全 文 ：·制剂与质量·
梅花鹿鹿茸中促 PC12 细胞增殖蛋白的分离和活性研究
柯李晶1 ,聂毅磊1 ,叶秀云1 ,霍玉书2 ,饶平凡1 ,周建武1 3
(1. 福州大学生物工程研究所 ,福建 福州 　350002 ; 2.美国德州大学胜安东尼奥健康科学中心 ,德州 7822923900 ,美国)
摘 　要 :目的 　对冻干鹿茸水溶性组分进行分离 ,并考察鹿茸水溶性组分及其分离组分对 PC12 细胞的促增殖活
性。方法 　应用 S2200 分子筛凝胶液相色谱和 DEA E 阴离子交换液相色谱分离鹿茸水溶性组分 ,进行蛋白质 SDS2
PA GE 电泳分析 ,Folin2酚法测定鹿茸样品中的蛋白 ,并用 M TT 法测定 PC12 细胞增殖率。结果 　鹿茸水溶性组
分在 1313 mg/ mL 能促进 PC12 细胞增殖 47 % ( P < 0101) ,其蛋白质量分数为 8412 % ;经分子筛色谱分离的 S2002
P2 组分具显著促 PC12 细胞增殖活性 (4610 % ,9710μg/ mL , P < 0101) ;经离子交换色谱进一步分离的 DEA E2P1
组分在 5110μg/ mL 下的 PC12 细胞的增殖率为 11115 % ( P < 01001) 。DEA E2P1 组分的蛋白主要集中分布于 Mr
56 000 和大于 Mr 100 000 处。结论 　冻干鹿茸的水溶性组分及其液相色谱分离的一个大分子蛋白组分具有显著
的促 PC12 细胞增殖活性 ,提示这个组分与鹿茸的神经生长因子样活性相关。
关键词 :鹿茸 ;分子筛色谱 ;阴离子交换色谱 ; PC12 细胞 ;细胞增殖
中图分类号 :R284. 2 ;R286. 02 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0715 04
Isolation and PC12 cell prol iferative protein fraction from pilose antler and its activity
KE Li2jing1 , N IE Yi2lei1 , YE Xiu2yun1 , HUO Yu2shu2 , RAO Ping2fan1 , ZHOU Jian2wu1
(1. Institute of Biotechnology , Fuzhou University , Fuzhou 350002 , China ; 2. Health Science Center
at San Antonio , The University of Texas , Texas 7822923900 , USA)
Abstract : Objective 　The lyop hilized pilose antler water ext ract ( PA E) was isolated , and t heir cell
p roliferation on PC12 cells was observed. Methods 　S2200 Size2exclusive gel and DEA E negative ion2ex2
change liquid chromatograp h were employed to f ractionate t he PA E. SDS2PA GE was employed to analyze
t he p roteins composition of PA E. The protein concent ration was determined by Folin2Phenol assay. The
proliferation rates of PC12 cells were measured by M T T assay. Results 　The proliferation rate of PA E on
PC12 cells at 1313 mg/ mL was 47 % ( P < 01 01) . PA E′s p rotein content is 8412 %. The PA E was f raction2
ated and obtained two active f ractions : S2002P2 and D EA E2P1 , whose cells p roliferation rates were 46 %
(9710μg/ mL , P < 0101) and 11115 % (5110μg/ mL , P < 01001) , respectively. DEA E2P1 mainly had p ro2
teins of Mr 56 000 and higher t han Mr 100 000 molecular weight . Conclusion 　The cell p roliferation of
PA E and it s chromatograp hic f raction indicate that t his f raction may at t ribute to pilose antler′s never
growt h factor2like activity.
Key words : pilo se antler ; size2exclusive chromatograp hy ; negative ion2exchange chromatograp hy ;
PC12 cells ; cell p roliferation
　　鹿茸系脊索动物门哺乳纲动物梅花鹿 Cerv us
ni p pon Temminck 或马鹿 C. el a p hus L . 的雄性未
骨化密生茸毛的幼角[1 ] 。鹿茸的神经生长迅速 ,且
每年进行周期性替换 ,推测鹿茸中可能含有丰富的
神经生长因子。Garcia 等[2 ]采用半定量的 R T2PCR
法发现 N T23 ( neurot rop hin23) mRNA 在鹿茸顶部
的表皮层的表达最高 ,而在软骨层最低 ,这与上述组
织的神经分布情况一致。霍玉书等[3 ]发现冻干梅花
鹿鹿茸的相对分子质量大于 10 000 超滤组分具有
神经生长因子样活性 ,能刺激神经纤维的生长和分
化 ,其对 PC12 细胞的促分化作用的最佳质量浓度
为 1815μg/ mL 。虽然已知鹿茸含有氨基酸、多胺、
核酸、酯类、激素、多糖以及维生素等成分[4 ] ,但鹿茸
中的神经生长因子样活性分子还未得到分离和鉴
·517·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008209218　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (20672021)
作者简介 :柯李晶 (1977 - ) ,男 ,福建省福州市人 ,福州大学生物工程研究所所长助理 ,研究实习员 ,英国爱丁堡大学在读生物医药专业
博士生 ,多年从事蛋白质生化和中草药有效成分研究工作 ,已发表相关论文 7 篇 ,并多次参加相关国际学术会议及做大会报
告。Tel : (0591) 87893047 　Fax : (0591) 83732462 　E2mail :fzklj @fzu. edu. cn3 通讯作者　周建武　
定。本研究对冻干鹿茸水溶性组分的促 PC12 细胞
增殖作用进行测定 ,并对其活性成分进行液相色谱
分离和活性评价。
1 　材料与仪器
鹿茸二杠茸冻干粉为美国德州大学胜安东尼奥
健康科学中心前大连药物研究所所长霍玉书教授馈
赠并鉴定 ,采自辽宁省新宾县加禾天山种鹿厂 4 岁
雄性梅花鹿。PC12 大鼠肾上腺嗜铬细胞 (p heo2
chromocytoma cells ,上海生物化学研究所细胞库) 。
Sep hacryl S2200 HR (瑞典 Pharmacia 公司 ) ;
0102 % ED TA 和 0125 % 胰蛋白酶 ;培养基 RPMI
1640 ;小牛血清 ; M T T (1 mg/ mL , 溶于 PBS 中) ;
二甲亚砜 (DMSO) ;丙烯酰胺 (超级纯 ,上海生化所
申华公司) ;指示剂溴酚蓝 (超级纯) ; SDS、N2N2甲
双丙烯酰胺、1 , 42二硫代苏糖醇、甘氨酸、TRIS、
TEM ED、溶菌酶 (L YS) 、碳酸酐酶 (CA) 、兔磷酸化
酶 B、卵白蛋白 (OVA) 、牛血清白蛋白 (BSA) 、β2半
乳糖苷酶 (β2gal)均为生化级试剂 ;其余试剂均为分
析纯。
WXJ - 9388 型核酸蛋白检测仪 (浙江康特高科
生物仪器有限公司) ;SJ - 1211 型蠕动泵 (日本 A T2
TO 公司) ;BD112 型记录仪 (荷兰 Kipp & Zonen 公
司) ;Bioλ- 10 型可见紫外分光光度计 (美国 PE 公
司) ;Mini Protein II 电泳槽 (美国 BIO2RAD 公司) ;
DF - C 恒压恒流电泳仪 (东方特力科贸中心) ;1285
型超净工作台 (美国 Thermo Forma 公司) ; 3111 型
二氧化碳培养箱 (美国 Thermo Forma 公司 ) ;
D G5031 型酶联免疫检测仪 (国营华东电子管厂) ;
37XA 倒置显微镜 (上海光学仪器厂) ; A G204 电子
分析天平 (北京赛多利斯天平有限公司) 。
2 　方法与结果
211 　鹿茸水溶性组分的制备 :取二杆茸 ,切片冻干
磨粉 ,取粉 15 g 溶于 100 mL 去离子水 ,于 4 ℃下磁
力搅拌器搅拌抽提过夜。所得抽提样品在 4 ℃下
12 000 r/ min 离心 15 min ,收集上清液 ,冻存于
- 20 ℃。
212 　鹿茸水溶性组分蛋白质的测定和 SDS2PA GE
电泳分析 :以牛血清白蛋白为标准蛋白 ,按 Lowry
法测定蛋白质的质量浓度 ,计算得鹿茸冻干粉中蛋
白的质量分数为 8412 %。
213 　鹿茸水溶性组分的 SDS2PA GE 电泳分析 :参
照 Laemmli 方法[5 ]进行电泳 ,不连续胶系统 ,4 %浓
缩胶和 715 %或 1215 %分离胶 ,考马斯亮蓝法染色。
标准蛋白 (Marker MBI 公司) 为兔磷酸化酶 B ( Mr
97 400) 、牛血清白蛋白 ( Mr 66 200) 、卵清蛋白 ( Mr
43 000 ) 、碳酸酐酶 ( Mr 29 000 ) 、溶菌酶 ( Mr
14 400) ,结果见图 1。可知鹿茸中蛋白质的相对分
子质量分布范围较广 , 从小于 14 000 到大于
100 000 ,但主要集中在 10 000 ～ 56 000 和大于
100 000 处。加入还原剂β2巯基乙醇后 ,位于约 Mr
56 000 的蛋白上移到约 Mr 70 000 处 ,说明它们含
有链内二硫键 ;而大于 100 000 处的蛋白的量显著
减少 ,说明这些蛋白内含有链间二硫键。
　　 　　M 　 　1 　　 　2 　　　　M 　 　3
67 000 -
43 000 -
29 000 -
14 000
M2标准蛋白　12鹿茸 (非还原) 　β2巯基乙醇　22鹿茸 (还原) 　
32S2002P2 (非还原)
M2Marker 　12pilose antler (non2reduced) 　β2mercaptoet hanol 　
22pilose antler (reduced) 　32S2002P2 (non2reduced)
图 1 　冻干鹿茸水提物及其分离组分银染( A)和考马氏
亮蓝染色( B)的 SDS2PAGE电泳图
Fig. 1 　SDS2PAGE of PAE and its liquid chromatographic
fractions argentation ( A) and Commassie Blue
Staining ( B)
214 　鹿茸水溶性组分的液相色谱分离 :首先用
Sep hacryl S2200 HR 分子筛凝胶过滤色谱对 PA E
进行分离。Sep hacryl S2200 HR 凝胶柱 (500 mm ×
16 mm) ,用 0105 mol/ L ,p H 617 的磷酸盐 (含 012
mol/ L NaCl)缓冲液充分平衡。取鹿茸水溶性组分
样品 ,解冻后用 80 %硫酸铵沉淀蛋白组分 ,后用平
衡缓冲液重融得到可溶性蛋白组分。取此蛋白组分
3 mL ,上样 ,流量 015 mL/ min , 以含 012 mol/ L
Na2 SO4 的平衡缓冲液进行分离 ,收集各个色谱峰 ,
结果见图 2。可见共分成 P1～P5 5 个组分 ,其 SDS2
PA GE 电泳图谱见图 1 ,蛋白带主要集中在约 Mr
56 000 ( P2 组分)和大于 Mr 100 000 处。
将 P2 组分即 S2002P2 用截留相对分子质量为
8 000～10 000 的透析膜 ,在去离子水中过夜透析除
盐 ,期间换水 1 次。所得透析样品进行 DEA E2
·617· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
　　　
图 2 　鹿茸水溶性组分 PAE的 S2200 分子筛色谱图
Fig. 2 　S2200 Size2exclusive chromatogram of PAE
TO YOPEA RL 650M 阴离子交换色谱分离 , DE2
A E2TO YO PEARL 650M 色谱柱 ( 100 mm ×10
mm) ,取 5 mL S2002P2 透析后样品 ,加入 45 mL
0102 mol/ L 磷酸盐平衡缓冲液 (p H 617) 稀释 10
倍 ,流动上样 ,充分平衡并收集未吸附组分 ,再以含
1 mol/ L NaCl 的磷酸盐缓冲液连续梯度洗脱 ,流量
110 mL/ min ,收集各洗脱峰 ,结果见图 3。可见分
为 3 个组分 , 经 SDS2PA GE 电泳分析 (图 4 ) ,
DEA E2P1 组分的蛋白主要集中在 Mr 56 000 和大
于 Mr 100 000 处 ,在 Mr 97 000 处也有一条电泳
带 ,且各分离组分的蛋白质相对分子质量的组成较
为相似 (数据未列出) 。
图 3 　S2002P2 组分的 DEAE2TOYOTEARL 650M
阴离子交换色谱分离
Fig. 3 　DEAE2TOYOTEARL 650M Ion2exchange
chromatogram of S2002P2
215 　鹿茸水溶性组分原样和各色谱分离组分的促
PC12 细胞增殖活性测定
21511 　PC12 细胞培养 : 于含 10 %胎牛血清的
RPMI 1640 培养基中 ,37 ℃、5 % CO2 培养 ,每周更
换培养基 2 ～ 3 次 , 用 01 25 % 胰蛋白酶2012 %
ED TA 工作液消化分散细胞 ,进行传代或接种培养。
21512 　体外促细胞增殖活性的测定[6 ,7 ] :对数生长
期的 PC12 细胞 ,0125 %胰蛋白酶20102 % ED TA 工
　
作液消化 ,加入适量培养基 (含热灭活的小牛血清) ,
吹打分散 , 300 ×g 离心 5 min ,再以适量无血清
RPMI 1640 培养基清洗细胞 3 次、并孵育 1 h 后 ,重
新悬浮细胞 ,浓度为 4 ×104 ～5 ×104 / mL ,接种至
96 孔培养板 (每孔 190μL ) ,每孔加入待测样品 50
μL ,37 ℃、5 % CO2 培养箱中培养 24 h ,移除培养
液 ,每孔加入 M T T 溶液 50μL (1 mg/ mL 溶于 PBS
中) ,37 ℃,3 h ,移除 M T T 溶液 ,每孔加入二甲亚砜
150μL ,充分振荡 ,待所形成的结晶物完全溶解后 ,
用酶联免疫检测仪测定 A 590 nm值 ,计算细胞增殖率
[细胞增殖率 = (实验组平均 A 590 nm - 空白对照
A 590 nm ) / 空白对照 A 590 nm ×100 %]。
用 Excel 2002 软件对所有的实验数据进行双
尾、异方差假设 t 检验 ,对鹿茸水溶性组分各分离组
分影响 PC12 细胞增殖的结果进行配对检验。将色
谱分离各组分透析、经 0122μm 滤膜滤过除菌后 ,
测定其对 PC12 细胞的促增殖作用 ,结果见表 1 和
2。可见鹿茸原样在 1313 mg/ mL 时的促 PC12 细
胞的增殖率为 47 %( P < 0101) ,证明鹿茸中具有较
为明显的促 PC12 细胞增殖的活性 ; S200 凝胶色谱
分离的 S2002P2 组分在 97μg/ mL 时的 PC12 细胞
的增殖率为 46 %( P < 0101) ;D EA E 阴离子交换色
谱分离的 D EA E2P1 组分在 5110μg/ mL 时的 PC12
细胞的增殖率为 11115 % ( P < 01001) ,明显高于
S2002P2 组分的促增殖活性 ,故 DEA E2P1 为活性组
分。其余分离组分对细胞增殖的影响皆无显著性
差异。
3 　讨论
本研究采用冷冻干燥鹿茸 ,最大限度的保留其
生长因子活性。蛋白质量分数约为 8412 % ,是冻干
鹿茸的主要成分。鹿茸或其饮片中已知的成分未能
·717·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
　表 1 　鹿茸 S2200 各收集峰促 PC12 细胞增殖活性检测( n = 4)
Table 1 　PC12 Cell proliferation rate of S2200 chromatographic
fractions of pilose antler ( n = 4)
组 别 细胞增殖率/ %
空白对照 0. 0 ±13. 0
PA E 蛋白原样 47. 3 ±17. 533
P1 15. 5 ± 9. 2
P2 45. 9 ± 8. 633
P3 17. 8 ± 5. 4
P4 13. 5 ± 6. 7
P5 0. 5 ±10. 1
　　与空白对照组比较 :33P < 01 0133P < 0101 vs blank cont rol group
表 2 　S2002P2 的 DEAE色谱分离各组分促 PC12
细胞增殖活性检测( n = 5)
Table 2 　PC12 Cell proliferation rate of DEAE chromatographic
fractions from S2002P2 fraction ( n = 5)
组 别 细胞增殖率/ %
空白对照 0. 0 ± 8. 1
PA E 蛋白原样 8. 9 ± 9. 6
P1 111. 5 ±22. 6333
P2 - 5. 4 ±17. 0
P3 0. 0 ±16. 1
P4 - 9. 9 ±27. 1
　　与空白对照组比较 :333P < 01001333P < 01001 vs blank cont rol g roup
充分解释鹿茸的药理作用 ,作为鹿茸中含的最多的
物质蛋白质及其衍生物可能对鹿茸的药理作用有重
要贡献或影响。
冻干鹿茸水溶性组分具有促大鼠成骨样细胞
UM R2106 增殖活性 ,增殖率为 49916 % ,其分子筛
色谱分离的一个组分对该细胞的生长有调节作用 ,
在 9172 m g/ mL 时促大鼠成骨样细胞增殖率为
47719 %[8 ] ;从中纯化得到的鹿血清白蛋白相对分子
质量为 56 300 , 在 01014 9～1419 μg/ mL 具有促
UM R2106 细胞增殖活性[9 ] 。而本研究中的 D EA E2
P1 组分具有促 PC12 细胞增殖作用 ,其蛋白主要分
布在相对分子质量 56 000 和大于 100 000 两处。由
于相对分子质量为 56 000 左右的蛋白很可能就是
前述鹿血清白蛋白 ,未发现有促 PC12 细胞增殖活
性。据此推测相对分子质量大于 100 000 的蛋白可
能是促 PC12 细胞增殖的活性因子。
本研究所用的鹿茸水溶性组分对 PC12 细胞的
促增殖率为 4710 % ,活力远低于同样组分在同样浓
度下对 UM R2106 细胞的 49916 %[8 ] 。由于冻干鹿
茸提取物含有促 PC12 细胞分化因子[3 ] ,故推测鹿
茸水溶性组分对 PC12 细胞促增殖活性可能受到促
分化活性因子的抑制。鹿茸水溶性组分的凝胶色谱
分离组分在 9710μg/ mL 下对 PC12 细胞的促增殖
活性为 4610 % ( P < 0101) ,与其对 UM R2106 细胞的
活性相近 (6216 % , P < 0105) ,提示经过凝胶色谱分
离 ,除去了鹿茸水溶性组分中抑制 PC12 细胞增殖
的因子。对该组分进一步用阴离子交换液相色谱进
行分离后 ,所得活性组分促 PC12 细胞增殖活性提
高了约 214 倍 ,且有效作用浓度 (5110μg/ mL ) 降低
了近 1 倍 ,比活性提高了近 5 倍 ,而该分离步骤的蛋
白纯度仅提高 1 倍。据此推断 , S200 组分中的细胞
增殖抑制因子得以进一步去除。
鹿茸多肽能促进大鼠坐骨神经和周围神经损伤
后的神经再生、分化和功能恢复[10 ,11 ] 。本研究报道
鹿茸活性蛋白在体外具有促 PC12 细胞增殖的作
用 ,其相对分子质量可能大于 100 000 ,提示鹿茸对
神经损伤的疗效也可能与其蛋白组分有关 ,但这种
关联性还有待进一步体内动物模型实验来证实。
本研究证明了冻干鹿茸中水溶性蛋白组分对
PC12 细胞的促增殖活性 ,并初步分离得到了活性
蛋白组分 ,但活性蛋白还有待进一步纯化和鉴定。
此外 ,对促增殖活性蛋白与 PA E 中的促分化活性
因子的协调作用关系的深入研究 ,也将为鹿茸治疗
神经系统疾病的疗效提供更全面的药理解释。
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·817· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月