全 文 ：·706· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第5期2005年5月
药理与临床
补阳还五汤对血瘀证大鼠血管内皮细胞黏附分子表达的影响
陈利国，屈 援，葛红颖。，胡小勤。，聂优爱’，何孟栖+
(暨南大学，广东广州 510632)
摘要：目的研究补阳还五汤对血瘀证大鼠血管内皮细胞黏附分子表达的影响。方法采用免疫组织化学和
RT—PCR方法观察补阳还五汤不同剂量对血瘀证大鼠血管内皮细胞细胞间黏附分子一1(ICAM一1)、血管细胞黏附
分子一1(VcAM一1)、血小板一内皮细胞黏附分子一1(PECAM一1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。结果
模型组ICAM一1、VcAM一1、PECAM一1、iNOS高表达，补阳还五汤能减少造模动物IcAM一1、VCAM一1、PECAM一1、
iNOS的表达，而且随着药物剂量的减少，各分子表达呈递增趋势，具有明显的量效关系。结论补阳还五汤能显著
降低血瘀证大鼠血管内皮细胞黏附分子高表达，且量效关系明显。
关键词：血瘀证；血管内皮细胞；补阳还五汤；黏附分子；免疫组织化学法；RT—PCR
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)05—0706—04
EffectofBuyangHuanwuDecoctiononexpressionofadhesionmolecules
invascularendothelialcellsofbloodstasisrats
CHENLi—guo，QUYuan，GEHong—ying，HUXiao—qin，NIEYou—ai，HEMeng～qi
(JinanU iversity，Guangzhou510632，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectofBuyangHuanwuDecoction(BHD)onadhesionmolecules
invascularendothelialcel s(VECs)ofbloodstasisrats．MethodsExpressionofICAM一1，VCAM一1。
PECAM一1．iNOSinvascularendothelialcellsofbloodstasisratsreceivingd fferentdosesofBHDwasob—
servedbyimmunohistochemicalmethodandRT—PCR．ResultsThexpressionofICAM一1，VCAM一1。
PECAM一1，iNOSwasincreasedinmodelgroup，whilewasdecreasedbyBHD．Therewasanincreaseten—
dencyonthexpressionofm leculesandsignificantdose—effectr lationshipalongwiththedecreaseofthe
BHDdoses．ConclusionTheincreasedexpressionofadhesionmoleculesinvascularendothelialcellsof
bloodstasisratscouldbereducedbvBHDinadosedependentma ner．
Keywords：blood—stasis；vascularendotheliale s(VECs)；BuyangHuanwuDecoction(BHD)；
adhesionmolecules；immunohistochemicalmeth d：RT—PCR
补阳还五汤一方，出自《医林改错》，王清任谓：
“此方治半身不遂，口眼歪斜，语言謇涩，口角流涎，
大便干燥，小便频数，遗尿不禁”。本方的特点是重用
补气药黄芪，是一首具有补气活血功能，用于气虚血
瘀各种病证的有效方剂，也是补气活血的代表方，广
泛用于临床各科疾病。近年来，对本方的药理、药效、
毒理等方面开展了大量的实验研究，但尚未见本方
对血管内皮细胞黏附分子表达影响的研究报道。本
实验运用免疫组织化学和RT—PCR方法，观察补阳
还五汤不同剂量对血瘀证模型大鼠血管内皮细胞几
种黏附分子：细胞间黏附分子一1(ICAM一1)、血管细
胞黏附分子一1(VCAM一1)、血小板一内皮细胞黏附
分子一1(PEcAM一1)以及诱生型一氧化氮合酶
(iNoS)表达的影响。
1 材料
1．1 动物：SD大鼠，由第一军医大学实验动物中
心提供。
1．2试剂：抗体购自美国SantaCruz公司。酸性酚
购自北京鼎国生物技术有限责任公司；One—Step
RT—PCRKit购自QIAGEN公司；异硫氰酸胍、
DEPC、月桂肌酸钠购自上海生工生物技术服务有
限公司；柠檬酸钠、氯仿、异丙醇均购自汕头市光华
化学厂；琼脂糖、Marker购自大连宝生物工程公司；
p一巯基乙醇、Tris、矿物油、SDS均购自Sigma化学
收稿日期：2004—10—14
基金项目：国家自然科学基金资助项且(30070909)；广东省“千百十工程”优秀人才培养基金资助项目(Q0262)
作者简介：陈利国(1960一)，男，山东省博兴县人，教授，博士生导师，暨南大学医学院副院长、中医系主任，主要研究血瘀证的形成机制
及中医学概念范畴体系。Tel：(020)85226467E—mail：tchenly@jnu．edu．cn
*暨南大学医学院2001级硕士研究生
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第5期2005年5月·707·
试剂公司。
1．3 中药复方组成：黄芪30g，赤芍4．5g，川芎3
g，当归6g，地龙3g，桃仁3g，红花3g(此为成人
1 d的用量)。药材购自广州同仁堂大药店。水煎至
含生药2g／mL。
1．4 主要仪器：PE480热循环仪，高速冷冻离心机
(SorvallRC5CPlus)，凝胶图像分析仪(Syngene)，
UV一1601型紫外分光光度仪(Shimadzu)，医用净
化工作台(苏州净化设备厂)，ZF型紫外分析仪
(上海嘉鹏科技有限公司)，恒压恒流DF—D型电泳
仪(北京东方特力科贸中心)。
2方法
2．1 动物分组、造模：SD大鼠30只，体重210～
230g，雌雄各半，随机分为对照组、模型组、补阳还
五汤高、中、低剂量组，每组6只。参照文献方法造
模[1]。将1mg／mL盐酸肾上腺素用生理盐水稀释1
倍，第1天每隔4hSC0．2mL稀释后的盐酸肾上腺
素，共给药3次，在每次给药的中间时间将大鼠放
入o～2℃冰水中4min进行两次冷刺激；第2天
仍按前日剂量SC两次(间隔4h)，在两次给药的中
间时间将大鼠放人冰水中3min进行1次冷刺激。
2．2免疫组织化学方法
2．2．1给药方法：于造模第3天动物禁食12h后
以成人剂量(成人按60kg计算)的20、10、5倍ig
给予补阳还五汤，每天给药1次，连续3d。
2．2．2标本采集及处理：于造模第6天，3％戊巴
比妥钠麻醉大鼠，无菌取主动脉一段，4％甲醛固
定。切片：APES(北京中山公司)硅化载玻片，使用
德国Leica公司的组织切片机切片，使用硅化好载
玻片捞片，放置切片盒待用。染色：ICAM一1、
PECAM一1、iNOS(家兔)采用Envision二步法，
VCAM一1(山羊)采用ABC法。
2．2．3图像采集及测定：在光学显微镜下，选取切
片(每只动物分别取2张)中适合测量的视野，然后
采用Leica显微摄像系统(德国)所带的Qwin500，
使用刻度为5的光强度，在40×10的放大倍数，按
照0、45、90、135、180、225、270、315的角度，分别采
集灰度图像(像素大小：512×512，格式：TIFF)保
存。图像测定：使用Scionimage软件打开采集图
片，并对每一图片的5个阳性部位测量其灰度值
(一个像素点)，同时测量免疫组化背景染色(大面
积)，并将测试结果记录下来，即每张切片有40个
阳性部位测试值和8个背景测试值。
2．2．4数据处理：将所测得数据输入到Excel中，
通过公式计算出阳性单位(PU)值。
PU一坚尝盟X100一坚尝盟×100
Umx ZOO
Ga、GB分别为待测结构a和背景p的平均灰度，G⋯为检测
仪器的最大灰度
2．3 RT—PCR方法
2．3．1药物血清制备：动物按2．1项方法分组造
模。给药剂量同2．2．1项，每天ig2次，连续3d。于
第3天首次给药后2h，重复ig1次，第2次ig后1
h，2％戊巴比妥钠麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉
取血，分离血清，2000r／min离心20min，取上清液
即为含药血清，56℃、30min灭活，一20℃冻存，临
用前4℃融化，按10％比例分别于实验前加入培
养液中。
2．3．2细胞分离与收集：无菌条件下分离大鼠主动
脉，将血管内膜暴露于外，两端折入结扎。以0．25％
胶原酶Ⅱ磁力搅拌消化和细胞刮擦法交替进行，每
次消化10min，共3次，将收集的细胞接种在用3％
的明胶铺板的Betri培养皿中，37℃、5％CO。培养
箱静置培养。于细胞培养第3天进行RT—PCR检
测。内皮细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原ABC法。
2．3．3引物：均由北京赛百盛基因技术有限公司合
成。0一actin：引物A序列：5，-TGGAGAAGAGC—
TATGAGCTG一37，707bp；引物B序列：57一GATA—
GAGCCACCAATCCACA一37，1035 bp；ICAM一1：
引物A序列：5，-AATTCACACTGAATGCCAGC一
37，1127bp；引物B序列：57一CAGTACCAACA—
CACCAACAA一3’，15 9bp；PECAM一1：引物A序
列： 57一GGTCAACAGAAGCAATCTGG一3’，300
bp；引物B序列：5-GGTGAGAGTGGCAA—
TTATCC一37，574b‘P；VCAM一1：引物A序列：5’一
GGTCTACCAGCTCCTGCGAT一37，805bp；引物B
序列：5—7GAGAGTCACAGCCAACAGCA一3’，1084
bp；iNOS：引物A序列：57一TGGAGAAGAGC—
TATGAGCTG一3’，36 5bp；引物B序列：57一AAG—
GAATTATACACGGAAGG一37，4047bp。
2．3．4RT—PCR反应：参考QIAGEN公司试剂盒
方法。反应总体积25肛L，模板RNA0．05pg，2．5
mmol／LdNTP混合液1肛L，5×PCR缓冲溶液5
肛L，混合酶1．25U，引物各0．25pL(100pmol／
肛L)，蒸馏水补至总反应体积25弘L，30弘L矿物油
覆盖，所有组分的混合均在冰上进行。应用PE一480
热循环仪进行PCR扩增。PCR热循环参数为50℃
逆转录30min，95℃灭活转录酶15min，进入热循
环 94℃变性1min，ICMA一1和iNOS两种引物退
万方数据
·708· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第5期2005年5月
火温度相同，均为53℃退火1min(VCAM一1为
57℃退火1min；PECAM一1为55℃退火1min)，
72‘℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5
min。10肛LPCR产物于1．2％琼脂糖凝胶电泳，溴
化乙啶染色，100bpDNAMarker为相对分子质量
标准，电泳结果在紫外灯下观察并用凝胶图像分析
仪记录结果。
3结果
3．1免疫组织化学方法进行染色后切片的图像测
定和数据分析：结果表明，造模动物血管内皮细胞黏
附分子——ICAM一1、VCAM一1、PECAM一1均较对
照组表达增多(P
显著。反映血瘀证的形成与血管内皮细胞黏附分子
表达有关。结果见表1。
3．1．1补阳还五汤对VCAM一1表达的影响：高、
中、低剂量补阳还五汤均能减少血瘀证大鼠
VCAM一1的表达(P<0．05)，而且与剂量呈正相
关，即随着剂量的降低，图像分析数据呈递增趋势，
表现出了明显的量效关系。
表1补阳还五汤对ICAM一1、VCAM一1、PECAM一1和iNOS表达的影响(工±s，n一6)
Table1 EffectofBHDonexpressionofICAM一1，VCAM一1，PECAM一1，andiNOS(；士s，万一6)
与对照组比较：△P
量组表达显著减少(P
递增趋势，说明对ICAM一1表达的影响与剂量有关。VCAM一1和ICAM一1影响的量效关系一致。
3．1．3补阳还五汤对PECAM一1表达的影响：图3．2 RT—PCR的数据分析：造模动物血管内皮细
像分析数据显示，随着用药剂量的降低，数据呈递减 胞黏附分子一ICAM一1、VCAM一1、PECAM一1、iNOS
趋势，与剂量呈负相关关系，其结果与VCAM一1和mRNA表达均较对照组显著增多(P
一步探讨。 与应用免疫组化方法所得结果一致。结果见表2。
表2补阳还五汤对ICAM一1、VCAM一1、PECAM一1和iNOSmRNA表达的影响(；±s，n==6)
Table2 EffectofBHDollmRNAexpressionofICAM一1，VCAM一1，PECAM一1，andiNOS(；士s，弹一6)
与对照组比较：△△P
响’：高、中、低剂量组均能减少血瘀证大鼠ICAM一1明显。
mRNA的表达(P<0．01)，而且与剂量呈正相关。4讨论
3．2．2补阳还五汤对VCAM一1mRNA表达的影 近年来，随着分子生物学和分子免疫学的发展，
响：高、中剂量组表达减少显著(P
3．2．3 补阳还五汤对PECAM一1mRNA、iNOS基因克隆成功的黏附分子多达几十种，形成了一个
mRNA表达的影响：数据分析显示，随着用药剂量庞大的黏附分子家族，主要有：黏合素家族；免疫球
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第5期2005年5月·709·
蛋白家族；选择凝集素家族；钙离子依赖的细胞黏附
素家族；以及一些未归类的黏附分子：整合素超家
族；免疫球蛋白超家族；选择素超家族；钙依赖黏附
分子超家族等。黏附分子参与细胞的信号转导与活
化，细胞的伸展和移动，细胞的生长及分化、炎症、血
栓形成、肿瘤转移、创伤急救等一系列重要生理和病
理过程。随着中医、中药研究的进展，已观察到中药
对黏附分子表达的影响[2~4]。
本实验运用免疫组织化学和RT—PCR两种方
法进行研究的结果表明，补阳还五汤对血瘀证大鼠
血管内皮细胞黏附分子蛋白及mRNA的表达的影
响，除PECAM一1的免疫组化结果外，均呈现出了
明显的量效关系。
关于补阳还五汤对iNOS影响的研究，已有报
道[5~7]，但均未进行量效关系的研究。从本实验运用
两种方法进行的量效关系的研究结果来看，不同剂
量的疗效具有一定差异，从而为临床应用提供了实
验依据。
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以血清药理学方法研究黄连解毒汤对小鼠的药效动力学
宋 珏，路通，谢 林，王广基，刘晓东+
(中国药科大学江苏省药物代谢动力学重点实验室，江苏南京 210038)
摘 要：目的 以含药血清对小鼠肝匀浆体外生成丙二醛(MDA)的抑制作用为指标，研究黄连解毒汤及单味药
水煎剂的药效动力学。方法测定小鼠ig黄连解毒汤及单味药所得含药血清对MDA生成作用的经时过程，并考
察黄连解毒汤含药血清、单味药煎剂及小檗碱、黄芩苷抑制MDA生成作用的剂量一效应关系。结果小鼠ig黄连
解毒汤、黄连、黄芩、黄连+黄芩后，含药血清均可抑制体外肝匀浆MDA生成，且作用呈剂量依赖性。各药的E。，
分别为86％、76％、79％及81％；f—。分别为180、120、5及15min；其煎剂对MDA生成抑制作用呈剂量依赖性；小
檗碱在0．12～10ng／mL无明显的抑制作用；黄芩苷在1．11～10／tg／mL有抑制作用，且作用亦呈剂量依赖性。结
论黄连解毒汤体内抗氧化作用强于各单方。黄芩苷可能是黄芩药液和含药血清中的抗氧化成分之一，而小檗碱
可能与含药血清抗氧化作用无关；小鼠ig黄连解毒汤及其单味药所得含药血清对MDA生成呈时间和剂量依
赖性。
关键词：黄连解毒汤；丙二醛(MDA)；血清药理学；药效动力学
中图分类号：R285．61 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)05—0709—05
PharmacodynamicstudyonHuanglianJieduDecoctioninmice
byserumpharmacologicalmethod
SONGJue，LUTong，XIELin，WANGOuang-ji，LIUXiao-dong
(JiangsuKeyLaboratoryofD ugMetabolismandPharmacokinetics，
ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210038，China)
Abstract：ObjectiveTos udythepharmacodynamicchar ceristicsofHuanglianJ eduDecoction
收稿日期：2004—10—10
基金项目：国家中医药管理局基金资助项目(02—032P32)；国家“863”项目资助(2003AA22347A)
作者简介：宋 珏(1979一)，女，安徽芜湖人，中国药科大学药理学在读硕士研究生，主要从事药动学研究。
*通讯作者E—mail：XDliu@hotmail．comTel：02583271006
万方数据
补阳还五汤对血瘀证大鼠血管内皮细胞黏附分子表达的影响
作者： 陈利国， 屈援， 葛红颖， 胡小勤， 聂优爱， 何孟栖， CHEN Li-guo， QU Yuan， GE
Hong-ying， HU Xiao-qin， NIE You-ai， HE Meng-qi
作者单位： 暨南大学,广东,广州,510632
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(5)
被引用次数： 12次
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