全 文 ：大豆异黄酮抗衰老作用研究
范红艳1 ,顾饶胜1 * , 王艳春1 ,任 旷1 ,沈 楠2 ,常 影1
收稿日期: 20100707
基金项目:吉林省教育厅 十一五 科技计划项目资助课题 ( 2008402)
作者简介:范红艳( 1975 ! ) ,女,吉林省人,硕士,讲师,研究方向为神经药理、心血管药理学。
T el : ( 0432) 64560470 Email: f anh on gyan1975@ yahoo. com. cn
* 通讯作者 顾饶胜 Email: gu rs@ 163. com
( 1 吉林医药学院 药理教研室, 吉林 吉林 132013; 2 吉林医药学院 实验中心机能实验室,吉林 吉林 132013)
摘 要:目的 探讨大豆异黄酮 ( so ybean isof lavon, SI) 抗衰老的作用及其机制。方法 体内实验以 D半乳糖
( Dga l) 120 mg/ kg 颈背部 sc 6 周, 构建大鼠衰老模型,次日以 ig 方式给予 SI 100、200、400 mg/ kg, 连续 6 周。通
过 M or ris 水迷宫观察大鼠学习记忆能力的改变 ;分光光度法检测脑组织中丙二醛 ( MDA ) 水平、超氧化物歧化酶
( SOD) 活性、Na+ , K +ATP 酶和 Ca2+ AT P 酶活性; 酶标仪检测血清中 NO 活性。体外实验建立 H 2O2致 PC12
细胞损伤模型,给予 0 5、1 0、2 0 mg/ mL SI 干预,采用 MTT 比色法测定细胞存活率, 酶标仪检测细胞上清中 NO
活性, Western blo tting 检测各组 PC12 细胞 Bcl2 蛋白的表达。结果 SI 中、高剂量可改善 Dgal致衰老大鼠的学
习记忆能力,增强脑组织中 SOD、Na+ , K+ ATP 酶和 Ca2+AT P 酶活性,降低血清中 NO 的量, SI 低、中、高剂量
降低大鼠脑组织中 MDA 水平 , 同模型组比较有统计学差异 ( P < 0 05、0 01)。SI ( 1 0、2 0 mg/ mL ) 可抑制
H2O2致 PC12 细胞氧化损伤及 NO 的增多, 与模型组比较具有统计学意义 (P < 0 05) ; SI 可增加 Bcl2 蛋白表达。
结论 SI 可通过抗氧化作用、降低 NO 水平及上调 Bcl2 蛋白表达, 起到抗衰老作用。
关键词:大豆异黄酮; 衰老; D半乳糖; H2O2 ; Bcl2
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2054 03
大豆异黄酮 ( soybean iso flavone, SI) 是一种
以 3苯并吡喃酮为母核的双酚类化合物,多存在于
大豆及其制品中。近年来 SI 以其广泛的生物学活
性[ 15] ,如促生长、雌激素样作用、增强机体免疫、抗
炎、抗肿瘤、血管舒张、保护心肌等作用,日益受到关
注。本研究采用 D半乳糖 ( Dgal ) 建立体内大鼠
衰老模型, 观察不同剂量 SI 对大鼠衰老的影响。
H 2O2是活性氧族的主要成分之一, 在代谢过程中产
生活性氧、自由基导致细胞凋亡, 引起神经元损害。
本研究以大鼠嗜铬细胞瘤细胞 PC12 为对象, 采用
H 2O2建立体外氧化损伤细胞模型, 观察 SI 对抗
H 2O2的作用,并在细胞水平探讨其机制。
1 材料
1 1 动物: W istar 大鼠, 清洁级,雌雄兼用,由吉林
大学基础医学部实验动物中心提供。
1 2 药品与试剂: SI (质量分数 99%) ,郑州荔诺生
物科技有限公司; Dgal, 张家港市华昌药业有限公
司; H 2O2、MT T, 百奥生物技术有限公司; IMDM 和
血清, Gibco 公司;胰蛋白酶, 宝泰克生物科技公司;
超氧化物歧化酶 ( SOD)、丙二醛 ( MDA )、ATP 和
总蛋白试剂盒, 南京建成生物工程公司; NO 试剂
盒, 海门市碧云天生物技术研究所; bcl2 抗体,
Santa Cruz公司。
2 方法
2 1 体内实验
2 1 1 实验分组和给药: Wistar 大鼠 60 只, 体质
量 180~ 220 g, 随机分为 5 组: 对照组、模型组、SI
各剂量 ( 100、200、400 mg / kg) 组, 每组 12 只。除
对照组外,各组均颈背部 sc Dgal 120 mg / kg, 每天
1次, 连续 6 周, SI 组自第 2天开始 ig 给药,每日 1
次,共 6 周,对照组和模型组每日给予相同体积的
0 25% 羧甲基纤维素钠溶液。
2 1 2 学习记忆能力的测定:于给药结束后次日进
行 Morris 水迷宫行为测试。水迷宫直径 150 cm、
高 60 cm、水深 30 cm ,水温 ( 22 ∀ 1) # , 加适量二
氧化钛使水呈乳白色, 将平台放在西南象限正中距
池壁 22 cm 处, 迷宫中液面高于平台 1 cm,训练期
间环境安静, 迷宫外参照物不变。每天 8: 00 !
10: 00 时每组分别训练 1次,连续训练 4 d。大鼠头
部涂以黄色染剂, 训练时每天从东侧入水点将大鼠
面向池壁放入水池,同时启动记录装置,记录大鼠寻
找平台的时间 (逃避潜伏期) ,设定 120 s 为最长逃
避潜伏期, 120 s 后自动停止记录。若大鼠在 120 s
内仍未找到平台, 则将其引至平台并停留 10 s, 潜伏
期记为 120 s。于第 5天行定位航行试验和空间探
索试验。定位航行试验: 将大鼠于西南象限面向池
∃2054∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
壁放入水中,自动记录大鼠找到平台的潜伏期,检测
大鼠的学习能力。空间探索试验:定位航行试验结
束后撤除平台, 选择西南象限的中心作为入水点, 将
大鼠面向池壁放入水中, 观察并记录 120 s 内大鼠
在原平台所在象限的停留时间以及穿越原平台次
数,以检验大鼠的记忆能力。
2 1 3 标本的采集: M orris 水迷宫试验结束后禁
食不禁水 12 h, 以 10% 水合氯醛 ip 麻醉, 腹主动
脉取血,静置 30 min, 3 000 r/ m in 离心 15 m in分离
得血清备用;迅速在冰上取脑组织, 用 4 # 生理盐
水洗涤脑组织,吸干,精确称量 0 2 g, 加 2 mL 生理
盐水,在冰浴下制成 10% 组织匀浆, 3 000 r/ m in,
离心 15 min,取上清液备用。
2 1 4 脑组织 MDA 水平、SOD 活性和血清 NO
水平的测定: 取 10% 脑组织匀浆上清液严格按试
剂盒说明测定 MDA; 取 1% 脑组织匀浆上清液严
格按 SOD 试剂盒说明测定其活性。取血清, 严格
按试剂盒说明用酶标仪检测血清中 NO 的量。
2 1 5 脑组织 Na+ , K + ATP 酶和 Ca2+ AT P 酶
活性的测定: 取 10% 脑组织匀浆上清液, 严格按
ATP 酶试剂盒说明测定其 Na+ , K+ AT P 酶和
Ca2+ AT P 酶活性。
2 2 体外实验
2 2 1 PC12细胞培养、处理方法: PC12 细胞由吉
林大学实验动物中心提供, 培养于含 10% 胎牛血
清的 IMDM 培养液中,于 37 # 、5% CO2条件下培
养,选取对数生长期细胞分组进行实验。H 2O 2处理
按如下程序实施: 细胞常规培养 48 h, 给予 20
mol/ L H 2O 2作用 4 h 后终止反应。SI 在 H2O2损
伤前 24 h 加入培养液。
2 2 2 实验分组和给药: PC12 细胞根据要求分
为:对照组、H 2O2模型组、SI 药物 (低、中、高剂量)
处理组。各组细胞无血清培育 24 h 后,药物治疗组
同时给予 SI 24 h,终质量浓度分别为 0 5、1 0、2 0
mg/ mL,对照组和模型组给予 1% 血清的 IMDM
培养基,给予 SI 24 h 再给予 20 mol/ L H 2O 2 4 h
后,测定各项指标。
2 2 3 MTT 法测定细胞增殖:将处于对数生长期
的 PC12 细胞制成细胞悬液, 各组细胞以 4 % 105 /
mL 浓度接种于 96 孔培养板, 每组设 10个复孔, 每
孔 200 L。分别给予不同的处理因素作用 28 h, 每
孔加入 MT T 溶液 ( 5 mg / mL) 20 L, 37 # 继续
培养 4 h,终止培养,每孔加入 150 L DMSO, 震荡
10 min 后酶标仪上测吸光度 ( A ) 值, 测定波长
490 nm, 计算细胞存活率。
细胞存活率= 实验组 A 值/对照组 A 值% 100%
2 2 4 NO 水平测定:取第 3代 PC12 细胞制成细
胞悬液,以 4 % 105 / mL 浓度接种于 96 孔板, 每孔
0 2 mL。各因素处理后,吸取细胞上清液按照试剂
盒说明用酶标仪检测细胞上清液中 NO 水平。
2 2 5 Western blot t ing 检测 Bcl2:整个检测过程
按规定操作步骤严格进行。提取各组 PC12 细胞蛋
白, Low ry 法测定蛋白水平,进行电泳、转膜、显色。
Band lecd 图像分析系统进行条带分析。
2 3 统计学分析: 数据以 x ∀ s 表示, 组间比较采
用方差分析及 q 检验进行。
3 结果
3 1 体内实验
3 1 1 对 Dgal 致衰老大鼠学习记忆能力的影响:
结果表明,模型组大鼠出现学习记忆功能障碍、空间
定位记忆障碍,表现为模型组大鼠逃避潜伏期较对
照组明显延长、穿越平台次数减少,差异有统计学意
义 ( P < 0 05、0 01)。SI 中、高剂量 ( 200, 400
mg/ kg) 组与模型组比较, 其逃避潜伏期显著缩短、
经过平台次数增加 ( P< 0 05、0 01) , 表明 SI 可以
改善衰老大鼠的学习记忆能力, 但尚未达到对照组
水平,见表 1。
表 1 SI 对 Dgal致衰老大鼠学习记忆能力的影响
(x ∀ s, n= 12)
Table 1 Effect of SI on deficit of learning and memory
of rats induced by Dgal (x ∀ s, n= 12)
组别 剂量/ ( mg ∃ kg- 1) 逃避潜伏期/ s 穿越平台次数/次
对照 - 25 75 ∀ 17 62 4 10 ∀ 2 92
模型 - 55 42 ∀ 40 89* * 1 88 ∀ 1 59*
SI 100 49 68 ∀ 39 68 3 00 ∀ 2 39
200 34 62 ∀ 27 33# 3 91 ∀ 2 81#
400 30 42 ∀ 28 03# # 4 00 ∀ 3 16#
与对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
与模型组比较: # P < 0 05 # # P < 0 01 (下表同)
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s cont rol g rou p
# P < 0 05 # # P< 0 01 v s m odel group
( f ol low ing tables are sam e)
3 1 2 对 Dgal 致衰老大鼠脑组织 MDA 水平、
SOD活性和血清中 NO 水平的影响: 结果表明, SI
各剂量组大鼠脑组织中 MDA 减少, SI 中、高剂量
组大鼠脑组织中 SOD 活性增强,血清中 NO 降低,
与模型组比较具有统计学差异 ( P< 0 05、0 01) ,见
表 2。
3 1 3 对 Dgal致衰老大鼠脑组织中 Na+ , K +
AT P 酶和 Ca2+ AT P 酶活性的影响: 结果表明,模
∃2055∃中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
型组大鼠脑组织中 Na+ , K + ATP 酶和 Ca2+ AT P
酶的活性明显低于对照组 ( P < 0 05、0 01)。SI
中、高剂量 ( 200、400 mg / kg ) 组大鼠脑组织中
Na
+
, K
+ ATP 酶和 Ca2+ AT P 酶活性明显高于模
型组,具有统计学意义 ( P< 0 05、0 01) ,说明 SI 具
有一定的提高 Na+ , K+ AT P 酶和 Ca2+ A TP 酶
活性的作用,见表 3。
表 2 SI 对 Dgal 致衰老大鼠脑组织 MDA 水平、SOD 活性
和血清中 NO水平的影响 (x ∀ s, n= 12)
Table 2 Effects of SI on content of MDA, activity of SOD
in brain tisstue and content of NO in serum
of Dgal induced seniled rats ( x∀ s, n= 12)
组别 剂量/
( mg∃ kg- 1)
MDA/
( nmol∃ mg - 1 )
SOD/
( U ∃ mg- 1 )
NO/
(mol∃ L- 1)
对照 - 1 70∀ 0 42 111 53∀ 56 83 1 20 ∀ 0 29
模型 - 2 39∀ 0 52* * 58 95∀ 19 97* * 1 95 ∀ 0 73*
SI 100 1 82∀ 0 72# 75 97∀ 25 50 1 50 ∀ 0 73
200 1 79∀ 0 43# # 89 73∀ 44 57# 1 33 ∀ 0 35#
400 1 74∀ 0 42# # 93 56∀ 29 72# # 1 27 ∀ 0 50#
表 3 SI 对 Dgal 致衰老大鼠脑组织 Na+ , K+ATP 酶和
Ca2+ ATP 酶活性的影响 (x ∀ s, n= 12)
Table 3 Effects of SI on activities of Na+ , K+ATPase
and Ca2+ATPase of brain tissue in Dgal
induced seniled rats ( x∀ s, n= 12)
组别 剂量/
( mg∃ kg - 1)
Na+ , K+ ATP 酶活性/
(mo lPi∃ mg- 1 ∃ h- 1 )
Ca2+ ATP 酶活性/
(molPi∃ mg- 1 ∃ h- 1)
对照 - 0 30∀ 0 14 0 37 ∀ 0 10
模型 - 0 20∀ 0 05* 0 23 ∀ 0 05* *
SI 100 0 20∀ 0 08 0 23 ∀ 0 07
200 0 29∀ 0 11# 0 31 ∀ 0 12#
400 0 31∀ 0 07# # 0 32 ∀ 0 06# #
3 2 体外实验
3 2 1 对 H 2O2致 PC12 细胞氧化损伤的影响:
MT T 结果表明, H 2O 2氧化损伤模型组细胞存活率
显著低于对照组 ( P< 0 01) , 提示线粒体脱氢酶的
活性降低, 活细胞数目较少; 经 SI ( 1 0、2 0 mg/
mL) 作用后, 细胞存活率增加,与模型组相比有统
计学差异 ( P< 0 05、0 01) ,且随剂量增加作用逐渐
增强,提示线粒体脱氢酶的活性升高,活细胞数目增
多, SI 具有细胞保护作用,见表 4。
3 2 2 对 H 2O 2致 PC12细胞氧化损伤的细胞上清
中 NO 的影响: 模型组细胞上清中 NO 水平明显高
于对照组 ( P< 0 01)。SI 1 0、2 0 mg/ mL 可抑制
H 2O2氧化损伤的 PC12 细胞上清中 NO 增多 ( P<
0 05、0 01) ,见表 4。
3 2 3 SI 对 H 2O 2氧化损伤的 PC12细胞 Bcl2 表
达的影响: Wester n blo tt ing 检测各组 PC12 细胞
Bcl2蛋白表达, 结果可见, SI ( 0 5、1 0、2 0 mg/
mL) 可增加 Bcl2 蛋白表达。见图 1。
表 4 SI 对 H2O2氧化损伤的 PC12 细胞存活率、
上清液中 NO的影响 ( x ∀ s, n= 10)
Table 4 Effect of SI on survival rate and NO content
in PC12 cell supernatants injured by H2O2
( x ∀ s, n= 10)
组别 / ( mg ∃ mL- 1 ) 细胞存活率/% NO/ (m ol ∃ L- 1)
对照 - 100 03 ∀ 845 0 53 ∀ 0 25
模型 - 50 05 ∀ 1097* * 0 99 ∀ 0 30* *
SI 0 5 55 38 ∀ 966 0 83 ∀ 0 24
1 0 63 42 ∀ 916# 0 66 ∀ 0 27#
2 0 87 22 ∀ 1237# # 0 57 ∀ 0 21# #
与对照组比较: * * P < 001
与模型组比较: # P < 0 05 # # P < 0 01
* * P < 0 01 v s cont rol group
# P < 005 # # P< 0 01 v s m odel group
图 1 SI 对 H2O2氧化损伤的 PC12 细胞 Bcl2
蛋白表达的影响
Fig. 1 Ef fect of SI on Bcl2 expression of PC12
cell injured by H2O2
4 讨论
Dgal所致大鼠亚急性衰老模型主要是过量的
Dgal在醛糖还原酶催化下还原成半乳糖醇, 其不
能被进一步代谢而堆积在细胞内,影响正常渗透压,
导致细胞肿胀,功能障碍, 代谢紊乱, 破坏并消耗机
体抗氧化防御系统,使自由基积聚,而过氧化脂质等
增高出现衰老[ 6]。机体衰老的基础是细胞衰老, 而
细胞水平的改变主要表现在细胞膜上。Na+ , K +
AT P 酶、Ca2+ ATP 酶是细胞膜上重要的膜蛋白,
其活性改变是反映机体早期生理功能衰退极为敏感
的指标。Na+ , K + AT P 酶、Ca2+ ATP 酶的部分
亚基都暴露在细胞膜外层, Dgal 可以与其功能部
∃2056∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
位结合产生膜毒性, 导致离子流紊乱, 能量供给匮
乏,引起脑组织损伤。近年研究发现细胞内 Ca2+ 的
超载与衰老密切相关, 而 Na+ , K + AT P 酶、Ca2+
ATP 酶的活性是 Ca2+ 正常分布的基础, 现已作为
观察衰老的新指标[ 7]。本研究体内实验结果表明,
模型 组 大 鼠 脑 组 织 中 Na+ , K + AT P 酶、
Ca
2+ AT P 酶活性降低,且出现明显的学习记忆障
碍,表现为逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显
减少,表明衰老模型复制成功。经 SI 治疗 6 周后,
SI 中、高剂量 ( 200、400 mg/ kg ) 组大鼠脑组织中
Na
+
, K
+ AT P 酶、Ca2+ AT P 酶的活性增强, 逃避
潜伏期明显缩短, 穿越平台次数明显增加, 说明 SI
通过稳定细胞膜,改善脑组织能量代谢,保护细胞免
受损伤,而减弱了 Dgal 导致的衰老作用,增强了大
鼠的学习记忆能力。SOD 和 MDA 被公认是抗衰
老药物研究的重要指标。NO 可调节脑血流量及神
经递质释放,突触可塑性的发育,参与癫痫、疼痛、学
习记忆、缺氧缺血性脑损伤过程。但在过量时, NO
可与超氧化阴离子发生反应, 生成氧化亚硝基阴离
子,直接对组织细胞产生神经毒性作用,导致神经细
胞坏死或凋亡[ 89] 。
本研究体内实验结果表明,模型组大鼠脑组织
中 SOD 活性降低, MDA 增高及血清中 NO 增加,
说明衰老与脂质过氧化作用及 NO 过量产生细胞
毒性作用密切相关。本研究体内实验采用 SI 治疗
6周, 在 100~ 400 mg / kg 剂量范围内可见衰老大鼠
学习记忆能力的提高, 同时大鼠脑组织中 SOD 活
性增强、MDA 减少、血清中 NO 减少。结果表明:
SI 改善学习记忆作用可能与其提高机体 SOD 等抗
氧化酶活力,减少 MDA 等代谢产物的产生, 增强其
对自由基的清除能力,抑制脂质过氧化作用, 保护脑
神经细胞免受自由基的损害有关,也与降低 NO 水
平,从而减弱其神经毒性作用有关。
PC12 细胞是肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系, 具有
神经元细胞的诸多特征, 因而成为研究神经元细胞
常用的模型[ 10 ]。H 2O 2可直接攻击膜性结构, 导致
细胞膜、线粒体膜损伤, 使其通透性增高, 同时由于
ATP 合成不足, 导致 Ca2+ 泵失灵, 细胞内 Ca2+ 超
载,以及线粒体受损后细胞色素 C 和其他凋亡诱导
因子的产生和释放,出现级联式凋亡反应 [ 1112]。本
研究体外实验以 H 2O 2建立 PC12 细胞氧化应激损
伤模型,发现给予 20 mo l/ L H 2O2 4 h 后使 PC12
细胞存活率下降, 细胞培养液上清 NO 增多, 说明
PC 12 细胞凋亡模型成立。SI 预处理后提高了细
胞的存活率, 减轻细胞膜的损伤, 恢复细胞膜的形
态, SI 可降低 H 2O 2诱导的细胞凋亡及 NO 增多,表
明 SI 在抑制凋亡的同时也能抑制 NO 的增加, 进
而抑制衰老。
Bcl2蛋白的生理功能主要是抑制细胞凋亡,延
长细胞寿命。本实验结果显示 H 2O2可以使 PC12
细胞抑凋亡蛋白 Bcl2 的表达明显降低, SI 低、中、
高剂量可不同程度地促进 Bcl2 蛋白表达, 说明 SI
对抗大鼠 H2O2损伤作用与调控 Bcl2 蛋白的表达
有关。
综上所述, SI 作为一种植物雌激素 [ 1314] , 其抗
衰老作用与稳定细胞膜、抗氧化、减少 NO 的生成、
上调 Bcl2 蛋白有关。
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