全 文 ：五环三萜皂苷生物合成与调控的研究进展
赵云生1 ,2 ,万德光1 3 ,陈 　新1 ,李占林2 ,田洪岭2 3
(11 成都中医药大学药学院 ,四川 成都 　610075 ; 21 山西省农科院经济作物研究所 ,山西 汾阳 　032200)
摘 　要 :五环三萜皂苷是一类重要的天然产物 ,具有多种生理活性 ,临床应用前景诱人 ,但自然界中 ,其产量较低。
采用分子生物学与蛋白质组学相关知识 ,通过代谢工程或基因工程进行五环三萜皂苷生物合成的工厂化生产 ,具
有广阔的市场前景。综述了五环三萜皂苷生物合成途径及其调控因子的研究进展 ,并简要探讨了五环三萜皂苷生
物合成的研究方法。
关键词 :五环三萜皂苷 ;生物合成 ;调控
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220327204
Advances in studies on biosynthesis and regulation of pentacycl ic triterpenoid saponin
ZHAO Yun2sheng1 ,2 , WAN De2guang1 , CH EN Xin1 , L I Zhan2lin2 , TIAN Hong2ling2
(11 College of Pharmacy , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 610075 , China ;
21 Institute of Indust rial Crop , Shanxi Academy of Agricultural Sciences , Fenyang 032200 , China)
Key words : pentacyclic t riterpenoid saponin ; biosynthesis ; regulation
　　五环三萜皂苷是一类重要的天然化合物 ,大多以游离或
苷类的形式广泛存在于自然界。依据苷元的不同 ,五环三萜
皂苷可分为齐墩果烷 (oleanane) 型、乌苏烷 (ursane) 型、羽扇
豆烷 (lupane)型和木栓烷 (f riedeiane) 型等多种不同类型的
化合物。大量的研究表明 ,含五环三萜母核的皂苷化合物具
有广泛的药理作用和重要的生物活性 ,尤其在抗炎、护肝、抗
肿瘤、抗 HIV 以及机体免疫调节等方面已经显现出令人注
目的活性 ,显示了五环三萜皂苷广泛的应用前景 [1 ] 。
目前对五环三萜皂苷的生物合成途径已有一定的了解 ,
其生物合成途径一般分为 4 个阶段 : (1) 活性异戊二烯单位
△32异戊烯焦磷酸酯 ( IPP) 和γ,γ2二甲基烯丙焦磷酸酯
(DMA PP)的生物合成 ; (2) 2 ,32氧化鲨烯的生物合成 ; (3) 五
环三萜碳环系统的生物合成 ; (4) 环上复杂的官能化反应过
程 ,最终形成完整的五环三萜皂苷分子 [2 ] 。
在自然界中 ,很多具有重要价值的五环三萜皂苷产量较
低 ,利用栽培措施大幅度地提高产量难度很大 ,如果从分子
水平上对其生物合成的关键基因进行调控 ,促进表达 ,不仅
能够提高目标产物的量 ,而且还可改变药用植物各种成分之
间的比例 ,减少甚至完全去除某些有毒成分 ,这是单靠栽培
措施难以实现的。随着对五环三萜皂苷生物合成途径及相
关酶研究的不断深化 ,通过代谢工程直接合成或利用基因工
程实现五环三萜皂苷的工业化生产与田间种植 ,将大大弥补
产量的不足 ,产生良好的社会及经济效益。
1 　IPP和 DMAPP的生物合成与调控
IPP 和 DMAPP 是公认的萜类成分在生物体内合成的
真正前体 ,是生物体内的“活性异戊二烯”物质。动物细胞中
IPP 的形成经由经典的甲羟戊酸 ( MVA) 途径 (图 1) 。这一
途径中不可逆的限速反应是 32羟基232甲基戊二酸单酰辅酶
A ( HM G2CoA)经 HM G2CoA 还原酶还原形成甲羟戊酸。在
植物细胞中 , IPP 合成类异戊二烯至少发生在 3 个不同部
位 :内质网 (胞液) 、线粒体 (和/ 或高尔基体) 及质体 [3 ,4 ] 。现
在发现的植物 HM G2CoA 还原酶只定位于内质网的胞液
面。Lichtenthaler 等 [5 ]经过大量的实验认为 :在大多数乃至
全部的质体中 , IPP 是以丙酮酸和甘油醛232磷酸作为前体 ,
先合成 22甲基赤藓醇242磷酸 (MEP) ,再经过磷酸化和环化
等多个反应 ,最终生成 IPP ,称之为 IPP 生物合成的 MEP 途
径 (图 1) ,并非以乙酰辅酶 A 为前体由甲羟戊酸途径合成。
DMA PP 是 IPP 的烯丙基异构体 ,由 IPP 异构酶 ( IPI)催
化形成 ,和 IPP 一起构成类异戊二烯的活性单位。这是一步
可逆反应。IPP 异构酶活性的调节可能参与调控类异戊二
烯的生物合成。有学者发现在大肠杆菌中经过 MEP 途径
可以直接产生 IPP 和 DMA PP ,而不需要 IPP 异构酶 [6～8 ] 。
高等植物中类异戊烯合成是否需要 IPP 异构酶 ,需要进一步
深入研究。
植物中通常含有多个 HM G2CoA 还原酶基因 ,在真核
生物细胞 ,特别是在植物细胞中 HM G2CoA 还原酶基因具
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3 收稿日期 :2008206219
基金项目 :山西省自然科学基金项目 :远志道地性基因与蛋白质组遗传多样性研究 (2007011091) ;四川省教育厅科研基金项目 :远志功
能基因与蛋白质研究 (07ZC014) ;成都中医药大学“优秀博士研究生科研创新基金”项目 :远志鲨烯环氧酶 cDNA 基因的克隆
与表达 (070104)
作者简介 :赵云生 (1974 —) ,男 ,山西闻喜人 ,博士 ,助理研究员 ,主要从事中药品种、质量和资源开发研究。
Tel : (0358) 3321076 　13408670774 　E2mail :zwhjzs @126. com3 通讯作者　万德光　Tel : (028) 87779801
有高度的保守性 ,它们共同编码 HM G2CoA 还原酶的同工
酶。甲羟戊酸是合成 IPP 的前体 , HM G2CoA 还原酶是否通
过调控甲羟戊酸的合成而成为整个类异戊二烯生物合成途
径的关键酶 ,是利用基因工程生产有效成分最重要的问题。
这方面虽然进行大量的研究 ,却得到了两种不同的结论 ,一
是认为 HM G2CoA 还原酶既然作为萜类物质的合成前体 ,
提高 HM G2CoA 还原酶的活性应该可以提高类异戊二烯的
量 ;二是认为由于存在着无甲羟戊酸的 IPP 生物合成途径 ,
或者由于萜类物质的生物合成步骤太复杂 ,较早期的代谢中
间产物对终产物的影响较弱 ,该酶对萜类物质的合成速率不
起限制作用 [9～11 ] 。在不同植物中 ,五环三萜皂苷合成是否
需要以 HM G2CoA 还原酶作为关键酶调控代谢过程 ,还有
待进一步研究。
2 　2 ,32氧化鲨烯的生物合成与调控
尽管存在着无甲羟戊酸的 IPP 生物合成途径 ,但许多具
有重要生物活性的类异戊二烯物质的生物合成仍然依靠胞
质的甲羟戊酸途径。依次在香叶二磷酸合成酶 ( GPS) 、法呢
二磷酸合成酶 ( FPS) 、鲨烯合成酶 (SS)和鲨烯环氧酶 ( SE)的
催化下 ,最终合成 2 ,32氧化鲨烯 [12 ] (图 1) 。此过程中 SS 和
SE 是最关键的两个酶。
图 1 　五环三萜皂苷生物合成途径
Fig. 1 　Biosynthesis pathway of pentacyclic triterpenoid saponin
　　在环丙甲醇二磷酸中间体介导下 , SS 催化 2 个法呢二
磷酸 ( FPP) 分子以头对头的形式形成还原性的二聚体 [13 ] 。
SS 催化两分子 FPP 形成一分子鲨烯 ( SQ) 要经两步反应。
第一步反应是两分子的 FPP 通过异戊烯基转移反应缩合成
前鲨烯焦磷酸 ( PSQ PP) ,并释放出一分子无机二磷酸。在这
个过程中 ,其中一个 FPP 的 C12C2 的双键作为另一个 FPP
的异戊烯基受体 ;第二步反应是 PSQ PP 在 NADP H 作为氢
供体的情况下 ,通过正碳离子重排转化为 SQ。在 PSQ PP 转
化为 SQ 的过程中有一个正离子的环丙烷进行了重排。对
于 PSQ PP 合成早期的动力学 ,曾用乒乓反应机制 ( Ping2
Pong mechanism)来解释 ,而对从 PSQ PP 和 NADP H 合成为
SQ 用依次反应机制 (Ordered mechanism) 来解释。最近的
研究支持在 PSQ PP 形成过程中 , FPP 是依次叠加到两个不
等价的 FPP 结合位点上。Agnew 和 Poljak 发现 FPP 浓度在
100μmol/ L 以上时 , FPP 会抑制 SQ 的合成 ,但并不抑制
PSQ PP 的合成。Radisky 等 [14 ]也指出高浓度的 FPP 会抑制
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SQ 的合成 ,但不抑制 PSQPP 合成 ,并指出由于 FPP 与
NADP H 的竞争 ,而产生底物选择性抑制作用 ,当 FPP 浓度
高时 ,第 3 个分子的 FPP 结合于 E ·FPP ·FPP 三元复合物
上 ,因而阻碍了 E ·FPP ·FPP ·NADP H 复合物的形成 ,但
并没有干扰 PSQ PP 形成反应 ,SS 催化反应的限速步骤是在
SQ 和 PSQ PP 形成之前。
SE是一种细胞膜结合酶 ,催化 SQ 在 C = C 之间插入一
个氧原子形成 2 ,32环氧角鲨烯 ,是五环皂苷生物合成路径中
的限速酶之一。酶反应除需要分子氧外还需要 FAD、NAD2
P H (真菌 SE 需 NAD H) 、上清液蛋白因子 ( SPF) 等 ,其中
SPF 可以用 TritonX2100 代替 [15 ] 。Choi 等 [16 ]在研究人参皂
苷合成时 ,已识别 3 个编码 SE 酶的转录物 ,这表明在人参基
因组中 SE 酶形成了一个小的多基因家族。Suzuki 等 [17 ] 通
过 DNA 琼脂印迹分析 ,在苜蓿基因组中发现了 2 个 SE 基因
(SE1 和 SE2) 。SE1 和 SE2 编码的蛋白与人参中公认的 SE
编码蛋白高度相似 ,分别有 7711 %和 7414 %的序列完全相
同。用茉莉酸甲酯 ( methyl jasmonate , MeJ A) 处理苜蓿后 ,
SE1 转录物并没有被诱导 ,相反 , SE2 转录物的诱导率却很
高。这表明 SE2 并不是 SE1 ,它们在植物甾醇和三萜类皂苷
合成过程中都起到重要的作用。
3 　五环三萜碳环系统的生物合成与调控
五环三萜碳环系统的生物合成主要通过氧化鲨烯环化
酶 (OSC)的环化作用生成 ,是由 2 ,32氧化鲨烯在 OSC 的催
化下 ,经过一系列的质子化作用、环化、重排和去质子化作用
形成的。这一反应是三萜皂苷生物合成途径的一个分支反
应 ,因而 OSC 是整个三萜皂苷生物合成的关键酶。该酶属
于一个超家族 ,大多编码 OSC 的基因是由 5 个蛇麻脂醇合
成酶基因和 7 个公认的五环三萜合成酶基因组成的。OSC
三萜合成酶家族各成员间表现高度的同源性 ,都含有一些高
度保守的序列 ,一个是与底物结合有关的 DD TA EA 序列 ,另
一个是 QW 特征序列 [2 ] 。
目前已经从不同植物中分离得到了 4 个编码 OSC 酶的
基因 [16～18 ] ,即羽扇醇合成酶 (lupeol synthase , L S) 、β2香树脂
合成酶 (β2amyrin synthase ,β2AS) 、达玛烯二醇合成酶 (dam2
marenediol synthase , DS) 和环阿齐醇合成酶 ( cycloartenol
synthase , CAS) ,其中前 3 个酶合成各类三萜类产物的前体 ,
第 4 个酶是甾醇的前体。由于大多数三萜类皂苷是从齐墩
果烷 (oleanane) 和达玛烷 (dammarane) 衍化而来的 ,因此β2
AS 和 DS 对三萜皂苷的合成非常重要。
Haralampidis 等 [13 ]在研究与产物专一性有关的酶的结
构域时发现 ,β2AS 的 Trp259通过齐墩果烷阳离子控制β2香树
脂的形成 ;高保守的 Tyr261 附近的氨基酸残基易于产生突
变 ,其突变导致五环三萜类转变为组氨酸 ,而产生四环碳骨
架的相应残基的突变导致了达玛烷型三萜类的合成。
到目前为止 ,已经获得了几种多功能酶的克隆。如拟南
芥 A TL U P2 和豌豆 PSM ,两者表达产物可以催化生成五环
三萜类物质 ,前者产生羽扇豆醇、α2香树素及β2香树素 ,后者
产生α2香树素、β2香树素及 6 种少量的三萜副产品 [2 ] 。
4 　五环三萜碳环的官能化反应与调控
五环三萜碳环系统合成后 ,碳环骨架还必须经过复杂的
修饰作用 ,对这一过程的具体步骤还不十分清楚。大多数研
究表明细胞色素 P450 依赖的单加氧酶和糖基转移酶参与了
这一过程。细胞色素 P450 是一种以铁卟啉为辅基的 b 族细
胞色素 ,大多数都催化羟化反应。典型的细胞色素 P450 包
括 A、B、C、D 4 个特征性结构域 ,其中两个已被认为具有特
殊功能 [19 ] 。Durst 等 [20 ] 将细胞色素 P450 分为两个不同的
组 ,除了少数例外 ,A 组的 P450 都具有均一的特征性序列 ,
显示出参与催化植物特殊反应的特征 ,参与五环三萜皂苷生
物合成的 P450 应属于这组。非 A 组的 P450 并非只局限在
植物上发挥作用 ,而是参与了生物体生命活动所必须的物质
的合成。
催化五环三萜皂苷元与糖通过糖苷键相连的是糖基转
移酶。它是具有众多成员的大家族 ,具有高度的专一性。转
移不同的糖基或糖基的受体不同 ,所需的糖基转移酶也不
同。已知序列的糖基转移酶没有明显的同源性 ,但有相似的
结构域。到目前为止 ,仅有一种参与三萜皂苷生物合成的糖
基转移酶被克隆出来 [21 ] 。
5 　结语
由于五环三萜皂苷结构复杂且类型众多 ,经过大量的研
究 ,五环三萜皂苷生物合成代谢途径的研究取得了一定的进
展 ,但由于五环三萜皂苷的代谢是一个受多因素调节、非常
复杂的动态变化过程 ,距离完全破解该类物质的代谢途径尚
有很多问题亟待解决 ,如工艺流程复杂、成本高、易产生同分
异构体及受环境污染等问题 ,特别是五环三萜苷元碳环骨架
建立后环上复杂的官能化反应过程尚不清楚 ,使得现今利用
代谢工程直接合成五环三萜皂苷还存在一定困难。
随着五环三萜皂苷类生物合成关键酶基因调控研究的
不断深入 ,阐明具有时空调控作用的各种顺式和反式作用因
子 ,分离具有组织特异功能的启动子 ,实现五环三萜皂苷类
相关代谢基因在特定组织或细胞中的定向表达 ,确定五环三
萜类次生物质代谢的关键酶基因及其协同性 ,人工改造关键
酶基因并使之高效表达 ,进行细胞培养、生物转化、发根培养
等工业化生产 ,是实现大规模生产活性成分五环三萜皂苷类
的可行方法。
参考文献 :
[ 1 ] 　程晓华 , 熊玉卿 1 五环三萜皂苷的药理作用研究进展 [J ]1
中草药 , 2007 , 38 (5) : 79227951
[ 2 ] 　陈　莉 , 吴耀生1 三萜皂苷生物合成途径及相关酶 [J ]1 国
外医药 :植物药分册 , 2004 , 19 (4) : 15621611
[ 3 ] 　Bach T J1 Some new aspect s of isoprenoid biosynt hesis in
plant s : a review [J ]1 L i pi ds , 1995 , 30 : 19122021
[ 4 ] 　Mcgarvey D , Croreau R1 Terpenoid metabolism [J ]1 Plant
Cell , 1995 , 7 : 1015210261
[ 5 ] 　Lichtent haler H K , Schwender J , Disch A , et al1 Biosynt he2
sis of isoprenoids in higher plant chloroplast s proceeds via a
mevalonate2independent pat hway [J ]1 F EB S L ett , 1997 , 400
(3) : 27122741
[ 6 ] 　Kajiwara S , Fraser P D , Kondo K , et al1 Expression of an
exogenous isopentenyl diphosphate isomerase gene enhances
isoprenoid biosynt hesis in Escherichia coli [J ]1 B iochem J ,
1997 , 324 (2) : 42124261
[ 7 ] 　Sun Z R , Cunningham F X , Gantt E1 Differential expression
of two isopentenyl pyrophosphate isomerases and enhanced
·923·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
carotenoid accumulation in a unicellular chlorophyte [J ]1 Proc
N at A cad Sci US A , 1998 , 95 (19) : 114822114881
[ 8 ] 　Concepcion R1 Genetic evidence of branching in t he isoprenoid
pat hway for t he production of isopentenyl diphosphate and
dimet hylallyl diphosphate in Escherichia coli [J ]1 F EB S
L ett , 2000 , 473 (3) : 32823321
[ 9 ] 　Choi D , Ward B L , Bostock R M1 Differential induction and
suppression of potato 32hydroxy232met hylglutaryl coenzyme A
reductase genes in response to Phytophthora inf estans and to
it s elicitor arachidonic acid [J ]1 Plant Cel l , 1992 , 4 ( 10) :
1333213441
[ 10 ] 　Wang G Y , Keasling J D1 Amplification of HM G2CoA reduc2
tase production enhances carotenoid accumulation in N euros2
pora crassa [J ]1 Metab Eng , 2002 , 4 (3) : 19322011
[ 11 ] 　孙彬贤 , 翁颖琦 , 刘　涤 , 等 1 代谢中间产物和诱导子对南
方红豆杉培养细胞生长和紫杉醇含量的影响 [J ]1 上海中医
药大学学报 , 2000 , 14 (3) : 542561
[ 12 ] 　J ung J D , Park H W , Hahn Y , et al1 Discovery of genes for
ginsenoside biosynt hesis by analysis of ginseng expressed se2
quence tags [J ]1 Plant Cel l Rep , 2003 , 22 (3) : 22422301
[ 13 ] 　邢朝斌 , 王一曼 , 陈正恒 , 等1 三萜皂苷的生物合成 [J ]1 生
命的化学 , 2005 , 25 (5) : 42024221
[ 14 ] 　赵明文 , 钟家禹 , 王　南 , 等1 鲨烯合酶的研究进展 [J ]1 微
生物学报 , 2003 , 43 (5) : 67026761 [ 15 ] 　彭　剑 , 龚炳永 1 角鲨烯环氧化酶抑制剂的研究进展 [J ]1国外医药 :抗生素分册 , 1998 , 19 (3) : 17721831[ 16 ] 　Choid W , J ung J , Ha Y I , et al1 Analysis of t ranscript s inmet hyl jasmonate2t reated ginseng hairy root s to identify genesinvolved in t he biosynt hesis of ginsenosides and ot her seconda2ry metabolites [J ]1 Plant Cell Rep , 2005 , 23 (8) : 55725661[ 17 ] 　Suzuki H , Achnine L , Xu R , et al1 A genomics approach tot he early stages of t rirerpene saponin biosynt hesis in Medica2go t runcatula [J ]1 Plant J , 2002 , 32 (6) : 1033210481[ 18 ] 　Hayashin , Huang P , Inoue K1 Up regulation of soyasaponinbiosynt hesis by met hyl jasmonate in cultured cells of Gl ycy r2rhiz a glabra [J ]1 Plant Cell Physiol , 2003 , 44 ( 4 ) :40424111[ 19 ] 　Kalb V F , Loper J C1 Proteins f rom eight eukaryotic cyto2chrome P2450 families share a segmented region of sequencesimilarity [J ]1 Proc N atl A cad Sci US A , 1988 , 85 ( 19) :7221272251[ 20 ] 　Durst F , Nelson D R1 Diversity and evolution of plant P450and P4502reductases [J ]1 D rug Metabol D rug I nteract ,1995 ; 12 (324) : 18922061[ 21 ] 　Kurosawa Y , Takahara H , Shiraiwa M1 UDP2glucuronicacid : soyasapogenol glucuronosylt ransferase involved in sapo2nin biosynt hesis in germinating soybean seeds [J ]1 Planta ,2002 , 215 : 62026291
日本药品进口程序及相关要求
罗 　辉1 ,于瑞钧2 ,宋立平3 ,马 　军4 ,江永萍3 ,东 　红3 3
(11 天津中新药业药品营销公司 ,天津 　300457 ; 21 天津劳动和社会保障局 ,天津 　300040 ; 31 天津中新药业集团股份
有限公司达仁堂制药厂 ,天津 　300457 ; 41 莱生 (天津)天然保健品开发有限公司 ,天津 　301700)
摘　要 :日本是我国中药出口的第一大市场 ,并且在将我国中医药推向国际市场方面 ,日本也是首要选择的市场。
通过对日本药品进口程序、各种申请及要求提交的资料进行介绍 ,以期对我国药品出口日本有所裨益 ,使中药能被
接受认可。
关键词 :日本 ;药品 ;进口程序
中图分类号 :R956 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220330204
　　日本是我国的近邻 ,历史上深受中国文化的影响 ,是中
国中药出口的第一大市场 ,并且在将我国中医药推向国际市
场方面 ,日本也是首要选择的市场。
中成药进入日本市场 ,如果在日本厚生省规定的药局方
中的汉方药 210 种处方之内 ,则较易被批准 ,如属新增的品
种还要进行药理及临床复核试验 ,审查期少则 10 个月 ,多则
几年 ,费用上千万日元 ,一经获准 ,质量方面则要按申报标准
严格把关执行。
曾对日本汉方药注册进行过简要介绍 [1 ] ,下面就日本药
品进口程序及相关要求加以详细介绍 ,以便国内企业开拓日
本市场及医药界人士加以了解、借鉴。
1 　外国生产企业的各种申请
111 　外国生产企业的认定申请 :所谓外国生产企业即是指
在外国想生产出口到日本的医药品的企业 ,和日本国内生产
企业一样需要厚生劳动大臣的批准。认定申请前 ,外国生产
企业以及生产场所必须根据别纸样式 1 业者编码登记票进
行登记。认定申请时 ,根据施行规则样式第十六 (二) 向机构
提出认定调查申请书。注意必须在生产销售批准申请之前
申请认定。申请手续、申请书的记载方法、提交资料见表 1。
112 　外国生产企业认定区分变更/ 追加变更 :认定区分追加
申请是指外国生产企业取得认定后 ,重新追加其他认定区分
的申请 ;认定区分变更申请是指废止已认定区分的同时 ,重
新追加其他认定区分的申请。申请手续、申请书的记载方
法、提交资料见表 1。
113 　外国生产企业的认定更新申请 :外国生产企业的认定
有效期为 5 年 ,如果到期不更新则自动失效。申请手续、申
请书的记载方法、提交资料见表 1。
114 　外国生产企业的其他申请 :关于外国生产企业认定的
其他申请如变更申请、休止、废止、再开申请、许可证的再交
付申请等按照日本国内生产企业的各申请的规定执行。
·033· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008205212