全 文 ：毒隐翅虫素生物合成的分子基础
刘志萍,王进军*
(西南大学植物保护学院 昆虫学及害虫控制工程重庆市市级重点实验室, 重庆 400716)
摘 要:毒隐翅虫素( pederin)是毒隐翅虫属昆虫在体内生物合成的一种动物毒素, 用以抵御天敌。Peder in 接触到
人或动物的皮肤时可引起线性皮炎, peder in 可抑制细胞的有丝分裂, 阻碍蛋白质与 DNA 的生物合成, 在癌症治疗
与细胞生物学研究方面具有重要意义。目前认为 peder in 可能是通过两条途径合成, 现就此两条合成途径进行详
细的介绍,但其中的部分基因簇及基因迄今仍不为所知。
关键词:毒隐翅虫素; 生物合成; p ed 基因;基因簇
中图分类号: R2821 1 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2009) 03 0500 04
Molecular basis of pederin biosynthesis
LIU Zh-i ping, WANG Jin- jun
( Key Labor ator y o f Entomo lo gy and Pest Contr ol Eng ineer ing, Co llege o f Plant P ro tect ion,
Southw est University, Chongqing 400716, China)
Key words: peder in; biosynthesis; p ed gene; gene cluster
毒隐翅虫是鞘翅目( Co leoptera )隐翅虫科 ( Staphy lin-i
dae)毒隐翅虫属( Paederus Fabricius)昆虫的总称,以其鲜艳
的警戒色易与其他隐翅虫相区别[1]。毒隐翅虫属目前已知
有 621种, 其中 35种在其血淋巴中含有或可能含有毒隐翅
虫素( peder in) [ 2]。这种毒素可引起人或动物的线性皮炎及
多种并发症[3, 4]。毒隐翅虫可利用 peder in 保护自己免受天
敌的攻击[5]。现代医学发现 pederin 可抑制细胞的有丝分
裂,阻碍蛋白质与 DNA 的合成[ 6] , 可医治慢性坏死溃疡湿
疹、神经性皮炎, 甚至肿瘤等,在癌症治疗及细胞生物学研究
中有着重要意义,现已成为一种试验性抗菌素[ 7]。近年来,
尽管国内对 peder in 的研究有少量报道[7~ 10] , 但具体就 ped-
er in 生物合成的分子基础研究却鲜有报道。为更好地在国
内利用 pederin, 本文就近些年国内外在该领域的研究进展
进行综述。
1 Pederin的结构特征
Pavan 等[ 11]首次从收集的 2 500 万头梭毒隐翅虫 P ae-
derus f us cip es Curtis 中分离出一种复杂的非蛋白昆虫毒
素[1] ,并将其命名为毒隐翅虫素 ( peder in)。对 pederin 的空
间结构与立体化学经 X 射线晶体学研究后发现[12~ 16] , 其是
带有 2 个四氢吡喃环的酰胺及脱氢的酰胺[17] (图 1)。令人
惊讶的是,从海绵动物体内也分离出大量结构和功能上与
pederin 非常相似的化合物[ 18] , 如 mycalamide A 和 onnamide
A(图 1)。这些从海绵中分离出的化合物, 因与 peder in 含有
相同的母核结构[ 19, 20] ; pederic acid(图 1) , 而被统称为 ped-
er in 家族[21]。在亲源关系上如此遥远的两个物种,在活性物
图 1 毒隐翅虫素、mycalamide A、onnamide
A 和 pederic acid的结构
Fig. 1 Structures of pederin, mycalamide A,
onnamide A, and pederic acid
质的结构与功能上却具有如此大的相似性, 引起了科研人员
的强烈兴趣[ 22]。
2 Pederin的细胞毒性
21 1 对细胞形态的影响: 经体外培养的不同细胞系的实验
证明[ 23] , peder in 在 11 5 ng / mL 的质量浓度下即可抑制所有
细胞系中细胞的生长; 对于中度敏感的 EUE 细胞系, peder in
在 01 3 ng / mL 的极低质量浓度下仍可有效抑制细胞的生
长。用 100 ng/ mL 的 pederin 处理培养细胞 0~ 24 h, 50 min
后观察到细胞有丝分裂活动明显降低; 3h后细胞质中观察
#500# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40卷第 3期 2009 年 3 月
* 收稿日期: 2008- 10-09基金项目:重庆市自然科学基金项目( 2007BB1364)作者简介:刘志萍( 1976) ,女,在职博士生,主要从事昆虫分类学及昆虫分子生态学研究。 E-m ail : l zpzena@ 126. com
* 通讯作者 王进军 E- mai l: jjw an g7008@ yahoo. com
到一些散在的高密度点状物质,随后染色体有丝分裂在中期
被阻断; 5 h 后细胞核开始降解; 22 h 后细胞核成为碎片, 之
后细胞彻底消散。表明 peder in 具有强大的细胞毒性。
21 2 对大分子物质合成的影响: 用3H-胸苷和14C-亮氨酸作
为示踪分子来研究 pederin 对大分子物质生物合成的影响[23]。
发现 11 5 ng/ mL pederin 可立即阻碍蛋白质与 DNA的生物合
成, 为普通抗生素的 103~ 104 倍。后期的实验表明, pederin
对 DNA 复制的阻碍作用与对蛋白质合成的阻碍作用几乎同
时发生, 但在程度上前者要轻微一些; 在 11 5 ng/ mL 与 100
ng/ mL 两个浓度下,均未观察到 pederin 对 RNA的影响。
3 Pederin生物合成的分子基础
Peder in 对细胞有丝分裂强大的抑制作用, 以及可专一
性地抑制蛋白质与 DNA 合成, 使得它在抗肿瘤治疗、生物
医学和细胞生物学研究领域均有良好的应用前景[ 24]。为了
得到高纯度的 peder in, 前期研究人员做了一系列的化学合
成研究工作[18, 25, 26] , 但其费用昂贵, 技术复杂。之后虽对其
化学合成路径进行了优化,减少了反应步骤, 提高了生产效
率[27] , 但仍有大量副反应发生,依旧无法与昆虫的生物合成
路径相媲美。
Peder in 为多聚酮化合物, 在生物体内被一种称为多聚
酮合成酶( polyketide synthases, PKSs) /非核糖体蛋白合成
酶( nonr ibosomal peptide synthetases, NRPSs) 的多功能巨
型酶( megaenzymes)催化合成。PKSs 是由多个催化结构域
组成的大型、多功能的合成酶。每个结构域对应着多聚酮化
合物相应的官能团。通常 PKSs 中最小的催化结构域由酮
合成酶 ( ketosynthase, KS )、氨基转移合成酶 ( acyltrans-
fer ase, AT )和氨基转移蛋白 ( acyllcarr ier pro tein, ACP )结
构域组成。其中 KS 催化聚合反应; AT 选择正确的乙酰~
CoA; ACP在媒介之间形成共价键。而更进一步复杂的修
饰反应,比如酮基之间或双键之间的缩合反应、脱水反应或
甲基化反应,被另外的起修饰作用的结构域来催化。在多数
情况下, PKSs 中的每个结构域均能监控合成产物的最后结
构。有了这样的/ 线性规律0 ( co linear rule)的存在, 就可以
通过分析 PKSs 的基因序列从而对合成产物基本结构进行
预测[28]。
为了研究 peder in 的生物合成机制, 用来自不同栖息地
的梭毒隐翅虫中的 12 个带毒隐翅虫的全 DNA 构建了含有
80 000 个克隆的宏基因组粘粒文库[ 29] ,用 PKSs 中保守序列
KS 的基因作为专一性探针扫描文库,发现了 8 个阳性粘粒
位点,找到了约为 531 8 kb 的开放阅读框( ORF) , 其与 Ñ 型
PKSs 基因之间有较高的同源性, 所有扩增的 KS 序列均能
在这段 ORF上找到。P iel[ 28] 把这段 ORF 命名为 p ed 基因
( p ed gene) ,它编码了一种 PKSs/ NRPSs 的混合蛋白模块。
/ p ed 基因0由 p ed A~ p ed H 共 8 个基因簇组成, 其中
p ed F和 p ed H 的结构最为复杂,分别由 7~ 6 个模块组成。
它们的产物分别是由 8 601 和 6 266 个氨基酸组成的蛋白
质,这两个蛋白质同时具有类似于 PKSs 和 NRPSs 的结构
特征。与其他的 Ñ 型 PKSs 相比较, 这两个蛋白缺失包括
GHS 活性位点在内的约 300 个氨基酸的 AT 结构域, 这表
明在 p ed F和 p ed H 中缺少编码 AT 的基因。将 p ed F 中
的第一模块 p ed F1 与其同源片段 ) ) ) 阿维菌素 ( avermec-
tin)合成基因中的一段 ) ) ) AVES2-1 比较(图 2) ,可以清楚
地看出, p ed F1 中编码 AT 的基因片段被删除了, 且无任何
其他同源片段来代替。
图 2 p ed F1 与 AVES2-1 的比较
Fig. 2 Comparison of ped F1 and AVES2
AT 在产物链的延伸过程中起重要作用, 选择乙酰~
CoA 基团连到正确的 ACP 上, 那么 p ed F 在缺失这一重要
基因的情况下是如何组装 pederin 分子的呢? 在 p ed F的上
游, 发现了 p ed C 和 p ed D两个独立的基因, 表达产物与 AT
具有很高的同源性。这样 p ed C、p ed D可能通过反式作用
弥补了 p ed F 和 p ed H 中缺失 AT 基因的缺陷; 在 p ed C 和
p ed D 的上游是 p ed B,产物与氧化还原酶有很近的亲源关
系, 以黄素单核苷酸( FM N)作为协调因子。氧化还原酶在
p ed B 中的大量出现, 表明 p ed B 在早期的生物合成阶段起
了重要作用, 推测可能涉及到了小分子前体的供给。
Peder in 的生物合成过程(图 3) : 由 p ed B 提供的带有乙
酰~ CoA 的小分子前体在 p ed C 和 p ed D 表达的 AT 的帮
助下, 与 p ed F1 的表达产物 ACP 连接; p ed F2 的结构很特
殊, 它与 NRPSs 的基因有同源性, 表达产物催化了蛋白源与
非蛋白源氨基酸的连接。在这里 p ed F2 的表达产物催化氨
基乙酸与小分子前体以肽键的方式连接; p ed F4 中出现了
较为少见的甲基转移酶( methy ltr ansfer ase, MT )基因,同样
的结构出现在耶耳森菌素( y ersiniabactin) [ 30] 和环氧聚微管
素( epo thilone) [ 31]的合成基因中, 在这两者的生物合成过程
中, MT 催化生成了成对的甲基基团,在 pederin 的合成过程
中, p ed F4 中的 MT 可能发挥了同样的作用, 在第 14 位 C
原子处催化生成了成对的甲基基团; p ed F5 中出现了重复
的脱水酶( dehydratase, DH)基因。[类似的结构在无活菌素
( nonaction) [32]的合成基因出现过。只不过在无活菌素合成
过程中, 两个拷贝的 DH 基因编码在一个单独的基因上, 而
且催化产物是无活菌素中的五元环] ,在 pederin 的合成过程
中, p ed F5 中重复的 DH , 可能通过脱水反应和随后发生在
第 11 位碳原子上羟基的米氏增加反应催化了二甲基四氢吡
喃环的闭合反应。
从图 3 中可以看出, p ed F 的每个模块具有不同的催化
活性, 几乎可以合成 pederin 分子的大部分骨架,且 p ed F 的
各模块与 pederin 分子中的每个基因基本对应, 遵循/ 线性
规则0。
但是, p ed F 中缺失硫酯酶基因, 其合成的产物链是如
何释放的? p ed H 位于 p ed F 的下游,编码 PKSs 与 NRPSs
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 3 期 2009 年 3月 # 附 1#
T P:转座酶假基因; MT : 甲基转移酶; OR:氧化还原酶; OXY: 加氧酶; C:非核糖体蛋白合成酶( NRPS) 凝聚区; A : NRPS 腺苷酰化区;
T : NRPS巯化区; DH :推测的非功能性脱水酶区
T P: t ransposase p seud ogene; MT : meth ylt ran sferase; OR: oxidoreductase; OXY: oxygenas e; C, NRPS conden sat ion domain ; A,
NRPS aden ylat ion domain; T , NRPS thiolation domain; DH : pu tat ive nonfunct ionaldehydratase domain
图 3 ped基因的序列图及 pederin的假定的生物合成路径
Fig. 3 Sequence of ped genes and biosynthesis pathway of proposed pederin
混合蛋白的产物,含有硫酯酶基因, 可释放合成的产物链, 且
p ed H 中含有与编码丁香霉素 ( s yringomycin ) [ 33] 和微囊藻
素( micr ocystin adeny lation) [ 34]的基因相似的单元, 可在产物
末端形成精氨酸残基或腺嘌呤基团。因而, p ed H 可能进一
步延伸了由 p ed F 合成的 pederin 型前体,生成了一个带有
多聚酮侧链和精氨酸残基的/ 海绵型0中间产物( / sponge )
type0 intermediate) ,随后在硫酯酶的作用下, 释放了这个中
间产物。按照/ 线性规则0 , p ed F 与 p ed H 应该是连在一起
的大型基因。但是, p ed G 插入到了 p ed F 与 p ed H 之间,
这可能是在进化过程中,基因发生了重组或重排。p ed G 的
功能还不太清楚,推测可能是氧化还原酶, 类似于 FAD依赖
型单加氧酶[29]。
目前,对于 pederin 生物合成通常认为可能存在两条路
径[29]。路径 A: p ed F 基因首先合成了 peder in 前体, 但是在
进化过程中,氧化酶基因 p ed G 的插入, 破坏了基因的完整
性,导致了产物链的延伸过程在 p ed F6 处提前结束。因为
p ed F中缺失硫酯酶基因,无法合成硫酯酶释放已合成的产
物链,所以产物链会一直与 p ed F6 基因连接,直到在 p ed G
处经氧化还原化应被切除下来。这可以解释为什么 p ed G
会出现在 p ed 基因的这个位置, 以及 peder in 分子末端为什
么会出现经氧化的 C 原子。路径 B: pederin 前体在 p ed G 处
未被切除,而是跳过 p ed G 经 p ed H 催化合成了带有多聚酮
长链和精氨酸残基末端的类似 onnamide A 的中间产物, 这
个中间产物在 p ed H 6 处被硫酯酶切除, 随后在 p ed G 产物
催化的 Baeyer-V illiger 氧化反应过程中[ 35] , 被切割成 ped-
er in 前体和一段长链次级片段。最后经路径 A、B生成的 pe-
derin前体, 在具有 MT 功能的 p ed A、p ed E 作用下, 在碳链
末端连接两个甲基基团,生成最终产物 pederin。
p ed 基因模型虽然较好地解释了 peder in 合成的主要路
径,但是根据/ 线性规则0推测, 还有大量的涉及到 pederin 合
成的小基因没有找到。而且 p ed B、p ed G 等基因簇的功能
还处于假说阶段,彻底阐明其具有功能还需进行缺失基因功
能的研究。
4 结语
毒隐翅虫素( pederin)对于癌症预防和治疗有着潜在的
应用价值,国外学者已做了大量的尝试, peder in 的合成是关
键。在化学合成路径陷入困境时,生物合成路径是取得高纯
度 pederin 的最佳方法。在阐明 peder in 的生物合成机制之
后,通过生物技术, 利用生物反应器可以大量合成 pederin。
目前Ñ 型 PKSs 基因在大肠杆菌 Escherichia coli [ 36] 中的成
功表达已经使人们有能力进行此项研究。另外, 通过对 ped-
er in 与海绵次生代谢产物, 如 onnamide A 和 mycalam ide A
的研究,可能会进一步阐明陆地无脊椎动物与海绵动物之间
的亲源进化关系。鉴于仍有大量的合成基因未从宏基因文
库中找到,未来研究的一个重要目标就是进一步发展更为快
捷的方法,以便可从复杂的基因文库中对目标基因进行快速
克隆。
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