全 文 ：文章编号:1006-3110(2007)02-0352-04 【论　著】
余甘子中水溶性鞣质的抗动脉粥样硬化作用机制研究
呙爱秀 ,黄兴国 ,唐湘云
　　摘要:　目的　在细胞水平证实中药余甘子(Phyllanthus Emblica L.)的两个可溶性鞣质成分 Phy-13(beta-1-O-
galloyl-3 , 6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose)和 Phy-16(1 , 6-di-O-galloyl-beta-d-glucose)是否具有抗动
脉粥样硬化作用。 　方法　人脐动脉内皮细胞 ECV-304经 ox-LDL(50 mg/ l)诱导 , MDA 试剂盒检测 Phy-13和 Phy
-16 作用后内皮细胞培养上清液中丙二醛(MDA)的水平 , MTT 法检测动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖 , 细胞计数仪
计数单核细胞和内皮细胞的黏附。 　结果　 Phy-13 和 Phy-16 能减少内皮细胞 MDA 的生成 ,减少 ox-LDL诱发的单
核细胞和内皮细胞黏附 ,并能对抗 ox-LDL 诱导的动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖。　结论　 Phy-13 和 Phy-16 能
够对抗 ox-LDL 诱导的动脉粥样硬化 , 这可能是余甘子治疗动脉粥样硬化相关疾病的重要机制之一。
关键词:　血管内皮细胞;血管平滑肌细胞;Phy-13;Phy-16;氧化损伤;增殖
中图分类号:R541.4　　　　　文献标识码:A
Mechanism of Anti-atherogenesis Effect of Soluble Tannins From Fructus Phyllanthi 　GUO Ai -xiu , HUANG Xing -
Guo , TANG Xiang-yun(Hunan Institute of Environmental &Biological Technology , Hengyang 421001 , Hunan)
Abstract:　Objective　 To clarify the mechanism of antiatherogenic effects of Phyllanthus emblica L., which is widely
used in treatment of atherosclerosis-related diseases and associated with ox-LDL by the soluble tannin, Phy-13(beta-1
-O-galloyl-3 , 6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose), and its analogue Phy-16 (1 , 6-di-O-galloyl-beta-
d-glucose).　Methods　 Human arteria umbilical endothelial cells , ECV-304 , were incubated with ox-LDL(50 mg/ l),
treated with corilagin or Dgg16 at different doses , and then incubated with monocytes.Malondialdehyde(MDA)in the culture
media was determined and the number of monocytes adhering to ECV-304 cells was counted cytometrically.The rat vascular
smooth muscular cells(VSMC)were incubated inmedia with or without ox-LDL(50 mg/ l), and with Phy-13 or Phy-16 at
different doses too , and the prol iferation of themwas assayed byMTT method.　Results　Both Phy-13 and Phy-16 were
able to reduce MDA content , prevented ECV-304 cells from being adhered by the monocytes, and inhibited VSMC prol ifera-
tion that induced by ox-LDL.　Conclusion 　These two compounds are effective in inhibiting the progress of atherosclerosis
by alleviating oxidation injury or by inhibiting ox-LDL-induced VSMC proliferation, whichmay be the promising mechanisms
for treating atherosclerosis.
Key words:　Endothelial cell;Smooth muscle cell;Phy-13;Phy-16;Oxidation injury;Proliferation
　　动脉粥样硬化是导致心血管疾病的主要基础疾病之一 , 高
血压 、脑中风 、慢性心衰和缺血性心肌病都与其有密切关系[ 1] 。
目前认为动脉粥样硬化的一个重要机制是内皮细胞损伤 , 常常
由自由基损伤引起 , 随后伴随着单核细胞黏附 , 最后导致血管
平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells , VSMC)增生 ,其中氧
化型-低密度脂蛋白(ox-LDL , oxidized low -density lipopro-
tein)引起的内皮细胞损伤最为重要[ 2] 。因而认为清除自由基
或抑制 VSMC 异常增殖是对抗动脉粥样硬化的有效措施。许
多抗动脉粥样的药物均具有此特性 , 比如普罗布考(probu-
col)[ 3] 、维生素 E(vitamin E)[ 4]和某些多酚化合物(phenolics)[ 5] 。
作者单位:湖南环境生物职业技术学院(湖南　衡阳　 421001)
作者简介:呙爱秀(1964-),女 ,湖南邵东人 ,大学学历 ,讲师 ,主要从事
中药药理方面的研究及中药学的教学工作。
基于上述理论 , 根据中草药的使用经验 , 我们筛选到一些
具有抗动脉粥样硬化活性的有效部分并获得了一些化合物 , 其
中从中药余甘子(Phyllanthus embolica L.)的果实中提取到的
两种水溶性鞣质 Phy-13[ beta-1-O-galloy l-3 , 6-(R)-
hexahydroxydi-phenoyl-d-glucose] 和 Phy-16(1 , 6-di-O-
galloy l-beta-d-gluco se)具有较好的活性 , 其结构式见图 1。
Phy-13和 Phy-16 是余甘子植物中新提取到的鞣质类化学成
分 , 两者含有较多的酚羟基 ,有较强的还原性 , 其中 Phy-13 有
较强的抗血小板聚集作用和抗炎作用[ 6] 。本文根据内皮氧化
损伤引发动脉粥样硬化的发病机制[ 7] , 对这两个化合物的抗动
脉粥样硬化作用进行初步的探讨。
本实验试图验证:1)通过检测丙二醛(malondialdehyde ,
MDA)判断两个化合物对内皮细胞氧化损伤的保护作用;2)这
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两个化合物能否抑制单核细胞对内皮细胞黏附;3)能否抑制
VSMC增殖 。实验中的维生素 E(alfa-tocofecol)作为一种生物
抗氧化剂在本实验中作为阳性对照药物。
A
B
Fig.1　 St ructu re of cori lagin and Dgg16
A:Phy-13(beta-1-O -galloyl-3 , 6-(R)-hexahydroxy - diphe-
noyl-d-glucose), B:Phy -16(1 , 6-di-O-galloyl-beta-d- glu-
cose)
1 　材料与方法
1.1 　材料 　Phy-13 和 Phy -16 购自中科院上海药物所。
DMEM 和 RPMI 1640 培养液购自美国 Gibco BRL公司。胎牛
血清(Fetal bovine serum)购自杭州四季青公司(Hangzhou Si-
jiqing Bio-material Co., L td.)。ox-LDL、胶原酶 、弹性蛋白酶
和维生素 E(alfa-to cofecol)购自美国西格玛公司。MDA 试剂
盒购自南京建成生物工程研究所。人脐静脉内皮细胞(Human
umbilical vein endo thelial cell)ECV-304 购自中科院上海药物
所。CO 2孵箱由德国 Hereaus 公司生产 , 酶标仪(Ridmodei -
3550 型)由意大利生产。临床生化检测仪(CL-770 型)由日本
岛津公司生产。其他试剂为国产分析纯。
1.2　方法
1.2.1　人单核细胞和大鼠主动脉 VSMC 制备 　人单核细胞
来源于健康人静脉血 ,由衡阳中心血站通过梯度密度离心法分
离得到 , 培养方法参照 Yin Rajesh et al.[ 8] 的方法。主动脉
VSMC 来源于健康 Sprague-Dawley 大鼠(动物合格证号
2001034), 按照文献[ 9]方法制备 , 简述如下。 取大鼠胸主动脉 ,
经分离 、清洗 , 然后去除动脉内膜和外膜 , 将动脉在 DMEM 培
养液中剪碎。 将剪碎的小动脉块置于含 10%胎牛血清的
DMEM 培养液中 , 置于 37 ℃、5% CO2 孵箱中培养。 24 h 后 ,
用含有青霉素(200 IU/ ml)和链霉素(200 IU/ ml)的培养液再次
清洗 , 然后用符合消化酶(含 2 g/ l的胶原酶和 0.25 g/ l的弹性
蛋白酶)消化 。当出现一定数量单个细胞后 , 用 20%的胎牛血
清终止消化反应。通过过滤离心获得单个 VSMC 进行原代和
传代培养。
1.2.2 　MDA 检测和单核细胞黏附检测 　 ECV-304 在含
15%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中 37 ℃常规培养 ,当细胞
长满 80%左右将细胞用 0.5%的胰酶消化成单个细胞。控制细
胞浓度为 5.0×105/ml ,取 1 ml加入到 6-孔板中积蓄常规培
养。当细胞贴壁后 , 加入 Phy-13 、PHy-16 或维生素 E 到各
孔 , 浓度按照 0.0001 、0.001、0.01 和 0.1 mmol/ l设置 , 同时各
孔均加入 ox-LDL(50 mg/ l), 再培养4 h后收集上清液按照试
剂盒说明书检测 MDA 。
除去培养板中上清液后 , 加入新鲜培养液 , 同时加入单核
细胞(5.0×105)200μl , 常规培养 1 h。同时通过细胞计数仪对
黏附在 ECV-304 的单核细胞和未黏附的细胞进行计数。 黏
附程度的计算公式参见公式(1)[ 10] 。
A(%)=NtotalMc-N non-adhering M c
N totalMc
×100% (1)
A:adhesion;
N toal Mc:Mumber of to tal monocy tes;
N non adhering M c:Number of non-adhering monocy tes
1.2.3 　 VSMC 增殖检测(MTT 法)[ 11] 　 取培养三代的大鼠
主动脉 VSMC 80μl(1×105/ ml)加入到 96-孔板中(控制总体
积为 200 μl)用含 10%胎牛血清的 DM EM 常规培养。 当细胞
贴壁后加入 Phy-13、Phy-16 或维生素 E。 8 h 后加入 ox -
LDL(50 mg/ l)再培养 12 h ,然后每孔加入 5%的 MTT 20 μl再
培养 4 h。活细胞对 MTT 具有转化能力 , 生成可溶于 DMSO 的
紫褐色结晶 , 结晶用 DMSO 溶解后于 570 nm 处比色 , 由此计算
细胞的增殖情况。
1.2.4　统计学处理　 检测结果用均值±标准差表示。采用单
因素的方差分析(One-w ay ANOVA)处理实验结果 , 以 P <
0.05为具有统计学意义。在统计图中 , 剂量采用对数浓度(0
除外)。
2　结果
2.1　 Phy-13 和 Phy-16 降低 ECV-304 培养液中的 MDA
浓度 　 不 加 入 药 物 处 理 , 或 各 处 理 组 在 极 低 浓 度
(0.0001 mmol/ l)时 , ox-LDL 引起的上清液中的 MDA 浓度处
于较高水平 , 当加入药物处理后 , MDA 呈剂量依赖性的下降 ,
从图 2 结果看 , Phy-13 和 Phy-16 在生物抗氧化作用比维生
素 E 要强 , 但最大效应接近。
2.2 　Phy-13 和 Phy-16 防止单核细胞黏附内皮细胞　 ox-
LDL能够促进单核细胞黏附内皮细胞 , 当用 Phy-13 和 Phy-
16 处理后 , 细胞的黏附率有所减少 , 呈现剂量依赖性。维生素
E 也具有类似作用 , 作用强度略低 ,见图 3。
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Fig.2　 Corilagin and Dgg16 decreased M DA in ECV-304
cells culture media(mean ± S.D., n = 6)
Fig.3　Corilagin and Dgg16 decreased adhesion of ECV-304
cells and monocy tes(mean ± S.D., n = 6)
A
B
Fig.4　 Corilagin or Dgg16 effect s on aortic
VSMC proliferation(mean ± S.D., n = 6)
VSMC prolif eration w as measured as thei r absorbance of M TT.A:ox -
LDL stimulated VSMC proliferation at 50 mg/ l.At 0 or 0.0001 mmol/ l ,
there were no signifi cant ly dif ferent ef fects betw een Phy -13, Phy -16 ,
and vi tamin E.But at the dose of 0.001 mmol/ l or higher , all inhibited
VSMC prolif erat ion(P < 0.01) and show ed a logarithmic dose depen-
dence.Phy -13 and Phy -16 were more effective than the cont rol.B:
Without ox -LDL , Phy - 13 or Phy -16 showed almost no effect on
VSMC proliferation(P>0.05), and neither did con trol vitamin E.
2.3 　Phy-13 和 Phy-16 对 VSMC 的增殖作用　 在 ox -
LDL(50 mg/ l)的存在下 , Phy-13 和 Phy-16 均能抑制 VSMC
的增殖 , 阳性对照药维生素 E 也具有类似作用 ,但作用稍弱(见
图 4A )。为了考察 Phy-13 、Phy-16 和维生素 E 是否存在对
VSMC 的直接抑制作用 , 发现去除 ox-LDL 的刺激作用后 , Phy
-13 、Phy-16 和维生素 E 对 VSMC 的增殖几乎没有影响(见
图 4B)。
3　讨论
尽管动脉粥样硬化的发病原因尚未完全清楚 ,但对其形成
机制提出过许多假说 , 其中一个就是自由基损伤学说[ 12] 。内皮
细胞的损伤常诱导单核细胞或其他炎症细胞(如巨噬细胞)黏
附 , 黏附来的炎症细胞浸润到动脉壁吞噬脂滴。当炎症细胞吞
噬了一定的脂滴后就转变成泡沫细胞(foam cell)继而启动动脉
粥样硬化。另一个机制认为动脉粥样硬化与内皮下的 VSMC
增殖有关 , 通常也与炎症细胞有关。通常这两个机制是动脉粥
样硬化病理过程的两个连续的环节 ,打断任意一个环节或两者
均打断都能够对抗动脉粥样硬化的作用。由氧化损伤开始 , 然
后炎症细胞黏附 ,最后不可避免地导致 VSMC 增殖 , 这样构成
了氧化损伤学说的主要内容。
ox-LDL是生物膜的强氧化剂 , ox-LDL 能够产生自由
基 , 也促进细胞产生自由基。在氧化损伤的检测中 ,M DA 常常
是膜损伤的一个指示性分子 , 与细胞膜损伤情况呈正相关。 本
研究结果证实:Phy-13 和 Phy-16 对自由基有清除作用 ,能减
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少细胞膜的脂质氧化从而减少内皮细胞损伤 , 最终减轻内皮细
胞和炎症细胞黏附。本文结果支持氧化损伤学说 , ox-LDL 不
但是生物氧化分子也能通过氧化损伤促进单核细胞黏附 , 同时
还能促进 VSMC 增值。 Phy-13 、Phy-16 和维生素 E 本身无
VSMC细胞增殖抑制作用 , 但能对抗 ox-LDL 导致的 VSMC
增殖 , 这进一步表明 ox-LDL 促 VSMC 增殖是由其氧化损伤
导致的 ,含有还原性酚羟基的 Phy-13 、Phy-16 和维生素 E 能
对抗之 ,这也提示其它还原性物质对此过程也有类似的对抗作
用。由此分析 , Phy-13、Phy-16 和维生素 E 能够打断氧化损
伤学说的两个环节 , 因而能产生较好的抗动脉粥样硬化作用 ,
这与普罗布考的抗动脉粥样硬化一致[ 3] 。文献报道 Phy-13
能够清除超氧阴离子自由基和过氧化氢[ 12] , 这与本研究结果是
一致的 , Phy-16同样具有此作用。
已有文献报道 ,一些趋化性细胞因子(chemotaxis cy tokines)
如血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecules)[ 13 , 14] 、细
胞间黏附分子(intercellular adhesion molecules)[ 14]和单核细胞化
学趋化蛋白(monocy te chemoattractant protein)[ 14]在 ox-LDL
内皮损伤中会表达上调 ,由此诱导单核细胞或其他炎症细胞黏
附损伤内皮细胞 , 导致内皮细胞的损伤进一步加重。 Phy-13
和 Phy-16 能够通过减少内皮细胞氧化损伤来打破此恶性循
环 ,起到阻止动脉粥样硬化发展的作用。
另有文献研究表明[ 15] ox-LDL能够很容易地浸润到动脉
壁 ,激活 VSMC 成为分泌型 VSMC , 同时促进浸润到动脉壁的
炎症细胞和 VSMC 增殖 、吞噬脂滴形成泡沫细胞。但 ox-LDL
如何激活此通路仍然不是十分明了。文献报道称 ox-LDL 能
上调增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen , PCNA)表
达 ,由此促进细胞周期相关蛋白如 P27和 P 57与 PCNA 结合[ 16] ,
然后再促进 c-myc或其他基因表达 , 最后导致 VSMC 异常增
殖和异常分化[ 17] 。从抑制 VSMC 增殖方面看 , 本研究结果提
示生物抗氧化剂如维生素 E、Phy-13 和 Phy-16 抗 VSMC 增
殖主要是其分子的还原性导致的 , 尽管 Phy-13 还存在其他机
制[ 7 , 8] ,因为 Phy-13 和 Phy-16 本身对 VSMC 的增殖无明显
影响。
总之 ,从余甘子植物得到的这两种可溶性鞣质成分对 ox-
LDL 导致的动脉粥样硬化具有较好的对抗作用 , 能减轻内皮的
氧化损伤 ,抑制 ox-LDL导致的 VSMC 增殖 , 这可能是中药余
甘子抗心血管疾病的重要机制之一。
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(收稿日期:2006-12-14)
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