全 文 ：·1368· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
蒺藜皂苷对H：02诱导PCI2细胞凋亡保护作用及其机制研究
姜恩平1，苏学今2，李 红1，杨世杰1．
(1．吉林大学基础医学院药理学教研室，吉林长春130021，
2．吉林大学基础医学院病理生物学教研室，吉林长春130021)
摘 要：目的 探讨蒺藜皂苷(grosssaponinofTribulusterrestris，GSTT)对H202诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细
胞(pheochromocytomacells，PCI2)凋亡的保护作用及其机制。方法实验分为对照组、模型组及蒺藜皂苷高
(GSTT。)、低(GSTTz)剂量组。用Hz0：刺激PCI2细胞使其发生凋亡，MTT法检测PCI2细胞活性，流式细胞仪
检测细胞凋亡率及线粒体膜电位的变化，Westernblotting检测凋亡相关蛋白Bel．2、Bax。结果与模型组比较蒺
藜皂苷组随着剂量的增加PCI2细胞存活率提高(尸0．01)，Bcl一2表达增加(P凋亡，其机制可能与抑制线粒体途径的细胞凋亡有关。
关键词：蒺藜皂苷；PCI2细胞}HzOz#凋亡
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1368一04
细胞凋亡过程中的许多关键环节都与线粒体密
砌相关，包括线粒体膜电位的丧失、电子传递链的改
变、caspase激活因子的释放、细胞内氧化还原状态
的改变，Bcl一2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等不
同信号的传导最终都集中到线粒体上来，以启动或
抑制这些环节及其效应的产生[1]。蒺藜皂苷(gross
saponinsofTribulusterrestris，GSTT)是从蒺藜科
植物蒺藜TribulusterrestrisL．中提取的甾体皂苷
的有效成分之一，具有抗心肌缺血、缺氧[2]、抗脑缺
血[3]及改变脑缺血部位的血流量，减轻心脑缺血、缺
氧损伤的作用，临床主要用于缺血性心脑血管疾病
治疗。以蒺藜有效成分为主的制剂如心脑舒通等在
防治心脑血管疾病、抗衰老等方面均显示出良好疗
效和应用前景，但其药理机制尚待深人研究[4’5]。本
研究以大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(pheochromo—
cytomacells，PCI2)为研究对象，用H202制备细胞
凋亡模型，观察蒺藜皂苷对PCI2细胞抗凋亡效果，
同时测定线粒体膜电位研究其抗凋亡的作用机制。
l材料与方法
1．1 试剂与细胞：GSTT由吉林省敖东洮南药业
股份有限公司提供，质量分数>90％；PCI2细胞由
中国科学院上海细胞生物学研究所提供；DMEM培
养基购于美国Gibco公司。细胞用含10％新生牛
血清的高糖DMEM培养液，置CO：培养箱(37℃、
5％COz)培养，隔2d传代1次，取对数生长期细胞
分组进行实验。
1．2分组及药物处理：实验分为对照组、模型组、蒺
藜皂苷高(GSTT。)、低剂量(GSTT。)组。上述4组
细胞无血清培养24h，除对照组外，均给予终浓度
为300／比mol／L的H：O：，受试药组同时给予蒺藜总
皂苷终质量浓度分别为10、3mg／L，继续培养6h，
测定各项实验指标。
1．3 MTT法检测细胞活性：活细胞线粒体中琥珀
酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶性的蓝紫色
颗粒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚
砜(DMS0)能溶解细胞中蓝紫色颗粒，用酶标仪在
570nm波长处测定其吸光度(A)，可间接反映活细
胞数量，用以检测细胞活性。细胞消化后配成单细胞
悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，每
组细胞8复孔，于培养结束前4h加入5g／LMTT
10pL，培养结束后，倾去培养基，每孔加入DMSO
150pL，振荡混匀，使结晶完全溶解，用酶联免疫检
测仪于570am波长处测定其以。对照组细胞生长
率为100％，其余各组存活率一A宴验／A对照×100％。
1．4 AnnexinV—FITC／PI检测细胞凋亡率：收集
经上述处理的细胞，用PBS洗涤细胞2次(离心
2000r／min，5min)，收集1×105～5×105个细胞；
吸取250弘L2×BindingBuffer和250pL灭菌去
离子水混匀；用上述500弘L1×BindingBuffer悬
浮细胞；加入1pLAnnexinV—FITC混匀后加入
收藕日期：2008—01—31
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30472020)
作者简介：姜恩平(1975一)，女。吉林省吉林市人，北华大学药学院药理教研室讲师，在读医学博士，主要从事心血管药理学研究．
Tel：(0432)5519228E—mail：jepjl@126．colrl
-通讯作者杨世杰Tel：(0431)85619483E—mail：jeyaoli@sina．corn
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1369·
5弘LPropidiumIodide，然后混匀；避光室温反应5
min，上流式细胞仪检测。AnnexinV—FITC荧光信
号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
1．5线粒体膜电位的测定：收集细胞，加入5,g／
mLRhodamine12350pL，轻轻弹匀，避光，37℃
孵育30min(每隔10min振摇1次)。PBS洗涤，
2000r／min离心5min，弃去染液，EILITE型流式
细胞仪检测，激发光波长为488am，发射光波长
534nm，每个样本至少收集1×104个细胞，数据采
集分析应用Cellquest软件处理。
1．6 Westernblotting检测Bcl一2、Bax的表达：细
胞培养结束后，收集细胞，加入细胞裂解液，超声破
碎，4℃12000r／min离心5min，收集上清液，蛋
白质样品与等体积的2×SDS加样缓冲液混匀，煮
沸8min，紫外分光光度法测定蛋白质。按蛋白质测
定结果每孔上样量为20弘g，10％SDS—PAGE分离
样品。电转移2h将蛋白转至PVDF膜上，用封闭
液室温封闭2h，将膜与溶于封闭液中的一抗(1：
500)室温孵育2h，PBS洗5min×3，TBS洗
5min×3，将膜与溶于封闭液中的二抗(1t 1000)
室温孵育2h，TBS洗膜3次，每次7min，双蒸水清
洗2次，加入DAB显色，待蛋白带的颜色深度达到
要求时，蒸馏水冲洗终止显色，摄片，并采用
HPIAS一1000型图像分析仪测定灰度值，以pactin
的灰度值作为校正值进行半定量分析。
1．7统计学处理：结果采用z土s表示，组间比较采
鱼
《毛
击一
圣吉
一
^
2
用t检验。
2结果
2．1蒺藜皂苷对PCI2细胞活性的影响：模型组
PCI2细胞存活率46．5％明显低于对照组(P<
0．01)，说明H。O：引起PCI2细胞损伤；与模型组比
较 GSTT。、GSTT：组细胞存活率明显提高(尸<
0．05)，且随着剂量增加细胞存活率提高，提示
GSTT对PCI2细胞的缺氧损伤具有保护作用，结
果见表1。
表1蒺藜总皂苷对H：o：诱导的PCI2细胞存活率的
影响G+s，万一6)
TableEffectofGSTTonsurvivalrateofPC：12
cellsinducedbyH202Q士s，一=6)
组别 剂量／(rag·L一1) A 细胞存活率／％
与模型组比较：’P<0．05I与对照组比较一△△P‘P2．2 Annexin--FITC／PI检测细胞凋亡率：在流式
细胞术参数散点图上，左下象限显示活细胞；右下象
限为早期凋亡细胞；右上象限为晚期凋亡细胞；左上
象限是非活细胞，即坏死细胞。从图1和表2可见，模
型组细胞凋亡率明显高于对照组(P型组比较，GSTT。、GSTT。组细胞凋亡率明显降低
(P2007IOl2·I·Tube001 20071012-1·Tube002 20071012．1．Tube003 20071012-I-Tube004
．土搿g Q2
黛 ”妻孓。：，_。
i避i势≥n
j譬．絮魏；；一：：{，’o
Annexin．v．FITC-A
模型组
，‘疆一 ．．链
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，口3 OI
：。萌萨． 罐
10
2
101 lO‘ 10’
Annexin-Y．FITC·A
GSTT2
图1流式细胞术检测细胞凋亡
Fig．1Apoptosisanalyzedbyflowcytometry
表2各组PCI2细胞的存活、凋亡和坏死率(；士s，一=6)2．3 蒺藜皂苷对PCI2细胞线粒体膜电位的影响：
Table2 Percentageofsurvival，apoptosis，andnecro is
ofPCI2ceilsineachgroups(工±$，月=6)
组别齐Jl／(mg·L一1)存活率／％ 凋亡事／％ 坏死率／％
对照
模型
GSTT
95．82士0．562．35士0．241．83士0．26
72．354-0．67AA23．23士0．63△△4．42+0．34AA
85．27+0．49‘11．74士0．58。2．994-0．51。
80．98士0．96。15．35土0．47’3．674-0．39。
与模型组比较：。P<0．05l与对照组比较：A&p’P模型组PCI2细胞线粒体膜电位的荧光强度明显低
于对照组(P<0．01)；GSTT。、GSTT2组线粒体膜
电位明显高于模型组(P而上升，结果见表3。
2．4 Westernblotting法检测PCI2细胞Bcl一2、
Bax蛋白表达的变化：结果表明，对照组PCI2细胞
中Bax、Bel一2蛋白呈低水平表达，模型组Bax蛋白
表达量较对照组明显升高(P<0．01)，GSTT。组
万方数据
·1370· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
Bax蛋白表达量与模型组比较明显降低(P<
0．05)；GSTT：组Bax蛋白表达量与模型组比较无
明显变化(P>o．05)。而模型组Bc卜2蛋白表达量
与对照组比较明显降低(P<0．05)；GSTTt、
GSTT。组Bcl一2蛋白表达量与模型组比较均明显升
高(P表3蒺藜总皂苷对H：0：诱导的PCI2细胞损伤的
线粒体膜电位的影响(；土s，万一6)
Table3 EffectofGSTTonmembranepot ntial
ofmitochondrafPCI2cellsinduced
byH20zo士$，库=6)
与模型组比较：。P<0．05，与对照组比较：△△P。P<0．05v modelgroup；△△P<0．01口jcontrolgroup
图2 Westernblotting法检测模型GSTT对PCI2
细胞Bcl．2和Bax蛋白表达的影响
Fig．2EffectofGSTronproteinBcl一2andBax
expressionbyWesternblotting
表4蒺藜皂苷对PCI2细胞Bcl一2、Bax蛋白表达的
影响。士l，n=6)
Table4 EffectofGS21onproteinBcl-2
andBaxexpression(x=ks。万一6)
组别 荆量／(mg·L-1)Bc卜2#liCit(Ill×面积)Bex表达量(强度×面积)
与模型组比较：。P。P<0．05wmodelgroupI△△P<0．01口5controlgroup
3讨论
细胞凋亡除了存在细胞核的变化外，细胞质中
的变化也是细胞凋亡病理改变的重要组成部分，其
中以线粒体的表现特别明显。在细胞凋亡时，线粒体
发生一系列与细胞凋亡密切相关的变化，包括形态
和功能的转变，线粒体在细胞凋亡中起着中心调控
作用‘6·川。
本实验以体外培养PCI2细胞为对象，观察了
GSTT对PCI2细胞凋亡的保护作用。结果显示，
H：O。处理PCI2细胞后，流式细胞仪可检测到细胞
早期和晚期凋亡，说明H。O：诱导PCI2细胞发生凋
亡。GSTT干预组PCI2细胞生存率提高，细胞凋亡
率降低，说明蒺藜皂苷对H。0：诱导PCI2细胞的凋
亡具有保护作用。
本实验利用流式细胞仪测定PCI2细胞的线粒
体膜电位，结果发现H：O：细胞的线粒体膜电位，结
果发现H。O：处理的PCI2细胞的线粒体膜电位明
显减低，而GSTT干预组线粒体膜电位回升。说明
蒺藜总皂苷有保护线粒体，抑制线粒体膜开放，降低
线粒体膜通透性，维持其跨膜电位的稳定，维护线粒
体膜的屏障功能，从而发挥对H：O：诱导PCI2细胞
凋亡的保护作用。
细胞凋亡的机制十分复杂，目前仍不完全明了。
Bcl一2家族基因与细胞凋亡关系密切，在神经元凋亡
中起重要的作用[8J]。其中Bcl一2和Bax是一对正负
凋亡调节基因，Bcl一2抑制细胞凋亡，而Bax则可以
促进细胞凋亡。本研究发现，在正常PCI2细胞Bcl一
2和Bax呈一定水平表达，用HzOz处理后Bcl一2表
达量明显降低，而Bax表达量明显升高，GSTT干
预组PCI2细胞Bcl一2表达量增加，Bax表达量降
低，因而Bcl一2／Bax二者比例提高，说明GSTT对
H：O：诱导的PCI2细胞凋亡的保护作用通过在转录
及翻译水平调节Bcl一2和Bax的表达实现，同时进
一步证明GSTT对PCI2细胞线粒体通路的凋亡
具有抑制作用，其确切的下游作用位点尚有待进一
步探讨。
参考文献：
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玄参水提物对心室重构大鼠心肌纤维化的影响
顾伟梁，陈长勋‘，王樱，沈云辉
(上海中医药大学药理教研室，上海201203)
摘 要：目的探讨玄参对心室重构大鼠心肌纤维化的影响及其作用机制。方法腹主动脉缩窄法制备大鼠心室
重构模型。8周药物干预后，测定大鼠左室及全心肥厚指数(LVWI、HWI)}紫外分光光度法测心肌羟脯氨酸的量
(hydroxproline，Hyp)；病理切片HE染色观察心肌细胞横断面面积；RT—PCR测定心肌组织转化生成因子口1基因
(TGF一131mRNA)表达水平。结果玄参水提液能降低心肌肥厚指数、羟脯氨酸量，减小左心室心肌细胞的横断面
面积}显著降低TGF-pImRNA表达水平。结论玄参水提液对心肌细胞和问质胶原重构两方面都有显著的抑制
作用，抗心室重构的作用机制与抑制TGF—p1mRNA表达有关。
关键词：玄参；心室重构；羟脯氨酸，TGF—p1基因表达
中图分类号：R286．2，R285．5文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1371—04
心室重构是由一系列复杂的分子和细胞机制导
致的心肌结构、功能和表型的变化，包括心室肌细胞
数量、质量及细胞排列方式上发生改变和心肌间质
细胞(主要为成纤维细胞)及细胞外基质(主要为各
型胶原纤维)数量、质量及构型方式上发生改变。心
肌纤维化(myocardialfibrosis，MF)是指在心肌的
组织结构中胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著升高
或胶原容积分数(CVF)显著增加[1]。心肌纤维化是
心室重构的主要表现之一，可导致心肌僵硬度增加、
心室舒张功能减退、冠状动脉储备下降，甚至引起猝
死，是导致心力衰竭发生、发展的决定性因素[2]。因
此如何逆转心肌纤维化和减轻心室重构成为国内外
共同的研究热点。
玄参为玄参科多年生草本植物玄参Scrophu—
laHaningpoensisHemsl．的根，是著名的传统中药，
始载于《神农本草经》，列为中品，性寒，味苦、甘、咸，
可入肺经、胃经、肾经，具有滋阴，降火，生津，凉血，
解毒等功效。现代药理研究发现玄参对心血管系统
具有广泛而重要的药理作用，而玄参抗心室重构的
实验研究尚未见报道。本研究旨在观察玄参有无抗
心室重构的作用并探讨其可能的作用机制。
l材料与方法
1．1 动物、仪器与试剂：SD大鼠，雄性，体质量
220～250g，购于中国科学院上海实验动物中心，合
格证号：SCXK(沪)2003--0003，饲养于上海中医
药大学实验动物中心SPF级动物实验室。
DL一50RC—L离心机(上海中科生物医学高
科技开发有限公司)，FJ一200高速分散均质机(上
海标本模型厂)，IX70倒置显微镜(日本Olympus
公司)，图像分析系统(Image—Proplus4．0media
cybernetics)，PCRSYSTERM9700(ABI美国应
用生物有限公司)，FR一250电泳仪(复旦科技有限
公司)，Tanon2500凝胶成像(上海天能科技有限
公司)，Biohit移液枪、Eppendorf移液枪、基尔森移
液枪(法国Gilson公司)。
玄参产地浙江(上海养和堂中药饮片有限公
司，批号060913)；卡托普利(上海衡山药业有限公
司，批号060804)；羟脯氨酸测试盒(消化法)(南京
建成试剂公司)；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京
建成试剂公司)；2×PCRMasterMix(上海欣百诺
生物科技有限公司)；RevertAidtTMFirstS rand
cDNASynthesisKit，K1622(Fermentas公司上
海中晶代理)。
1．2玄参药液制备：玄参1012g用8倍量水煎煮3
收稿日期：2007—08—07
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30572379)
作者简介：顾伟粱(1981一)，女．上海人，在读博士研究生，研究方向为中药药理学。Tel：(021)51322398E—mail：gwl22@163．corn
-通讯作者 陈长勋Tel：(021)51322200E—maill cxchen6@126．corn
万方数据
蒺藜皂苷对H2O2诱导PC12细胞凋亡保护作用及其机制研究
作者： 姜恩平， 苏学今， 李红， 杨世杰
作者单位： 姜恩平,李红,杨世杰(吉林大学基础医学院药理学教研室,吉林,长春,130021)， 苏学今(吉
林大学基础医学院病理生物学教研室,吉林,长春,130021)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)
被引用次数： 2次

参考文献(9条)
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PC12细胞凋亡的保护作用[期刊论文]-吉林大学学报（医学版）2008,34(2)
3. 李雁.黄烽.韩涛.林承元.周宝英.林侃.张天强 蒺藜皂苷、高压氧对急性脑梗死患者近远期疗效及其再发的影响
[期刊论文]-中西医结合心脑血管病杂志2009,7(12)
4. 孙巍.李晶莹.李红.杨世杰 蒺藜皂苷对缺血心肌细胞内核转录因子-κB的作用[期刊论文]-中草药2008,39(6)
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QIANG Xin.HUANG Ya-feng.HAN Ying 三味蒺藜散药理作用研究[期刊论文]-内蒙古民族大学学报（自然科学版）
2010,25(4)
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春中医药大学学报2008,24(5)
7. 游国均 蒺藜辨[期刊论文]-中国民族民间医药2008,17(7)
8. 陈文星.李鳞.李梦秋.任宇.陆茵.CHEN Wenxing.LI Lin.LI Mengqiu.REN Yu.LU Yin 蒺藜呋甾皂苷对犬缺血心
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9. 李波.张志强.邸琳.仝岚.刘新宇.李平.徐雅娟.LI Bo.ZHANG Zhi-qiang.DI Lin.TONG Lan.LIU Xin-yu.LI Ping
.XU Ya-juan 蒺藜果皂苷对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡及相关蛋白表达的影响[期刊论文]-疾病控制杂志
2008,12(3)
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学报2008,42(5)

引证文献(2条)
1.张爽.李红.魏征人.梁蕾.张问.杨世杰 蒺藜皂苷预适应对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的影响[期刊论文]-中
草药 2010(6)
2.李蓥.宋宏宇.张羽冠.于丽芳.张爽.李红.杨世杰 蒺藜皂苷后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[期刊论
文]-中草药 2010(8)


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