内蒙古赤峰人。副教授,博士在读。研究方向为中蒙药调血脂药理学。
Tel:135148 9729Fax:(0471)4992570E—nmil:mcj2007@yahoo.conl.ca
*通讯作者博日吉汗格口勒图Tel:13704750866Fax:(0471)4992570E—mail:borjihan@imu.edu.ca
万方数据
·1040· 中草蔼 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月
PCR.ResultsComparedwiththatofthehigh—fatmodelgroup,theserumTC,TG,LDL-C,A.poB
levels,andtheratioofApoB/ApoAlwerereduced(P<0.05)andtheserumHDL-CandApoAlwere
increasedinthepiperlongumininegroup(PmRNAlevels(P<0.05)andreduceApoBmRNAlevels(P<0.05).Butithadnosignificanteffectson
HMG—CoARmRNAlevel(P>O.05).ConclusionPiperlongumininehastheff ctofregulatinglipid
metabolism.ThemechanismislikelyrelatedOincreasingLDLRmRNAexpressionandecreasingApoB
mRNAexpression.
Keywords:piperlonguminine;lipidmetabolism;hyperlipidemia
荜茇宁是从常用中蒙药胡椒科藤本植物荜茇[1]
PiperlongumL.中提取分离出的有效成分。近几
年,本研究所通过大量研究证实,荜茇宁具有调血脂
活性,并且取得了此类化合物在调脂等方面的发明
专利E2]。本实验观察荜茇宁对实验性高脂血症大鼠
血脂代谢的影响,并且利用反转录聚合酶链反应
(RT—PCR)测定大鼠肝脏低密度脂蛋白受体
(I。DLR)、载脂蛋白B(ApoB)、3一羟基一3一甲基一戊二
酰辅酶A还原酶(HMG—CoAR)mRNA的表达,旨
从分子水平探讨荜茇宁调血脂的作用机制。
1材料
1.1药物与试剂:荜茇宁(白色针状结晶),由内蒙
古大学高分子化学及蒙药研究所制备,经1H—NMR
(400MHz)测定,其质量分数高于98%。在使用前
用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC—Na)研磨配制成
所需混悬液。阳性对照药辛伐他汀片,由哈药集团三
精制药有限公司生产,批号0407201。胆固醇、胆酸
钠购于北京双旋微生物培养基制品厂,猪油市售。
1.2 测定试剂盒:总胆固醇(TC)、甘油三酯
(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL—C)、低密度脂蛋
白胆固醇(I。DL—C)、载脂蛋白A1(ApoAl)、载脂
蛋白B(ApoB)试剂盒均是中生北控生物科技股份
有限公司产品。RNA提取试剂盒和反转录聚合酶
链反应(RT—PCR)试剂盒均购于宝生物工程(大
连)有限公司。
1.3动物:Wistar大鼠,雄性,体质量160~180g,
清洁级,合格证号:(京动字)8806R011,由内蒙古大
学实验动物研究中心提供。
1.4 主要仪器:意大利PRONTO—E(奔腾加强
型)全自动生化分析仪,TDL一5一A离心机、2400型
PCR扩增仪(Perkinelmer,新加坡),5417R台式高
速冷冻离心机(EppendorfChinaLtd,德国),DU@
640型核酸和蛋白质分析仪(Becman,美国),
DYY一2型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂),凝
胶影像分析仪(UVPLtd,美国)等。
2 方法
2.1分组及给药[3]:取大鼠60只,实验前在实验环
境下(室温18~22℃,湿度50%~60%,光照12
h/d,自由饮水)普通饲料喂养l周,随机分为6组,
每组10只。对照组喂基础饲料,其余均喂高脂饲料
(胆固醇3%,猪油10%,胆酸钠0.5%,基础饲料
86.5%),每组200g/d;且荜茇宁低、中、高3个剂量
组每天分别ig荜茇宁2.5、5、10mg/kg,辛伐他汀
组ig辛伐他汀10mg/kg,模型组和对照组ig同体
积的0.5%CMC—Na。大鼠给药体积均为0.4mE/
100g,连续4周。实验期间观察大鼠生长情况,每周
测1次体质量。
2.2样品采集及血脂测定:实验结束,将已禁食12h
(不禁水)的大鼠断头取血,离心、分离血清,按照试剂
盒使用说明书,在全自动生化分析仪上测定各组大鼠
血清TC、TG、HDL—C、LDL—C、ApoAl、ApoB水平,
并计算ApoB与ApoAl的比值(ApoB/ApoAl)以
及动脉粥样硬化指数[AI,AI=(TC—HDL—C)/
HDL—c]。同时迅速取出大鼠肝脏,剪取右叶部分
(100mg以上)放入冻存管,投入液氮中,待用。
2.3大鼠肝脏RNA的提取及鉴定:取冻存的大鼠
肝脏50mg放入研钵中迅速在液氮中研成粉末,按
试剂盒要求提取出总RNA。取RNA1弘L,加
DEPC处理水稀释后,测定在260和280ilm吸光
度(A)值,以A。。。。。/A:。。。。的值表示其纯度;另取3
pL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,紫外灯下观
察RNA完整性。
2.4’反转录聚合酶链反应(RT—PCR):在基因数
据库中,查找选定内标[3-actin(p肌动蛋白)
mRNA核苷酸序列(NM031144)和大鼠LDLR、
ApoB、HMG—CoARmRNA核苷酸序列(NM
175762、NM019287、BC064654),同时用Primer
premier5.0软件设计引物,并由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成,引物序列见表1。
采用lo弘I。逆转录反应体系合成eDNA。按以
下条件进行反应:42℃反应30min,99℃、5rain,
冰水浴5min,终止反应,将cDNA模板一20℃保
万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月·1041·
表1引物序列及其扩增产物长度
Table1 Primersequenceandamplifiedproductlength
基因 上鸯引物牵刊 下菇引物序刊 扩增产物长度
}acIin 5-AGG6A从TCGTGCGTGAC-Y5-AGCCACmCAGTAATCTC_3f1148bp
LDLR 5’-c从GGAO唧从GATTGGcT^183『5-TGAAGAGCAGAAACCCTATGGAACC-Y224bp
AoDB 5-ACTGCCAATCCAC-3’5-TTGC,(】IACACTfCCrG-3’263be
HMGCoAR5q)G-AGCGTGGTGTGTCTATTC.3’5.cAGCAGGTTTLv_HGTCGGTC-Y620b
存。PCR反应体系为25pL。pactin扩增条件为
94℃预变性2min;94℃变性30S,56℃退火30
S,72℃延伸20S,30个循环;72℃、10min。LDLR
扩增条件为94℃预变性2min;94℃变性30S,
57℃退火30S,72℃延伸20S,35个循环;72℃、
10min。ApoB扩增条件为94℃预变性2min;
94℃变性30S,55.5℃退火30S,72℃延伸20
S,30个循环;72℃、10min。HMG—CoA还原酶扩增
条件为94℃预变性2min;94℃变性30S,57℃
退火30S,72℃延伸45SI35个循环;72℃、lo
min。PCR扩增产物一20℃保存。
各取PCR产物8弘I.经1.5%琼脂糖凝胶电
泳、溴化乙啶染色,在凝胶影像分析仪成像后并用
UVP生命科学软件系列(UVPLIFESCIENCE
SERIESSOFTWARE)对条带吸光度进行分析。计
算待测基因与13.actin的比值,从而得到待测基因的
相对表达值。
2.5统计方法:实验数据采用;±s表示,用SPSS
14.0软件包进行统计分析,两组均数间差异采用t
检验。
3 结果
3.1 动物生长情况:实验期间,大鼠毛发整齐、有光
泽,精神状态、行为活动及粪便未见异常。各组大鼠
体质量增长较平衡,组间无显著差异(P>0.05),未
发生自然死亡。
3.2荜茇宁对高脂血症大鼠血脂的影响:如表2所
示,模型组与对照组比较,血清TC、TG、LDI。一C及
AI均显著升高(P<0.01),而HDL—C显著降低
(P鼠造模成功;荜茇宁各组与模型组比较,血清TC、
TG(除中、低剂量组外)、LDL—C和AI均显著降低
(P显著升高(P并且有剂量依赖性。
表2荜茇宁对高脂血症大鼠血清血脂指标的影响(J土s,席一10)
Table2 Effectofpiperlonguminineonserumlipidndexesinhyperlipidemiarats(;±s,疗=10)
与模型组比较:。P。P3.3荜茇宁对高脂血症大鼠血清载脂蛋白的影响:
如表3所示,模型组血清ApoAl显著低于对照组
(P<0.01),而ApoB显著高于对照组(P<
0.001);给药各组与模型组比较,能显著降低ApoB
和ApoB/ApoAl值(P<0.05、0.01、0.001),荜茇
宁高剂量组还能升高ApoAl(P剂量组差异不显著(P>0.05)。
3.4荜茇宁对大鼠血脂代谢相关基因表达的影响
3.4.1总RNA电泳结果:从总RNA电泳图谱可
以看出,提取的RNA有3条清晰的条带,分别为
28、18、5S,表明RNA完整,符合反转录要求,见图
1。RNAAⅢ/A揪值均大于1.8,也达到实验的纯度
要求。
3.4.2RT—PCR结果:RT—PCR法分别扩增出
表3荜茇宁对高脂血症大鼠血清ApoAl和ApoB的影响
(xls。n一10)
Table3 EffectofpiperlonguminineonserumApoAIand
ApoBinhyperlipidemiarats(;士s,n—10)
与模型组比较:‘P。PLDLR、ApoB、HMG—CoAR和pactin基因片段,片
段大小与预期设计的相符,见图2~4。PCR产物电
万方数据
·1042· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月
泳条带的吸光度分析结
果如表4所示,高脂血症
模型组大鼠肝脏LDI。R、
HMG—CoARmRNA表
达较对照组明显减弱
(P<0.01),ApoBmRNA
水平明显增强(P<
图1总RNA电泳图0·01),而荜茇宁组与模
Fig.1Electrophoretogram型组比较,中、高剂量组
oftotaiRNA LDLRmRNA表达明显
增强(P<0.05),ApoB
mRNA水平明显减弱(PmRNA水平却无变化(P>0.05)。
M—Marker1一对照组2一模型组3~5-荜茇宁
(2.5、5、10mg·kg一1)组6一辛伐他汀组
M—Marker1一controlgroup2-modelgroup
3—5一piperlonguminine(2.5,5,and10mg·kg—o)group
6-Simvastatingroup
图2荜茇宁对高脂血症大鼠肝脏LDLRm NA
表达的影响
Fig.2Effectofpiperlonguminineon RNAexpression
ofLDLRinliversofhyperlipidemiarats
M—Marker1-对照组2一模型组3~5一荜茇宁
(2.5、5、10mg·k91)组6一辛伐他汀组
M—Marker1一controlgroup2-modelgroup
3~5一piperlonguminine(2.5,5,and10mg·kg一1)group
6-Simvastatingroup
图3荜茇宁对高脂血症大鼠肝脏ApoBmRNA
表达的影响
Fig.3Effectofpiperlonguminineon RNAexpression
ofApoBinliversofhyperlipidemiarats
4讨论
血脂代谢紊乱(如高脂血症)不仅与动脉粥样
硬化(Atherosclerosis,AS)的形成和发展密切相
关,而且AI值越高则AS和冠心病(coronary
M—Marker1一对照组2一模型组3~5一荜茇宁
(2.5、5、10mg·kg一1)组6一辛伐他汀组
M—Marker1-controlg oup2-modelgroup
3—5一piperlonguminine(2.5,5,and10mg·kg一1)group
6-Simvastatingroup
图4荜茇宁对高脂血症大鼠肝脏HMG—CoARmRNA
表达的影响
Fig.4Effectofpiperlonguminineon RNAexpression
0fHMG-CoARinliversofhyperlipidemiarats
表4荜茇宁对高脂血症大鼠脂质代谢相关基因表达的
影响(工土s,弹一10)
Table4 Effectofpiperlonguminineonge esxpression
relatedolipidmetabolisminhyperlipidemia
rats(i士s,n一10)
与模型组比较:’P’P<0.05。Parterydisease,CAD)发病率越高,调节血脂已是
防治AS和CAD的重要措施。近些年,从中药材中
寻找安全有效的调血脂,抗AS药物仍是当今的研
究热点之一。
本研究首次研究了荜茇宁的调血脂作用。结果
表明荜茇宁可显著降低高脂血症大鼠血清TC、
TG、LDI。一C,同时又提高HDL—C、降低AI,说明荜
茇不仅具有显著的调节血脂代谢紊乱的作用,而且
能有效降低患AS、CAD的危险性。
载脂蛋白是决定脂蛋白结构、功能和代谢的主
要因素。ApoAl是HDI。的结构蛋白,HDL的胆固
醇逆转运过程是通过ApoAl实现的,其量减少在
导致AS中起着重要作用,尤其是在没有其他CAD
危险因子的人群中更为突出[4]。ApoB通过与细胞
膜上I。DI。R结合,介导60%~70%的LDL代谢,
其升高是导致CAD最重要的危险因素Cs],而且
ApoB/ApoAl值亦是CAD独立的危险因素[6]。本
实验中,荜茇宁可升高高脂血症大鼠血清ApoAl,
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月·1043·
降低ApoB量及ApoB/ApoAl的值,提示荜茇宁
可影响脂蛋白的代谢,促使体内血脂代谢趋于正常,
从而起到调节血脂及脂蛋白代谢紊乱的作用,有利
于AS、CAD的防治。
为探讨荜茇宁的调脂作用机制,主要从脂类运
输及胆固醇合成的代谢动态入手,研究了荜茇宁对
肝组织LDLR、ApoB及HMG—CoAR基因表达量
的影响,并且以辛伐他汀为对照。其结果显示,荜茇
宁可显著提高高脂血症大鼠I。DI。R基因转录水平,
降低ApoBmRNA表达,但对HMG—CoARmRNA
的影响不明显。
据文献报道[73,ApoB表达产物在体内脂类运
输和代谢中起着极其重要的作用,当其基因结构异
常或表达各环节出现障碍时,可致体内脂类运输和
代谢障碍,引起相应的脂类代谢紊乱的发生。膳食中
的胆固醇以乳糜微粒的形式入血后,由肝脏将其与
ApoB转化为富含TG的极低密度脂蛋白,其中的
TG又被水解掉,转化为富含胆固醇的LDL,LDL
中的ApoB能特异识别LDI。R并与之结合,经胞内
吞饮作用被送到溶酶体中降解,从而将60%~70%
的LDL从循环中清除。可见LDLR表达量的增加
可促进LDL及其所含脂类的分解。由于血清LDL—
C主要是通过肝脏LDLR途径清除,因此肝脏
LDI。R表达的变化能够决定并且反映血清胆固醇的
代谢‘8。。
从实验结果可以看出,高脂模型组大鼠LDLR
mRNA的表达明显低于对照组,说明高脂饲料饮食
抑制了大鼠LDLR基因的转录,致使LDLR
mRNA表达显著下降,从而引起血循环中I。DI。的
堆积,因此模型组大鼠血清LDL及TC显著升高。
而荜茇宁组的LDLRmRNA水平高于模型组,表
明荜茇宁能解除高脂血症对LDLR转录的抑制作
用,明显提高LDLRmRNA的表达,增多了LDLR
的数量,使LDL—C的清除加快,因此降低了血中
LDL—C、TC的水平。再者,高脂饮食可使肝脏ApoB
mRNA表达升高,此结果与Dhingra等凹3报道相
同。而给予荜茇宁能使其显著降低,其机制可能是荜
茇宁通过反式作用因子来调节ApoBmRNA的转
录水平,即可能通过某些转录因子或DNA结合蛋
白进行负调控来抑制或降低转录过程,从而降低
ApoB的合成。初步推测,荜茇宁可能降低了作用于
5-末端非编码区两种蛋白因子(蛋白因子AF一1和
热稳定蛋白C/EBP)的亲和力,从而降低了ApoB
的表达量。对于LDLR则相反,可能是通过类似过
程来促进基因表达量的增加。
由于辛伐他汀是HMG—CoAR的竞争性抑制
剂,而对HMG—CoAR基因表达无影响,荜茇宁也同
样对HMG—CoAR基因表达无明显的作用。这样排
除了荜茇宁通过HMG—CoAR基因水平上作用的可
能性。
总之,荜茇宁能够调节脂代谢紊乱,这一作用是
通过降低ApoB表达、增强LDI。RmRNA水平来
改善脂类运输,加快了脂类及LDL的分解来实现
的。荜茇宁很可能是借助一些转录因子或DNA结
合蛋白的作用来影响LDLR和ApoB基因表达水
平。具体那些蛋白因子的种类有待进一步研究。
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荜茇宁对高脂血症大鼠血脂代谢及其相关基因表达的影响
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Agula, ZHANG Li-quan, BORIJIHAN Gereltu, Surina
作者单位: 麻春杰,博日吉汗格日勒图,苏日娜,MA Chun-jie,BORIJIHAN Gereltu,Surina(内蒙古大学高
分子化学及蒙药研究所,内蒙古,呼和浩特,010021), 哈斯阿古拉,张立全,HASI
Agula,ZHANG Li-quan(内蒙古大学生物工程中心,内蒙古,呼和浩特,010021)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
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本文读者也读过(10条)
1. 麻春杰.博日吉汗·格日勒图.呼日乐巴根.特格希.苏日娜.MA Chun-jie.GERELTU Borjihan.Hurilebagen.
Tegexi.Surina 荜茇宁对动脉粥样硬化家兔抗氧化酶活性的影响[期刊论文]-中国药科大学学报2008,39(1)
2. 陈志辉.徐良梅.单安山.宋凯.程宝晶 小麦水溶性非淀粉多糖含量对肉仔鸡脂代谢的影响[期刊论文]-中国饲料
2010(22)
3. 郝福明.李寿亭 关于荜茇的蒙医中医药用分析[期刊论文]-中国民族医药杂志2001,7(4)
4. 高玉峰.巴根那.GAO Yu-feng.Bagenna 蒙药阿如健脾散质量标准研究[期刊论文]-内蒙古民族大学学报(自然科
学版)2005,20(5)
5. 周雪梅.韩塔娜.关玉秋 HPLC法测定五根油丸中胡椒碱的含量[期刊论文]-中国民族医药杂志2005,11(4)
6. 王朝虹.何毅.胡春华.张继宗 生物检材中蒙药那如-3号的检验[期刊论文]-中国法医学杂志2002,17(4)
7. 李仙义.袁海龙.苟奎斌.柳正良.张纯 超临界二氧化碳流体从荜茇中萃取胡椒碱[期刊论文]-中国医院药学杂志
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8. 李文娟.李宏宾.文杰.王子荣.陈继兰.赵桂苹.郑麦青 鸡心脏型和脂肪型脂肪酸结合蛋白基因表达及与肌内脂肪
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9. 何丹林.方梅霞.聂庆华.彭君瑜.邓玉珍.张细权.HE Dan-lin.FANG Mei-xia.NIE Qing-hua.PENG Jun-yu.DENG
Yu-zhen.ZHANG Xi-quan 鸡Ghrelin基因C2100T位点与生长和脂肪性状的相关性[期刊论文]-广东农业科学2007(4)
10. 达林太.哈斯巴根 内服外涂蒙药治疗痤疮研究[会议论文]-2005

引证文献(7条)
1.张鹏.黄启来.华子春 荜茇酰胺的药理作用研究进展[期刊论文]-中草药 2012(1)
2.万春平.包·照日格图.却翎.宋娜丽.唐志国 荜茇醇提物对胰岛素抵抗综合征大鼠模型的防治作用研究[期刊论文
]-中草药 2010(1)
3.武海军.杨玉梅 蒙药药理的研究现状[期刊论文]-中国民族医药杂志 2012(10)
4.董平.麻春杰.温都苏毕力格 1994~2008年国内荜茇文献计量分析[期刊论文]-中国民族医药杂志 2010(1)
5.李曦.董小萍.程永现 温里药的研究进展[期刊论文]-亚太传统医药 2010(4)
6.李姹润.孟根杜希.孟根达来.张冲.哈申图雅.松林 蒙药达日布-8丸对高脂血症大鼠调节血脂作用的实验研究[期
刊论文]-环球中医药 2013(11)
7.麻春杰.领小.博日吉汗格日勒图 荜茇及其有效成分降脂抗动脉粥样硬化研究概况[期刊论文]-世界科学技术-中
医药现代化 2011(1)


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