全 文 ：样的粪质 ,既不会象硬质粗粪那样 ,引起肛门灼热 、
出血 、剧痛 ,也不会象水样稀便那样嵌入创面诱发感
染 ,避免了使用通便药的弊端 。口服进入肠道内 ,保
持肠道微生物平衡 ,有助于促进肠蠕动 ,缓解术后便
秘及其他由排便困难诱发的诸多症状。
参考文献:
[ 1] 　王晓燕.口服痔瘘汤预防肛肠病术后并发症 80 例观察 [ J].
中国肛肠病杂志 , 2003 , 23(4):39.
[ 2] 　刘　平 , 倪　是 , 宋笑玲.痔疮清内服液应用于肛门病术后
疗效观察 [ J].浙江临床医学 , 2002 , 4(2):120-121.
[ 3] 　杨　巍 , 汪庆明.痔血宁合剂治疗痔出血作用机理的实验研
究 [ J].辽宁中医杂志 , 2003 , 30(8):686.
胭脂树橙对白血病 K562 细胞凋亡及 PPARγ蛋白表达的影响
郭朋辉 ,赵文恩＊ ,张　夏 ,李倩倩 ,李　晓
(郑州大学化学工程学院 , 河南 郑州　450001)
摘　要:目的　探讨胭脂树橙在诱导白血病 K562 细胞凋亡过程中对 PPARγ蛋白表达的影响。方法　用胭脂树
橙作用于 K562 细胞一定时间后 ,通过台盼蓝拒染法观察 K562 细胞生长曲线 , MT T 法检测其对细胞的抑制率 ,
Hoechst 33258 染色后 , 荧光显微镜下观察细胞核形态;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;采用 Weste rn-blot ting 技术
从蛋白分子水平上检测胭脂树橙对 PPARγ蛋白表达的影响。结果　胭脂树橙显著抑制 K562 细胞的增殖并呈浓
度依赖关系。电泳的结果显示一定浓度的胭脂树橙能够上调 PPARγ蛋白的表达 ,进而可能诱导 K562 细胞的凋
亡。结论　PPARγ蛋白表达的上调可能是胭脂树橙抑制 K562 细胞增殖诱导凋亡的原因之一 ,其中 ,胭脂树橙具
有 PPARγ非特异配体的作用。
关键词:K562 细胞;胭脂树橙;PPARγ蛋白
中图分类号:R285　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253 2670(2009)05 0782 03
　　胭脂树橙 (bixin)为类胡萝卜素即共轭多烯烃
的加氧衍生物 ,是类胡萝卜双羧酸的单甲基酯化物 ,
具有不同程度的淬灭单线态氧 (激发态氧)的抗氧
化和清除自由基的功能[ 1] 。PPARγ是一类由配体
调节的核激素受体 ,属于核激素受体超家族。越来
越多的研究显示 PPA Rγ在肿瘤的发生中起着重要
的作用[ 2] 。近年来研究表明 PPARγ以失活状态在
多种肿瘤中高表达 ,同时大量文献证实 PPARγ配
体可以通过激活 PPARγ而发挥潜在抗肿瘤作
用[ 3 , 4] 。但是绝大多数的研究只是通过 PPA Rγ的
天然和合成配体对其诱导激活 ,从而发挥 PPA Rγ
在肿瘤细胞中的作用 。类胡萝卜素在自然界中广泛
存在 ,而且无毒性;但是对于能否通过类胡萝卜素诱
导 PPA Rγ表达的研究甚少。本研究以白血病细胞
系 K562 细胞为靶细胞 ,探讨胭脂树橙对 K562 细
胞的凋亡诱导作用及其可能机制 ,并利用 Western
blo t ting 技术从蛋白分子水平上探讨胭脂树橙对
PPA Rγ蛋白表达的影响 ,研究胭脂树橙在分子水平
上的机制 。
1　材料与方法
1.1　材料:胭脂树橙购自 Ex trasynthese 公司;
MT T 购自美国 Gibco 公司;β-actin 抗体和 PPARγ
抗体购自 Santa Cruz 公司;人白血病 K562 细胞由
郑州大学医学院病理生理研究室赠予 。
1.2　细胞培养及分组:取适量冻存细胞复苏 ,置于
细胞培养瓶中 , 加入含 10%胎牛血清的 RPM I
1640 培养基 ,于 37 ℃、5%CO2饱和浓度的培养箱
中培养 。实验分为实验组 (分别用 0.2 、0.4 、2.0 、
4.0 、8.0 mg/ L 胭脂树橙处理 K562 细胞)和对照
组(加入完全培养基),每次实验重复 3次。
1.3　台盼蓝拒染法检测生长曲线:取对数生长期
K562细胞 ,接种量为 8×104个/mL , 分别在台盼
24 、48 、72 、96 、120 h 时取实验组及对照组细胞 ,用
0.4%的台盼蓝染液染色后计数 。每组设 3 个复
孔 ,取其平均值。
1.4　MT T 检测细胞抑制率:取对数生长期 K562
细胞接种于 96 孔培养板 ,每孔 150 μL (约 3×104
个细胞),培养 24 h 后 ,实验组加入不同浓度胭脂树
橙 ,对照组加完全培养基。每组设 6 个复孔 ,培养
24 、48 、72 h 后 ,分别在各时间段结束前 4 h 每孔加
·782· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
＊ 收稿日期:2008-10-17　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作者简介:郭朋辉(1981—),男 ,河南偃师人 ,硕士研究生 ,研究方向为天然产物化学与生物化学。
Tel:13733820589　E-mai l:gu openghui@yahoo.com.cn
MTT (5 mg/mL)150 μL 检测前离心弃上清液 ,每
孔加 DMSO 150 μL ,用 Bio-RAD680 酶标仪于 570
nm 波长处测吸光度(A)值。计算细胞抑制率 。
细胞抑制率=(A对照-A实验)/ A对照 ×100%
1.5　细胞超微结构观察:取对数生长期 K562 细
胞 ,分别在作用 24 、48 、72 h 收集实验组及对照组细
胞 ,用 0.01 mol/ L pH 7.2 的冷 PBS 洗两次 , 加
Hoechst 33258 使其终浓度为 10 mg/L ,室温避光
染色 15 min ,离心后弃上清液 ,加入适量的 PBS 悬
浮细胞 , 涂片 , 紫外光激发 , 荧光显微镜下观察 ,
照相 。
1.6　流式细胞仪检测凋亡率:在 72 h 收集实验组
及对照组细胞 ,以 2 000 r/min 离心 5 min ,弃上清 。
用 PBS 洗涤细胞两次 , 并调整细胞密度为 1 ×
10
6 ～ 5×106/mL。加入 500 μL Binding Buffer 重
新悬浮细胞 ,与 2 μL Annexin V-FITC 混匀后 ,加
入 5 μL PI ,混匀。避光室温反应 15 m in ,立即检
测。使用 Cel l Quest 软件获取细胞信息 , Modifi t
软件分析细胞的凋亡 。
1.7　Western-blot ting 检测:提取实验组和对照组
细胞中的总蛋白 ,测定蛋白水平 ,用 BCA 蛋白分析
试剂盒测定总蛋白浓度 。取总蛋白 50 μg 上样 ,用
10%聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)分离蛋白 ,电
泳后将凝胶中的蛋白电转移至纤维素膜上 ,进行抗
原抗体反应。一抗为兔抗人 PPARγ多克隆抗体 ,
按 1∶800稀释;二抗为辣根过氧化物酶标记的羊
抗兔 IgG 多克隆抗体 ,按 1∶5 000 稀释 。最后经
ECL 超敏发光物检测底物显色 。底片上的条带相
对强度用 NH Image 软件分析 。
1.8　统计分析:实验采用 SPSS 13.0 软件包进行
分析 。MT T 检测结果采用方差分析 ,组间两两比
较用 q检验。
2　结果
2.1　胭脂树橙对 K562 细胞生长曲线的影响:结果
见图 1。胭脂树橙对 K562 细胞增殖和存活均有显
著影响 ,其中≥2.0 mg/ L 胭脂树橙处理后 ,随着作
用时间的延长 ,细胞增殖抑制作用及存活率下降比
低浓度胭脂树橙明显 。同时显示大于 2.0 mg/ L 浓
度的胭脂树橙作用 3 d 后 ,细胞基本不增殖 ,总细胞
数呈缓慢下降的趋势 。
2.2　胭脂树橙对 K562 细胞增殖的抑制作用:结果
见图 2。MT T 法显示胭脂树橙对 K562 细胞增殖
有较强的抑制作用 ,胭脂树橙浓度越高 ,作用时间越
长 ,对细胞的抑制作用越强 ,呈较明显的时间-剂量
依赖性关系。同时显示小剂量的胭脂树橙在作用
3 d 后较作用 1 、2 d 后抑制率有明显提高 。
2.3　胭脂树橙对 K562细胞形态学的影响:对照组
中 K562细胞呈原始未分化状态 ,细胞大而圆 、胞质
少 、胞核大 、核质比例大 ,核染色质细腻 ,见核仁呈现
弥漫性均匀荧光 。2.0 、4.0 、8.0 mg/L 胭脂树橙作
用 24 ～ 72 h 后 ,可见部分细胞呈现典型的细胞凋亡
形态:核染色质呈固缩状或片段状 、胞膜突起 ,细胞
核或细胞浆内可见致密的颗粒状强荧光 ,严重时细
胞出泡形成凋亡小体。
2.4　流式细胞仪分析 K562细胞凋亡率:对照组的
K562细胞凋亡率是 (5.34±1.02)%,胭脂树橙处
理 K562细胞 72 h 后 ,2.0 、4.0 、8.0 mg/L 实验组
的凋亡率分别是 (16.26 ±1.25)%、(23.74 ±
1.67)%、(29.69±1.86)%,与对照组相比差异显著
(P<0.01),说明胭脂树橙能促进 K562 细胞凋亡 ,
且在一定范围内细胞凋亡率与药物浓度呈依赖性。
2.5　胭脂树橙对 K562 细胞中 PPARγ蛋白表达
的影响:结果 (图 3和表 1)显示 4.0 mg/L 胭脂树
·783·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
图 3　胭脂树橙对 PPARγ蛋白表达的影响
Fig.3　Effect of bixin on expression of PPARγprotein
表 1　胭脂树橙对 PPARγ蛋白表达相对强度的影响
Table 1　Relative intensity of bixin on expression
of PPARγprotein
组　别 质量浓度/(mg· L -1) 条带强度
对照 - 1.000±0.050
胭脂树橙 0.4 1.150±0.058
2.0 1.311±0.066
4.0 1.779±0.089＊
8.0 2.511±0.126＊＊
　　与对照组比较:＊P<0.05　＊＊P<0.01
　　＊P<0.05　＊＊P<0.01 vs con trol group
橙处理后的细胞 PPARγ蛋白的表达量为 1.779±
0.089 (P <0.05);8.0 mg/ L 为 2.511 ±0.126
(P<0.01),与对照组相比差异显著 ,说明经胭脂树
橙处理后 ,PPARγ蛋白的表达量随药物浓度的增加
而增加;胭脂树橙可上调 PPA Rγ蛋白的表达 ,并呈
明显的剂量依赖性。
3　讨论
　　有关 PPARγ在胭脂树橙诱导 K562 细胞凋亡
过程中的作用 ,国内尚研究较少。本研究表明 ,经胭
脂树橙处理的 K562 细胞 ,采用台盼蓝拒染法和
MTT 法检测显示 ,胭脂树橙对 K562细胞的抑制作
用同其浓度和作用时间呈依赖性关系 ,即使小剂量
的胭脂树橙(0.2 mg/ L)作用 K562 细胞 3 d后 ,仍
能较显著地抑制细胞增殖 。荧光显微镜观察形态学
显示 ,对照组呈弥漫性均匀荧光 ,核/质比例大;给药
组细胞核变小 ,浓缩 ,荧光加强 ,并观察到有大量细
胞碎片 ,呈现典型凋亡细胞的特征性变化 。在此基
础上 ,进一步研究了胭脂树橙诱导 K562 细胞凋亡
的机制 ,通过 Western-blo t ting 检测 PPA Rγ基因
的表达产物 ,显示胭脂树橙显著上调 PPARγ基因
的蛋白表达 ,并呈剂量依赖性 ,提示胭脂树橙诱导
K562细胞凋亡和 PPA Rγ基因的表达有密切关系。
提示胭脂树橙可能是通过上调 PPA Rγ基因的表达
来促进 K562 细胞的凋亡和抑制其增殖的 ,其中 ,胭
脂树橙起着 PPARγ非特异配体的作用。
PPARγ具有调控细胞因子生成 ,调节体内糖平
衡 ,控制炎症形成和影响肿瘤生长等作用 。最近有
研究显示 , PPA Rγ配体抗肿瘤作用不需激活
PPARγ或 PPA Rγ激活与其他途径共同起作用[ 5] 。
可见有关胭脂树橙诱导细胞凋亡及 PPARγ表达的
分子机制有待进一步研究和证实 。
参考文献:
[ 1] 　Woodall A A , Lee S W , Weesie R J , et a l.Oxidation of ca-
rotenoids by f ree radicals:Relat ionship betw een st ructure and
reactivity [ J].Bioch im B ioph ys Acta , 1997 , 133:33-42.
[ 2] 　Berger J , M oller D E. The mechanisms of action of PPARs
[ J].Annu Rev Med , 2002 , 53:409-435.
[ 3] 　Wil lson T M , Brown P J , S ternb ach D D , et a l.The
PPA Rs:f rom orphan receptors to drug discovery [ J]. J Med
Chen , 2000 , 43(4):527-550.
[ 4] 　Baek S J , Wils on L C , His L C , et a l.Troglit azone , a per-
oxisome prolif erator-activated receptorγ(PPARγ)ligand , se-
lectively indu ces the early grow th resp on se-1 gen e independ-
en tly of PPARγ[ J]. J B iol Chem , 2003 , 278(8):5845-
5853.
[ 5] 　Shen Z N , Nishida K , Doi H , et a l.Supp res sion of ch ond ro-
sarcoma cell s by 15-deoxy-delta 12 , 14-prostaglandin J 2 is as-
sociated wi th altered exp res sion of Bax/ Bcl-x L and P21 [ J].
B iochem B ioph ys Res Comm un , 2005 , 328:375-382.
生当归 、酒当归和油当归体外清除自由基活性研究
邓红娟 ,郭延生 ,曲亚玲 ,杨小虎 ,秦　亮 ,魏彦明＊
(甘肃农业大学动物医学院 ,甘肃 兰州　730070)
摘　要:目的　研究生当归 、油当归和酒当归的水提取液体外对羟自由基(· OH)和氧自由基(O ÷2 )的清除作用。
方法　应用分光光度法测定生当归 、油当归和酒当归水提液对 Fenton 反应产生的· OH 和邻苯三酚自氧化产生的
O ÷2 的清除率。结果　生当归 、油当归和酒当归水提液在 5 ～ 80 mg/ mL 的质量浓度内对· OH 有明显的抑制作
用 ,随着当归及其炮制品水提液质量浓度的增加 ,抑制率明显升高。生当归 、油当归和酒当归水提液对 · OH 清除
·784· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
＊ 收稿日期:2008-10-06　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671541)作者简介:邓红娟(1981—),女 ,山东潍坊人 ,在读硕士 ,从事中药药理及中药免疫研究。 　E-m ail:diaopengfei luky@163.com＊通讯作者　魏彦明　T el:(0931)7631077　E-mail:weiym@gsau.edu.cn