全 文 ：HPLC法同时测定附子中 6 种单酯和双酯型生物碱
孙 　兰1 ,周海燕1 ,2 ,赵润怀2 ,游 　畅1 ,高 　超1 ,常 　琪1
①
(1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所 ,北京 　100094 ;21 中国药材集团公司 ,北京 　102600)
摘　要 :目的 　建立附子中单酯及双酯型生物碱成分的高效液相色谱定量方法。方法 　附子干燥粉末用氨水浸润
后 ,以异丙醇2醋酸乙酯 (1 ∶1)超声提取 30 min ,提取液蒸干后溶于 0101 %盐酸甲醇中 ,经微孔滤膜滤过后 ,20μL
进行 HPLC 分析。HPLC 分析采用 Zorbax Extend2C18柱 (250 mm ×416 mm ,5μm) ,以乙腈240 mmol/ L 醋酸铵缓
冲液 (氨水调 p H 1010)为流动相进行梯度洗脱 ,体积流量 110 mL/ min ,检测波长 230 nm。结果 　6 种被测生物碱
成分 ,包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱分离良好 ,各成
分质量浓度与峰面积在测定范围内均呈良好的线性关系 ( r > 01999) ,重现性好 ,6 种成分的 RSD ( n = 5) 均小于
1150 % ;平均加样回收率 ( n = 5) 为 98120 %～100147 % ;最低检测限分别为 0126、0136、0192、0130、0152、0182 ng。
结论 　本研究所建立的 HPLC 方法稳定可靠、简便易行 ,可用于附子类药材中单酯型和双酯型生物碱的同时定量
分析 ,为附子药材及其炮制品的质量评价和质量控制奠定了基础。
关键词 :附子 ;乌头碱 ;次乌头碱 ;新乌头碱 ;苯甲酰乌头原碱 ;苯甲酰次乌头原碱 ;苯甲酰新乌头原碱 ; HPLC
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120131204
Determination of six kinds of monoester2 and diester2alkaloids
in Ra dix Aconitii L ateralis Praepa rata hy HPLC
SUN Lan1 , ZHOU Hai2yan1 ,2 , ZHAO Run2huai2 , YOU Chang1 , GAO Chao1 , CHAN G Qi1
(11 Institute of Medicinal Plant Development , Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College , Beijing
100094 , China ; 21 China National Group Corporation of Traditional and Herbal Medicine , Beijing 102600 , China)
Abstract : Objective 　To establish an H PL C met hod for simultaneous determination of monoester2and
diester aconitium alkaloids , including aconitine , hypaconitine , mesaconitine , benzoylaconine , benzoylhyp2
aconine , and benzoylmesaconin in Chinese materia medica , R adi x A coni t i i L ateral is Prae p arat a1 Methods
　The powdered R a di x A coni t i i L ateral is Prae p asat a material was alkalized by adding aqueous ammonia ,
and t hen ext racted wit h a mixt ure solvent of isop ropanol2ethyl acetate (1 ∶1) by ult rasonic ext raction for
30 min1 The ext ract solution was concent rated to dryness and reconstit uted in met hanol containing 0101 %
hydrochloride acid1 After filt ration , t he sample solution was analyzed by H PL C1 The assay was performed
on a Zorbax Extend2C18 column (250 mm ×416 mm , 5μm) , eluted wit h a mobile p hase consisted of aceto2
nit rile and 40 mmol/ L ammonium acetate (p H value 1010 , adjusted wit h aqueous ammonia) and gradient
elution at a flow rate of 1 mL/ min1 The eluent was monitored by a UV detector at 250 nm1 Results 　Ex2
cellent chromatograp hic separation was achieved for six studied alkaloids wit h good linearity ( r > 01999)
over t he st udied concent ration ranges1 RSD ( n = 5) were less than 1150 % and ext raction recovery ( n = 5)
were ranged f rom 98120 % to 100147 % for the six st udied alkaloids1 The limit s of detection were 0126 ,
0136 , 0192 , 0130 , 0152 , and 0182 ng , respectively1 Conclusion 　The H PL C met hod developed for simul2
taneous determination of monoester2and diester2aconit um alkaloids is simple and valid1 It can be used for
quality evaluation and quality cont rol of R a di x A coni t i i L ateral is Prae p arat a and it s p rocessing product s1
Key words : R a di x A coni t i i L ateral is Prae p arat a ; aconitine ; hypaconitine ; mesaconitine ; benzoylaco2
nine ; benzoylhypaconine ; benzoylmesaconine ; H PL C
·131·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008204215
基金项目 :国家科技支撑计划项目 (2006BAI09B0522)
作者简介 :孙　兰 (1961 —) ,女 ,副主任技师 ,主要从事天然药物化学研究和中草药成分分析。
E2mail :lsun @implad. ac. cn 　Tel : (010) 628997283 通讯作者　常　琪　Tel : (010) 62829823 　E2mail :qchang @implad. ac. cn
　　附子来源于毛茛科植物乌头 A conit um car2
michael i Debx1 的子根 ,具有回阳救逆、补火助阳、
逐风寒湿邪的功效[1 ] ,为最具特色的临床治疗阳虚
里寒证的首选药物。附子属于毒性药材 ,其中所含
的主要有效成分为剧毒的双酯型乌头生物碱 ,如乌
头碱 (aconitine) 、次乌头碱 ( hypaconitine) 、中乌头
碱 (mesaconitine) 。附子在炮制加工过程中 ,其双酯
型生物碱会水解去掉一个酯基 ,转化成单酯型乌头
生物碱 ,如苯甲酰乌头原碱 ( benzoylaconine) 、苯甲
酰次乌头原碱 (benzoylhypaconine)和苯甲酰新乌头
原碱 (benzoylmesaconine) ,或继续水解去掉两个酰
基转化为乌头原碱 (aconine) 。炮制水解使得附子
的毒性大大降低 ,但其药理活性亦随之减弱或消
失[2 ] 。这就要求建立能够同时兼顾附子安全性和有
效性的科学、量化的质量控制标准。由于附子产区
分布广泛 ,原药材规格及炮制工艺变化很大 ,因此附
子的质量参差不齐。2005 年版《中国药典》采用薄
层色谱法仅对附子中的乌头碱做了限量检查[ 1 ] ,这
不能全面准确地反映附子药材中药效成分的概况。
本实验首次建立了可同时检测双酯型和单酯型 6 种
主要乌头生物碱成分 ,包括乌头碱、次乌头碱、中乌
头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰
新乌头原碱的 H PL C 测定方法 ,为附子药材及其炮
制品中有效的毒性成分的限量制定提供参考。
1 　仪器与试药
高效液相色谱仪为 Waters 高效液相色谱系统 ,
包括 600 型泵 ;486 型紫外检测器 ;717 型自动进样
器和 Empower 色谱工作站。柱温由 CBL 100 型柱
温箱控制。精密天平为 Mettler Toledo XS105。
乌头碱 (批号 1107202200410) 、次乌头碱 (批号
1107982200404) 、中乌头碱 (批号 1107992200404)均为
定量测定用 ,购自中国药品生物制品检定所。苯甲酰
乌头原碱 (质量分数 > 98 % ,批号 44622420) 、苯甲酰
次乌头原碱 (质量分数 > 95 % ,批号 6323826624) 、苯
甲酰新乌头原碱 (质量分数 > 98 % ,批号 6323826725)
购自香港赛马会中药研究所。附子生药材 2007 年采
自四川的布托、江油、安县、南郑和固城 ,并经中国药
材集团公司赵润怀主任中药师鉴定。附子炮制品由
中国药材集团公司科技研发部制备。色谱纯乙腈和
甲醇均为 Merck 产品 ;分析纯盐酸、乙酸铵和氨水为
北京化工厂产品。水为去离子重蒸水。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 :色谱柱为 Agilent Zorbax Extend2C18
(250 mm ×416 mm , 5μm) ,柱温 25 ℃;流动相为 A
和B 两相梯度洗脱 ,A :乙腈 ,B :40 mmol/ L 乙酸铵缓
冲液 (氨水调 p H 1010) ;洗脱程序 :0～10 min ,A 为
28 %;10～15 min ,A 为 28 %～33 %;15～45 min ,A 为
33 %～50 %;45～60 min ,A 为 50 %。体积流量 110
mL/ min。检测波长 230 nm ,进样量均为 20μL。
212 　供试品溶液制备 :精密称取过 60 目筛的附子
生药材细粉约 2 g ,平行称 3 份 ,分别置于 200 mL
三角瓶中 ,各加 25 %氨水 2 mL ,润湿 30 min。精密
量取萃取溶剂异丙醇2醋酸乙酯 (1 ∶1) 混合液 100
mL ,加至含样品的三角瓶中并称定质量。超声 30
min 后 ,将此样品瓶放置至室温 ,再称质量 ,用萃取
溶剂补足失去的质量 ,混匀后滤过。精密量取续滤
液 40 mL ,浓缩至小体积 ,再将其用萃取溶剂完全转
移至一蒸发皿上蒸干。残渣用 0101 %盐酸2甲醇溶
解并定容于 2 mL 量瓶中 ,摇匀 ,0145μm 微孔滤膜
滤过 ,得供试品溶液。
213 　对照品液制备 :精密称取乌头碱、次乌头碱、中
乌头碱对照品 2102、7121、5111 mg 置同一 10 mL
量瓶内 ,用 0101 %盐酸甲醇溶液溶解并定容至刻
度 ,摇匀 ,得质量浓度分别为 01202、01721、01511
mg/ mL 双酯型生物碱对照品液。
精密称取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、
苯甲酰新乌头原碱 1102、1112、1131 mg 各置于 1
mL 量瓶内 ,用 0101 %盐酸甲醇溶液溶解并定容至
刻度 ,摇匀 ,得质量浓度分别为 1102、1112、1131
mg/ mL 的 3 个单酯型生物碱的对照品液。
214 　标准曲线制备 :精密吸取双酯型生物碱液 5
mL ,置于 10 mL 量瓶中 ,加 0101 %盐酸甲醇溶液至
刻度 ,摇匀 ,并将此溶液逐级稀释共配制 10 份不同
质量浓度的对照品溶液。分别精密吸取 3 个单酯型
生物碱储备液 0110、0115、0140 mL ,置于同一 1 mL
量瓶中 ,加 0101 %盐酸甲醇溶液至刻度 ,摇匀 ,并将
此溶液逐级稀释成 7 个不同质量浓度的对照品溶
液。按上述色谱条件进行分析 ,以峰面积 ( Y) 对进
样量 ( X)进行回归计算 ,回归方程见表 1。
215 　精密度试验 :将 214 项下的含适宜浓度的双酯
型生物碱对照品溶液和单酯型生物碱对照品溶液 ,
按上述色谱条件分别连续进样测定 5 次 ,记录各自
的峰面积 ,并计算其 RSD 值。结果显示 ,乌头碱、次
乌头碱、中乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头
原碱、苯甲酰新乌头原碱的 RSD 分别为 0176 %、
0186 %、0195 %、0120 %、0129 %、0179 %。
216 　重现性试验 :精密称取附子生药材细粉约 2 g
共 5 份 ,按 212 项下方法制备供试品溶液 ,按上述色
·231· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
表 1 　被测生物碱的线性范围和线性关系
Table 1 　Linear ranges and correlation
of studied alkaloids
成 　分 线性范围/μg 线性方程 r
乌头碱 0. 004～0. 404 Y = 1. 52 ×106 X + 3. 36 ×103 0. 999 98
0. 081～6. 466 Y = 1. 50 ×106 X + 2. 03 ×104 0. 999 94
次乌头碱 0. 014～1. 442 Y = 1. 45 ×106 X + 1. 35 ×104 0. 999 95
0. 288～23. 072 Y = 1. 42 ×106 X + 6. 97 ×104 0. 999 96
中乌头碱 0. 010～1. 022 Y = 1. 40 ×106 X + 1. 06 ×103 0. 999 99
0. 204～16. 352 Y = 1. 36 ×106 X + 6. 23 ×104 0. 999 96
苯甲酰乌头原碱 0. 002～1. 224 Y = 1. 13 ×106 X + 8. 20 ×103 0. 999 98
0. 204～2. 050 Y = 1. 08 ×106 X + 6. 43 ×104 0. 999 44
苯甲酰次乌头原碱 0. 011～1. 120 Y = 1. 02 ×106 X - 7. 64 ×103 0. 999 33
0. 224～3. 360 Y = 1. 02 ×106 X - 1. 46 ×104 0. 999 90
苯甲酰新乌头原碱 0. 105～2. 620 Y = 1. 13 ×106 X + 1. 72 ×104 0. 999 45
0. 524～10. 480 Y = 1. 10 ×106 X + 2. 39 ×104 0. 999 99
谱条件进行 H PL C 分析。根据所得 6 种生物碱的
峰面积并计算其在样品中的量 ,结果乌头碱、次乌头
碱、中乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、
苯甲酰新乌头原碱质量分数的 RSD 分别为
0147 %、0186 %、0136 %、0135 %、0156 %、1148 %。
217 　稳定性试验 :取同一附子生药材供试品溶液 ,
室温放置 0、2、4、6、8、10、12、24、36 h 后 ,按上述色
谱条件进行 HPL C 分析 ,测定 6 种生物碱的量。乌
头碱、次乌头碱、中乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰
次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱在不同时间量的
RSD 分 别 为 0139 %、0127 %、0135 %、0171 %、
0182 %和 0129 %。 218 　加样回收率试验 :精密称取附子生药材细粉 1g 共 30 份 ,每 5 份用于一种生物碱的回收率测定 ,共 6 组。每一组样品分别加入同一种对照品溶液适量 ,按 212 项下方法进行供试品溶液的制备和HPL C 分析。根据测得量和加入量计算其回收率。乌头碱、次乌头碱、中乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的平均加样回收率 ( RSD ) 分 别 为 98167 % ( 1115 %) 、100147 %(2155 %) 、98120 % ( 2140 %) 、100135 % ( 0196 %) 、100127 %(1156 %)和 98147 %(1115 %) 。219 　最低检测限 :将对照品溶液以 0101 %盐酸甲醇溶液不断稀释并进行 HPL C 分析。当信噪比为 3倍时的进样量即为最低检测量。本色谱条件下 ,乌头碱、次乌头碱、中乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的最低检测限分别为 0126、0136、0192、0130、0152、0182 ng。2110 　样品测定 :取不同产地的附子生药材或其炮制品适量 ,粉碎成细粉 ,过 60 目筛。精密称取各样品约 2 g ,每个样品平行称 3 份 ,按 212 项下方法制备供试品溶液 ,并按上述色谱条件进行 6 种生物碱的分析 ,用当天随行的供试品溶液进行计算 ,结果见表 2 ,对照品及供试品图谱见图 1。
表 2 　附子样品中 6 种被测生物碱的量( n = 3)
Table 2 　Contents of six studied alkaloids in Radix Aconitii L ateralis Praepa rata ( n = 3)
附子药材 (来源)
质量分数/ (μg ·g - 1)
乌头碱 次乌头碱 中乌头碱
苯甲酰
乌头原碱
苯甲酰
次乌头原碱
苯甲酰
新乌头原碱
生药材 (布拖) 　278. 13 　694. 46 　1 040. 88 　9. 75 　6. 96 　72. 75
生药材 (江油) 131. 83 287. 56 150. 58 1. 54 17. 67 61. 58
生药材 (安县) 125. 13 2 422. 29 170. 75 2. 17 8. 63 105. 96
生药材 (南郑) 204. 21 1 132. 83 494. 63 11. 92 16. 83 55. 67
生药材 (城固) 232. 96 1 869. 58 116. 54 4. 50 21. 83 295. 92
黑顺片 (江油) 1. 54 51. 96 0. 479 14. 83 31. 79 75. 63
黑顺片炮制过程 (煮前) 6. 33 191. 42 135. 50 1. 96 4. 00 15. 79
黑顺片炮制过程 (煮后) 1. 50 126. 29 47. 00 5. 25 14. 21 53. 42
黑顺片炮制过程 (蒸制前) 19. 92 134. 88 64. 00 3. 08 8. 42 30. 83
黑顺片加工过程 (蒸制后) 2. 08 30. 96 0. 63 16. 79 41. 88 89. 42
3 　讨论
311 　目前报道的用于附子中生物碱定量测定的
H PL C 方法大都集中在双酯型生物碱[3～7 ] 上 ,对于
单酯型生物碱测定的报道[8 ,9 ] 很有限。张聿梅等[ 8 ]
除了测定川乌中的 3 个单酯型生物碱 ,还测定了苯
甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱 ,对后两者的
分离度欠佳 ,其中苯甲酰次乌头原碱对照品在流动
相 p H 515～610 时 ,液相色谱中出现 2 个峰 ,刘秀
秀等[ 9 ]测定了附子中的苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新
乌头原碱。本实验建立了同时测定 3 种单酯型和 3
种双酯型乌头生物碱的 HPL C 方法 ,线性范围宽、
稳定性好、重现性高、专属性强、成本低、效率高 ,对
附子药材及其炮制品的质量控制和优化炮制工艺具
有重要的意义。
312 　有关附子中生物碱提取方法的优化已有报
道[4 ,5 ,8 ] 。本实验对所报道的两种常用方法进行了
比较。研究发现用乙醚[4 ,5 ] 作溶剂提取时 ,无论是
采用冷浸法或超声法 ,由于其极易挥发 ,使得测定结
果的重现性差 ,且单酯型生物碱乌头碱、次乌头碱和
中乌头碱的实验结果偏低。用异丙醇2醋酸乙酯
·331·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
12中乌头碱　22乌头碱　32次乌头碱　42苯甲酰新乌头原碱
52苯甲酰乌头原碱　62苯甲酰次乌头原碱
12mesaconitine 　22aconitine 　32hypaconitine 　42benzoylmesaconin
52benzoylaconine 　62benzoylhypaconine
图 1 　乌头生物碱对照品( A、B) 、江油产附子生药材( C)
和黑顺片( D)的 HPLC色谱图
Fig. 1 　HPLC Chromatograms of alkaloids reference sub2
stance ( A and B) , Radix Aconitii L ateralis Pra2
epa rata ( C) , and its processing herbal product
Heishunpian ( D)
(1 ∶1)混合液作溶媒[8 ]提取时 ,杂质干扰少 ,6 种被
测成 分 的 平 均 加 样 回 收 率 介 于 98120 % ～
100147 % , 实验结果 稳 定 , 重 现 性 好 , RSD 在
0135 %～1148 % ,完全能达到定量的要求。该方法
灵敏度高、操作简单、耗时短、方便易行 ,是一种较好
的、值得推广的附子中乌头类生物碱的提取方法。
313 　3 种单酯型生物碱 ,即苯甲酰乌头原碱、苯甲
酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱的化学结构相
似 ,极性相似 ,在色谱柱上的保留时间比较接近。因
此在进行梯度洗脱时 ,在单酯型生物碱出峰的前段 ,
需将梯度变化范围缩小 ,使洗脱时间延长 ,这样方可
使这 3 种成分得到充分分离。
314 　高效液相色谱法测定乌头类生物碱成分多采
用含二乙胺和三乙胺的碱性流动相 ,或酸性乙酸铵
为流动相[8 ] 。这些流动相对同时测定单酯型和双酯
型生物碱不能达到满意的分离效果。本研究比较了
多种流动相 ,最终选定以乙腈2碱性乙酸铵缓冲液
(p H 1010) 为流动相 ,并进行梯度洗脱。同时还比
较了 Alltima C18 ( Altech ) 、Symmert ry C18 ( Wa2
ters) 、Purosp her RP218 ( Merck) 和 Zorbax Extend2
C18 (Agilent) 4 个色谱柱。结果表明 ,附子中的双酯
型及单酯型乌头类生物碱 6 种成分在 Zorbax Ex2
tend2C18色谱柱上柱效较高 ,峰形尖锐 ,对称性好 ,
与其他成分达到了基线分离 ,并可在 65 min 内完成
1 次进样测定。
315 　本研究利用建立的 HPLC方法对来自不同地区
的附子生药材及其炮制品黑顺片 (表 2)进行了 6 种生
物碱的定量测定 ,结果表明在生药材中双酯型生物碱
的量明显高于单酯型生物碱 ,且以次乌头碱的量最
高。在炮制品黑顺片中 ,双酯型生物碱的量明显低于
其在未炮制的生药材中 ,说明其被水解转化为单酯型
生物碱或乌头原碱。研究发现 ,不同产地附子药材及
其炮制品中这 6 种乌头生物碱的量差异很大 ,这就要
求应对附子类药材中的各生物碱进行定量监测 ,以保
证在安全的前提下 ,正确有效地使用这类药材。同
时 ,在炮制过程中 ,可利用此 HPLC 方法对各生物碱
进行动态监控 ,有效地将毒性成分控制在适当范围
内。由于本实验未收集到足够多的不同规格和不同
批次的附子炮制品 ,同时未进行安全性的评价 ,因此
无法制订出双酯型生物碱的上限和下限。此有效毒
性成分的限量还有待进一步的研究。
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