全 文 ：芦荟大黄素对白细胞介素
2 引起大鼠 T细胞增殖
和细胞内 Ca2+ 浓度变化的影响
李
新, 温寅飞,满
媛,胡
芬, 王新宇,李俊英*
收稿日期: 2010
02
01
作者简介:李
新( 1983  ) ,男,天津市人,硕士研究生,研究方向为生物物理学。
* 通讯作者
李俊英
T el: ( 022) 23508390
E
mail: jyli04@ nankai. edu. cn
(南开大学物理学院 生物物理系 生物活性材料教育部重点实验室, 天津
300071)
摘
要:目的
研究芦荟大黄素对白细胞介素
2 ( IL
2) 引起的 T 淋巴细胞增殖和细胞内 Ca2+ 浓度 ( [ Ca2+ ] i ) 变
化的影响,探讨芦荟大黄素对淋巴细胞增殖的作用和机制。方法
采用 MTT 法检测细胞增殖, 用单细胞钙成像
系统记录细胞胞浆[ Ca2+ ] i。结果
芦荟大黄素对 IL
2 引起的 T 细胞增殖有显著抑制作用,且抑制效果与剂量有
关; IL
2 引起[ Ca2+ ] i升高,并持续维持高 [ Ca2+ ] i水平, 引起 [ Ca2+ ] i升高的机制包括胞内 Ca2+ 释放和胞外 Ca2+
内流;芦荟大黄素显著抑制 IL
2 引起的 [ Ca2+ ] i升高, 作用途径包括抑制胞内 Ca2+ 释放和胞外 Ca2+ 内流。结论
芦荟大黄素对 IL
2 诱发的 T 细胞增殖有显著的抑制作用,其作用机制可能与抑制细胞内 [ Ca2+ ] i升高相关。
关键词:芦荟大黄素; T 淋巴细胞; 增殖; [ Ca2+ ] i
中图分类号: R285 5


文献标识码: A


文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2027 04


T 淋巴细胞活化和增殖是机体重要的免疫反
应,研究表明细胞内游离 Ca2+ 浓度 ( [ Ca2+ ] i ) 的升
高在 T 细胞增殖过程中起重要作用,升高 [ Ca2+ ] i
可使钙调素 ( CaM ) 和蛋白激酶 C ( PKC) 等活化,
继而激活 NFAT 等转录因子, 引起细胞增殖 [ 1
4]。
抑制细胞 [ Ca2+ ] i升高可抑制 T 细胞的增殖[ 5]。在
体内,白细胞介素
2 ( IL
2) 是引起 T 淋巴细胞增
殖的关键细胞因子, IL
2 与 T 细胞膜上的 IL
2 受
体结合, 通过激活 ST AT5 信号通路引发细胞增
殖[ 6] , 但 IL
2引起 T 细胞增殖是否涉及[ Ca2+ ] i的
变化,目前尚未见报道。
大黄有抗炎、抑菌、保肝等多种作用, 芦荟大黄
素 ( aloe
emodin) 是大黄中的游离型单蒽醌类有效
成分之一,此类化合物有调节机体免疫、抗炎、抗肿
瘤等多种生物活性, 其作用机制与调节细胞
[ Ca
2+
] i变化相关 [ 7
8] 。前期研究表明, 芦荟大黄素
对植物血凝素 ( PHA) 诱发的 T 细胞增殖和细胞
[ Ca
2+
] i变化均有抑制作用 [ 9]。由于 IL
2 是生理条
件下引起 T 细胞增殖的关键因素, 为进一步探讨芦
荟大黄素对免疫系统的作用和机制,本实验检测了
芦荟大黄素对 IL
2 诱导的大鼠脾 T 淋巴细胞增殖
和细胞[ Ca2+ ] i变化的影响。
1
材料与方法
11
动物: Wistar 大鼠, 体质量 160~ 180 g, 雌雄兼
用,由中国医学科学院放射医学研究所提供(二级)。
1 2
药品与试剂: M TT、Fura
2/ AM、HEPES、
SDS、含酚红 RPM I 1640 培养基, 购自美国 Sigma
公司; L
谷氨酰胺购于美国 Gibcol 公司; IL
2 购自
北京双鹭公司;芦荟大黄素由天津药物研究院提供,
质量分数 98%; 环胞霉素 A ( cyclo sporin A) 购自
Ruibio 公司,其他试剂为国产分析纯。
1 3
T 淋巴细胞的制备: T 淋巴细胞的制备参照文
献方法[ 10] 。将大鼠脱颈处死后, 无菌条件下立即解
剖取出脾脏, 置于 PBS 溶液中,切碎后匀浆, 将匀浆
液 1 000 r/ min 离心 10 m in,弃上清,加入红细胞裂
解液 ( NH 4Cl 140 mmol/ L, T ris 21 mmol/ L ) , 放
置 10 min,以去除红细胞,然后于 1 000 r/ min 离心
10 m in,弃去上清,将沉淀悬浮于含 10% 小牛血清
的 RPM I 1640 培养液中。将细胞悬液通过尼龙毛
柱,分离出 T 淋巴细胞,加入 PBS 液, 1 000 r/ min
离心 10 min, 弃上清, 重复 3 次以充分洗涤 T 淋巴
细胞,加入 RPMI 1640 培养液配成细胞悬液待用。
1 4
T 淋巴细胞增殖检测: 采用 MT T 比色法检
测。将 T 淋巴细胞悬液调到浓度为 1 105 / mL,按
每孔 100
L 加入到 96 孔平底培养板中, 每组设 5
个复孔。实验分组为: 不加任何药物的对照组; 单独
IL
2 ( 250 U / mL) 处理组; 1、10、100
mol/ L 芦荟
大黄素与 IL
2 ( 250 U / mL) 共处理组; 1、5
mo l/ L
环胞霉素 A 与 IL
2 ( 250 U / mL) 共处理组; 按以
上分组每孔中加入药物后,将 96孔板置于 5% CO2
的培养箱中 37 ! 培养 72 h, 终止培养前 4 h 每孔
加入 5 mg/ mL MTT 溶液 20
L。培养结束后每孔
∀2027∀中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
加入 100
L SDS
DMF 溶解液 (含 10% SDS、50%
DMF, pH 2. 0) 过夜,然后在酶联仪上测定各孔 570
nm 处的吸光度 ( A ) 值。
1 5
细胞胞浆内的[ Ca2 + ] i变化检测: 将盖玻片放
入 6孔板中,每孔加入 50
g/ mL 多聚赖氨酸液 50

L, 使其均匀包被盖玻片。然后将 2 105 / mL 的
T 淋巴细胞悬液每孔 2 mL 培养于包被后的盖玻片
上,待细胞贴壁后, 每孔加入 2 mL 含 Fura
2/ AM
( 1
g / mL ) 的 HBSS 溶液 ( NaCl 110 mmol/ L ,
KCl 5. 4 mmol/ L , Na2HPO4 0. 15 mmol/ L ,
KH2 PO 4 0. 4 mo l/ L , M gSO4 ∀ 7H 2O 0. 8 mmol/ L ,
CaCl2 1. 3 mmo l/ L , NaHCO 3 4. 2 mmol/ L, 葡萄
糖∀ H 2O 5. 5 mmol/ L, HEPES 15 mmol/ L , pH
7. 2~ 7. 4) ,避光室温下放置 50 min 进行负载。负
载后用 HBSS 洗涤 3 次, 去掉细胞外的 Fur a
2/
AM,每孔中加入 2 mL HBSS 液待测。细胞外无钙
的条件下用不含 Ca2+ 的 HBSS 洗 3 次, 培养于含
有 5 mmo l/ L EGT A 的无钙 HBSS 中。将负载好
的细胞放于倒置显微镜上, 用单细胞钙离子成像分
析系统检测细胞[ Ca2+ ] i变化。由 CCD (型号: 480
TVL Co lour Dig ital CCD) 实时拍摄细胞内荧光强
度动态变化, 并用 Matefluor 分析软件 (美国通用
公司) 进行实时采集和分析。先分别用 1、10、100

mol/ L 芦荟大黄素处理细胞 5 min, 然后再加入
250 U/ mL IL
2, 以 Fura
2/ AM 作为探针, 分别测
定 340 nm 和 380 nm 激发下的荧光强度 F340和
F380 ,其比值 ( F340 / F380 ) 表征细胞 [ Ca2+ ] i变化。
1 6
数据处理:细胞增殖为相同条件下 3 次实验,
每次取 5个孔数据的平均值。检测单细胞[ Ca2+ ] i
的实验中,每个实验条件均做 3 次取自不同动物的
细胞检测, 检测 10 个左右细胞进行结果统计, 选取
一例作为代表性结果示于图中。实验结果用 x # s
表示,组间比较采用 t 检验。
2
结果
2 1
芦荟大黄素对 IL
2 引起 T 淋巴细胞增殖的
影响:在分离的 T 淋巴细胞培养液中加入 250 U /
mL IL
2,培养 72 h 后用 MT T 法检测存活细胞数
量,与不加 IL
2 的对照组进行比较, 结果显示 IL
2
处理组的 A 值显著高于对照组 (图 1) , 表明 250
U/ mL IL
2 可显著引起大鼠 T 淋巴细胞增殖。去
除细胞培养液中的 Ca2+ , 在此条件下加入 IL
2 不
能引起细胞增殖,说明细胞培养液中的 Ca2+ 是细胞
增殖的必要条件。
在细胞培养液中同时加入 IL
2 ( 250 U/ mL)
和不同浓度的芦荟大黄素, 培养 72 h 后检测细胞增
殖情况, 结果表明, 在芦荟大黄素存在的条件下,
IL
2 诱发 T 细胞增殖的作用明显下降, 与单独
IL
2 组相比, 芦荟大黄素 1、10、100
mo l/ L 分别使
A 值下降了 31%、39%、68%,前期研究结果表明用
单独的芦荟大黄素处理 T 细胞后,细胞数目无显著
变化[ 9] ,所以本实验结果表明芦荟大黄对 IL
2 引起
的淋巴细胞增殖有显著抑制作用, 且其抑制效果与
药物剂量相关。环胞霉素 A 是已知的抑制细胞增
殖的药物, 以此作为阳性对照药物, 在本实验条件
下,环胞霉素 A 显著抑制了 IL
2诱发的细胞增殖。
与对照组比较: ∃P < 005;
与 IL
2 组比较: * P< 0 05
∃P < 0 05 v s cont rol group;
* P< 0 05 v s IL
2 alone gr ou p
图 1
芦荟大黄素对 IL
2 引起的 T 淋巴细胞增殖的影响
(x # s, n= 15)
Fig. 1
Ef fects of aloe
emodin on IL
2
induced T
lymphocytes proliferation ( x# s, n= 15)
2 2
IL
2 对 T 淋巴细胞[ Ca2+ ] i的影响:在正常细
胞外液条件下加入 250 U/ mL IL
2, 250~ 300 s 后
T 细胞[ Ca2+ ] i迅速升高,并持续维持细胞内高浓度
Ca2+ 的状态, 形成平台。统计结果显示, IL
2 可使
细胞[ Ca2+ ] i升高至基础值的 2 8 倍。为研究 IL
2
引起的 Ca2+ 升高的来源, 去除细胞外 Ca2+ , 在此条
件下 IL
2 仍可引起[ Ca2+ ] i升高, 但升高的程度显
∀2028∀ 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
著低于正常条件。比较正常和无 Ca2+ 情况下的
IL
2 引起的 [ Ca2+ ] i变化, 说明 IL
2 引起细胞
[ Ca2+ ] i升高的途径包括胞内 Ca2+ 释放和胞外
Ca2+ 内流两种机制,结果见图 2。
a
正常培养液
b
无 Ca2+ 培养液
c
对照
与 a 比较: * P < 0 05 ( n= 10)
a
normal H BSS solut ion
b
Ca2+
f ree H BSS solut ion
c
cont rol
* P< 0 05 v s a ( n= 10)
图 2
IL
2 引起 T淋巴细胞[Ca2+ ] i的变化
Fig. 2
IL
2
induced [ Ca2+ ] i change in T lymphocytes
2 3
芦荟大黄素对 T 淋巴细胞[ Ca2+ ] i变化的影
响:为研究芦荟大黄素抑制 T 细胞增殖与调节淋巴
细胞内[ Ca2+ ] i变化的关系,检测了药物对 IL
2 引
发的淋巴细胞[ Ca2+ ] i升高的影响。在正常细胞外
液的条件下,先加入不同浓度的芦荟大黄素处理细
胞 5 m in,然后再加入 IL
2, 在此条件下 IL
2 引起
的[ Ca2+ ] i升高显著降低或消失 (图 3)。统计加入
IL
2后 300 s 时细胞[ Ca2+ ] i的值,并与不加芦荟大
黄素的比较,结果表明, 1
mol/ L 芦荟大黄素组的
[ Ca
2+
] i升高程度为对照组的 70% , 100
mo l/ L 芦
荟大黄素则完全抑制了 IL
2 引起的 [ Ca2+ ] i升高。
前期研究结果显示,芦荟大黄素本身不会引起细胞
[ Ca
2+
] i变化[ 9] , 因此以上结果表明芦荟大黄素对
IL
2引起的[ Ca2+ ] i升高有抑制作用,并且药物的作
用与剂量有关。


为研究芦荟大黄素对 IL
2 引起的细胞内 Ca2+
释放的影响, 去除细胞外液中的 Ca2+ , 并加入
EGT A,在此条件下检测芦荟大黄素对 250 U / mL
IL
2 诱发 [ Ca2+ ] i 升高的影响。如图 4 所示,
1
mol/ L 的芦荟大黄素使 IL
2 引起的 [ Ca2+ ] i升
高显著下降, 10、100
mol/ L 的芦荟大黄素则能完
全抑制 IL
2 引起的[ Ca2+ ] i升高。因为在胞外无钙
的条件下, IL
2 引起的[ Ca2+ ] i升高是由胞内钙释放
所致,以上结果表明芦荟大黄素能够阻断 IL
2引起
的胞内钙释放。
3
讨论


IL
2是引起 T 淋巴细胞增殖的关键细胞因子,
T 细胞被有丝分裂原活化后首先合成 IL
2, IL
2 通
与对照组比较: * P< 0 05 ( n= 10) ,图 4同
* P < 0 05 vs cont rol group ( n= 10) , Fig. 4 is sam e
图 3
芦荟大黄素对 IL
2 引起的 T淋巴细胞
[ Ca2+ ] i升高的影响
Fig. 3
Effect of aloe
emodin on IL
2
induced
Ca2+ mobilization of T lymphocytes
图 4
无钙条件下芦荟大黄素对 IL
2 引起的 T 淋巴细胞
[Ca2+ ] i升高的影响
Fig. 4
Effect of aloe
emodin on IL
2
induced Ca2+ mobi

lization of T lymphocytes in Ca2+
free solution
过自分泌的方式排出到细胞外后与 T 细胞膜上的
IL
2 受体结合, 通过活化 JAK 激酶, 激活 STAT 5
信号通路, 继而引起 c
myc、c
fo s 等与细胞周期相
关基因的转录上调,引发细胞增殖。除了上述的信
号通路外,另有文献报道 p38/ MA PK、PI3K 等也参
与 IL
2 的信号转导过程[ 6, 11
12] 。细胞内游离 Ca2+
是重要的第二信使, 在淋巴细胞活化与增殖中起重
要作用[ 1
2] 。本实验结果显示, IL
2 能够引起细胞
[ Ca2+ ] i升高, 其途径包括胞内 Ca2+ 释放和胞外
Ca2+ 内流两种机制, 而对于 T 细胞增殖, 在正常培
养液条件下 (有细胞外 Ca2+ ) , IL
2 可以引起细胞
增殖,去除细胞培养液的 Ca2+ , IL
2 则不能引起细
胞增殖,对比 IL
2 引起细胞增殖和细胞[ Ca2+ ] i变
化的结果, 说明 Ca2+ 内流, 而不是 Ca2+ 释放, 在
IL
2 引起细胞增殖中起关键作用。
芦荟大黄素属于大黄蒽醌类化合物, 该类化合
物有抗炎和调节免疫的作用。曾报道过芦荟大黄素
对植物血凝素 ( PHA ) 引起的 T 细胞增殖有抑制
作用[ 9] ,本研究结果表明,芦荟大黄素对于生理性 T
∀2029∀中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
细胞增殖因素 IL
2 诱发的细胞增殖同样有显著的
抑制作用。虽然芦荟大黄素对 IL
2 引起胞内 Ca2+
释放和胞外 Ca2+ 内流均有抑制作用,但由于单纯内
Ca
2+ 释放不能引起细胞增殖, 而 Ca2+ 内流在 IL
2
引起细胞增殖中起关键作用, 所以推测芦荟大黄素
抑制 IL
2 引起细胞增殖与其抑制 IL
2 引起的胞外
Ca
2+ 内流有关。Kuo 等 [ 13]报道过大黄素对 T 淋巴
细胞增殖的影响,发现大黄素对 T 淋巴细胞的增殖
有抑制作用,其作用机制与降低细胞[ Ca2+ ] i升高有
关,这与本研究结果有一定的相似性,提示这一类药
物可能有相似的作用机制。
关于 PHA 引起胞内 Ca2+ 升高的机制已经有
较清楚的认识, PHA 结合于 T 细胞受体后激活 G
蛋白偶联的磷酸肌醇通路, 引起胞内钙库释放
Ca2+ ,使[ Ca2+ ] i升高, Ca2+ 释放继而引起 T 细胞膜
上 CRAC 通道开放,胞外 Ca2+ 流入,导致[ Ca2+ ] i进
一步升高 [ 14]。本研究结果表明 IL
2 引起的 Ca2+
升高由胞内 Ca2+ 释放和胞外 Ca2+ 内流组成, 这一
点与 PHA 相似, 但 IL
2引起的胞内[ Ca2+ ] i升高发
生在加入 IL
2 约 250~ 300 s 后, 这与 PHA 不同,
提示 IL
2 引起 [ Ca2+ ] i升高的作用过程可能与
PHA 有差别,推测 IL
2 受体活化后可能需要通过
细胞内一系列信号转导过程引起 IP3 产生,最终引
起[ Ca2+ ] i升高,该过程的详细机制还需要进一步的
实验研究。芦荟大黄素对 IL
2 引起的胞内 Ca2+ 释
放和胞外 Ca2+ 内流均有抑制作用,但药物作用具体
的靶点和分子机制有待深入研究。
参考文献:
[ 1]
L ew is R S Calcium signaling m echan isms in T lymphocytes
[ J ] A nnu Re v I mmunol , 2001, 19( 1) : 497
521
[ 2]
Gy
rgy P, Zol t
n V, Rez s
G Ionchan nels and lymph ocyte
act ivation [ J] I mmunol L e tt , 2004, 92( 1) : 55
66
[ 3]
Dolm etsch R E, Lew is R S, Goodnow C C, e t al . Dif feren

t ial act ivat ion of t ran script ion factors indu ced by Ca2+ re

sponse am plitude and durat ion [ J] Na tur e, 1997, 386
( 6627) : 855
858
[ 4]
Win slow M M, Neilson J R, Crab tr ee G R, et al . Calcium
signaling in lymphocytes [ J] Cur r Op in I mmunol , 2003, 15
( 3) : 299
307
[ 5]
Zit t C, S t raus s B, Schwarz E C, et a l . Potent inh ibit ion of
Ca2+ r eleas e
activated Ca2+ channels an d T
lymph ocyte acti

vat ion by th e pyraz ole derivat ive BTP2 [ J] J Biol Chem ,
2004, 279( 13) : 12427
12437
[ 6]
Kovanen P E, Leonard W J Cytokines and immun odeficien

cy disease: crit ical roles of th ec
dependen t cytokines inter

leu kins 2, 4, 7, 9, 15 an d 21, and their signaling pathw ays
[ J] I mmunol Re v , 2004, 202: 67
83
[ 7]
李淑娟, 董晓华, 武海霞, 等 大黄及其有效成分药理作用
研究进展 [ J ] 医学综述, 2005, 11( 1) : 76
78
[ 8]
王
辉, 董志勇, 余
奕, 等  大黄素影响巨噬细胞升高
[ Ca2+ ] i和释放 T NF
的作用特征 [ J ] 生物物理学报,
2002, 18( 3) : 345
349
[ 9]
李臣宇, 李
新, 刘丽军, 等 芦荟大黄素对 T 淋巴细胞增
殖和细胞[ Ca2+ ] i变化的影响 [ J] 中草药, 2008, 39 ( 8 ) :
876
880
[ 10]
薛庆善 体外培养的原理与技术 [ M ] 北京: 科学出版
社, 2001
[ 11]
Gaf fen S L, Liu K D Overview of interleuk in
2 function ,
product ion and clin ical appl ication s [ J] Cytokin, 2004, 28:
109
123
[ 12]
Wan Y Y, Flavell R A The roles for cytokin es in th e gen e

ration and maintenan ce of regulatory of T cells [ J] I mmunol
Re v, 2006, 211: 114
130
[ 13]
Kuo Y C, Meng H C, T sai W J Regulation of cell pr ol ifera

t ion inf lammatory cytokin e produ ct ion and calcium mobil iza

t ion in primary human T lymphocytes by emodin f rom Poly

g onum hy p oleucum Ohw i [ J ] I nf lam R es, 2001, 50 ( 1 ) :
73
82
[ 14]
Kottu ri M F, H un t S V, J ef feries W A Roles of CRAC and
CaV
like channels in T cells : more than on e gatekeeper [ J ]
T rend s Phar macol S ci , 2006, 27( 7) : 360
367
六味地黄方及其配伍对血小板聚集的影响
赵
越,叶宏军,余
黎, 卞慧敏*
收稿日期: 2010
02
11
基金项目:江苏省中医药局科技项目 ( LZ09002) ; 康缘中医药科技创新基金 ( HZ0814KY)
作者简介:赵
越( 1986  ) ,男,黑龙江省哈尔滨市人,硕士研究生,主要从事中药心血管药理研究。
T el : 15996254322
E
mai l: h ope. zy@ 163. com
* 通讯作者
卞慧敏
E
mail: hmbian@ sina. com
(南京中医药大学药学院 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京
210029)
摘
要:目的
研究六味地黄方及其配伍对血小板聚集率的影响。方法
以比浊法测定六味地黄方及其配伍对二
磷酸腺苷 ( ADP)、血小板活化因子 ( PAF )、花生四烯酸 ( AA ) 诱导的家兔体外血小板聚集率的影响, 运用荧光法
∀2030∀ 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 12 期 2010 年 12月