全 文 ：中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月·595·
双曲正切等激励函数，并首创用反正切激励函数训
练本模式，条件相同时，训练结果以反正切函数最
好，收敛最快，精度最高(表2)，可能是函数斜率较
小，压缩坐标轴，从而摆脱误差函数的平坦区，避免
大部分的局部极小值，使算法的收敛速度变快，但有
时易发生振荡。
表2激励函数的比较
Table2 Comparisonofexcitationfunctions
4．5训练方式：训练网络时先采用累计误差校正算
法，即用全部样本都依次输入后计算总的平均误差，
校正各连接权值，达到一定精度阈值后，再用标准误
差校正算法处理，即每输入单一样本修改一次权值。
可以保证网络计算速度与输出精度统一均衡。
4．6针对神经网络的过拟台现象：由于中药指纹图
谱中普遍存在预测样本数与特征数量比低于模式识
别的分类要求，此外个别离散数据的存在，网络中不
适当的误差精度要求和训练样本设计不合理，均易
造成对训练样本的预测能力高于对未知样本的预测
能力，则产生过拟合现象。本研究应用刘平等提出逼
近度理论“1来减少过拟合现象发生，确定最优学习
次数及对应的权、阈值参数(图3)。
5结语
多种识别算法结合，较为有效地避免了单一算
法的不足，将其应用于中药指纹图谱的模式识别中，
l一训练集样本平均误差2一控制集样本平均误差3一逼近度
1一meanrelativeerrorftrainlngset2-HleaNrelativeeTroT
ofcontrolset3-approximationdegree
圈3 ANN逼近度优化
Fig-3ANNOptImizationbyapproximationdegree
有助于缓解中药色谱指纹图谱客观性和判别主观的
矛盾。未来如能制定保证诸如采样的普遍、代表性，
制备方法的科学、完善和系统的中药指纹图谱规范
要求，结合谱效关系，信息采集、分析自动化等技术，
必将极大促进中药现代化的进程。
Rdereucesj
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不同培养基对掌叶大黄毛状根克隆系质量的影响
扬世海1，刘晓峰2，果德安3，郑俊华3
(1，吉林农业大学中药材学院．吉林长春130118；2．吉林亚泰(集团)股份有限公司，吉林长春130031
3．北京大学药学院，北京100088)
摘要：目的研究培养基优化和毛状根克隆系对掌叶大黄毛状根生物量和蒽醌产量的影响。方法选取4个单
克隆掌叶太黄毛状根和4种基本培养基，采用统计分析方法。研究影响大黄毛状根生物量积累和5种葸醌类化台
物的产量的因素。结果不同克隆间大黄毛状根生物量积累存在显著差异．以单克隆毛状根DH7a最高；培养基种
类对毛状根生物量的影响存在极显著差异，以WP培养基中毛状根生物量最高；大黄毛状根中的5种游离蒽醌中
以大黄酚和大黄隶甲醚为主i不同壳隆问5种游离蒽醌总产量存在显著差异，以DHTa最高，并且DH7a与Bs培养
基的组合，5种葸醌产量最高{克隆和培养基之间互作分析显示克隆DH5a、DH5d与WP培养基．克隆DH7a与B5
培养基对于游离蒽醌产最来说是优势组合，而克隆DH5c在4种培养基上5种游离蒽醌产量差异不显著。结论本
研究为利用掌叶大黄毛状根培养系统大规模生产蒽醌类化合物提供依据。
收疆日期：2005—07—10
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万方数据
中革焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
关键词：掌叶大黄；毛状根；单克隆；培养基；蒽醌类化合物
中圈分类号：R282．7 文献标识码：B 文章编号：0253
EffectofvariousmediaonqualityofhairyootclonesofRheumpalmatum
YANGShi—hail．LIUXiao—fen92，GUODe—an3．ZHENGJunhua
3
(1．CollegeofChineseMedicinalMaterial，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2．JilinYaTaiGroup
Co．Ltd．，Changchun130031，Chinal3，SchoolfPharmaceuticalSciences，PekingUniversity，Beijing100083，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectofoptimizedmediaandclonesongrowthandanthraquinone
yieldinhairyootculturesofRheumpalmatum．MethodsThef urmonoclonesandfourmediawere
optimizedstatisticallyforstudyingtheffecton hebiomassccumulationandfiveanthraquinonesyieldin
hairyootculturesofR．palmatum．ResultsSignificantdifferencesi biomasswereshownamong
variousclonesandmedia．inwhichmonoeloneDH7awasthehighestandWPmediumwasthebest．
Chrysophanolandphyseionwerepredominantamo gfivefreeanthraquinonesinhairyootculturesofR．
palmatum．Notabledifferencesoftotalfivefreeanthraauinonesyieldwereobservedamongdifferent
clones，inwhichDHTawasthehighest．Reciprocityanalys showedthatthehighestyieldoffivefree
anthraouinonesiSinthcombinationsofDH7awithB5medium．DH5alessandDH5atheleastwithWP
medium，DH7aandB5mediumwerepredominentfortheyieldofabovefivefreeanthraquinoneswith
exceptionofDH5cwhichhasnosignificantdifferenceinfourmedia．ConclusionThestudylaysthe
foundationformassproductionofanthraauinonebyhairyootcultureofR．palmatum．
Keywords：RheumpalmatumL．；hairyroot；monoclone；media；anthraquinones
大黄是我国特产的传统中药。优质大黄只产于
我国以青海为中心的甘肃、陕西、四川、西藏一带。大
黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL．、唐古
特大黄R．tanguticumMaxi ．exBalf．和药用大
黄R．officinaleBai l．的干燥根及根茎口]。近年来，
由于过度采挖和垦荒，某些正品大黄在许多地区已
处于野外灭绝状态[2]。通过生物技术手段生产蒽醌
类化合物，开辟了大黄资源开发利用的新途径。
通过发根农杆菌感染植物，将其所含的Ri质粒
上的一段DNA(TDNA)转移并整合到植物基因
组中，诱导出毛状根，并建立毛状根培养系统。与植
物细胞悬浮培养系统相比，植物毛状根具有生长迅
速，合成次生代谢产物能力强和遗传稳定等优点o]。
毛状根的生长及次生代谢产物的产量主要是由毛状
根的遗传特性和培养条件决定的。故筛选高产单克
隆品系和优化培养条件在利用植物毛状根生产次生
代谢产物过程中显得尤为重要。
本实验是在成功诱导掌叶大黄毛状根的基础
上，研究培养基和毛状根克隆系对掌叶大黄毛状根
生长及蒽醌类化合物合成的影响，为进一步筛选并
建立适宜的掌叶大黄毛状根培养体系，用于生产蒽
醌类化合物奠定了基础。
1材料与方法
1．1单克隆掌叶大黄毛状根培养：4种单克隆掌叶
大黄毛状根，分别编号为DH5a、DH5c、DH5d和
DH7a，其中前3种由发根农杆菌Agrobacterium
rhizogenesLBA9402诱导产生，后一种由发根农杆
菌A．rhizogenesR1601诱导产生。每种毛状根切取
2cm长根尖(25mg)，分别接种于含100ml，液体
培养基的250mL三角瓶中。所用培养基为无机盐
均为1／2的无激素WP、N6、MS、B54种培养基。每
种毛状根均设3组重复，置于转速为100r／min的
摇床上振荡培养，培养温度为25C。
1．2掌叶大黄毛状根和非转化根生物量的测定：培
养40d后，收获4种掌叶大黄毛状根培养物。先用
镊子取出根，挤净根中所含培养基，用分析天平称鲜
重。用蒸馏水漂洗1rain，80℃烘干，称于重。
1．3蒽醌类化合物的HPLC检测[43
1．3．1总蒽醌类化合物的提取：将称好干重的毛状
根，用研钵研成粉末，分别装入5mL试管中，每个
试管中加入2mL丙酮一甲醇(1：1)混合液，超声振
荡5min后置于4℃冰箱中过夜。吸取每管上清液，
通过滤膜滤过1．5Eppendorf管中，挥干溶剂后准
确加入2mL甲醇，用于液相色谱测试。
1．3．2对照品溶液配制：分别称取芦荟大黄素2．5
mg、大黄酸4．9mg、大黄素2．4mg、大黄酚4．1
mg、大黄素甲醚2．9mg，共同溶于丙酮一甲醇(1：1)
的溶液中，用量瓶定容至25mL作为标准储备液，
取1mI。该储备液定容于25mL量瓶作为测试对照
品溶液。
万方数据
中草谵cMn髑eTraditionalandHerhlDrugs第37尝第4期2006年4月
1．3．3HPLC色谱条件：TSPP100高效液相色谱
仪，TSPUvloo紫外检测器，PhenomenexODS一3
色谱柱，流动相为甲醇一1％高氯酸(85：15)，体积流
量：lmL／min，检测波长为254nm。
1．3．4测定与分析：在上述色谱条件下，用HPI，C
测定各样品的峰面积，根据回归方程计算芦荟大黄
素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的量。
1．4统计分析：用SPSS8．0软件进行数据处理和
统计分析。
2结果
2．1单克隆大黄毛状根生物量分析：在培养过程中
观察发现，4种单克隆大黄毛状根在4种培养基里
的生长表现和生物量积累明显不同。在WP培养基
里多数毛状根生长较快，根粗并呈白色。而在B5培
养基里毛状根生长较慢，根细并为暗黄色。4种单克
隆太黄毛状根在4种培养基里培养40d后的生物
量见表l。
寝1不同培养基单克陛大黄毛状根生物■鲜重(千重)
Table1 Blomassccumulationofhairyootm∞o—
clonesof置．palmatumonvariousmedia
infreshweight(Dryweight)
【)Hh5鸲30(☆1466)27174(O．OSII)2．S2Z2(O，0548j5 8134(0159”
DHSc3 8360(O．0984)1252(O0287)11604(O．0264)6．1927(01430)
DH钳42107(01164)15689(0．0592】4，0231(00846)5951(01560)
Dtl7a49942(01171)3．5546(076O】46134(089)7．4656(0．2302)
对不同单克隆大黄毛状根在4种培养基里生物
量积累进行方差分析(表2)，发现不同单克隆大黄
毛状根生物量积累存在显著差异，不同培养基对大
黄毛状根生物量存在极显著差异，对其进一步分析
结果表明，不同单克隆大黄毛状根生物量存在显著
差异，以克隆DH7a最高，显著高于DH5c，但与
DHSa、DH5d差异不显著。培养基之间对大黄毛状
根生物量的积累影响非常大，WP培养基大黄毛状
根生物量积累最高，极显著地高于MS、N6和B5培
养基。因此，可以认为WP培养基最有利于大黄毛
状根的生长。
表2大黄毛状根生物■鲜重方差分析
Table2 Variancea alysisofbiomassccumulation
ofhairyootsof月．palmatum
2．2单克隆大黄毛状根中蒽醌类化合物产量分析：4
种单克隆大黄毛状根在4种培养基里培养40d后收
获，提取总蒽醌类化合物，用HPLC测定5种蒽醌产
量，结果见表3。对其进行方差分析，结果见表4。
表3单克隆大黄毛状撮中s种游离慧醒娄化台物产量
Table3 Yieldoffivefreeanthraquinonesinhairy
rootmonoclonesofR．palmatum
产量／(pg·瓶-1)毛状根1再面i了再云云吾i—i孬磊—买ii_买j鬲r买j丽
表4大黄慧慝类化台糟产量方差分析
Table4 Variancea alysisofanthraqalnoneyield
of晨．palmatum
*表示在5％水平上差异极显著；**表乐在1％水平上差异极
显著
。significantdifferenceatl velof5％I**significant
differenceatleveloi1％
可见大黄毛状根的蒽醌种类、不同单克隆以及
培养基与克隆之间互作对蒽醌产量存在极显著差
异，而培养基之间却无明显的差异，说明对大黄蒽醌
类化合物而言，培养基的影响不大。进一步分析结果
表明，大黄根中的5种游离蒽醌产量以大黄素甲醚
为最高，极显著地高于大黄素、大黄酸和芦荟大黄
索；以芦荟大黄素最低，仅是大黄素甲醚的1／10，与
太黄酚差异不显著。
不同克隆之间5种游离蒽醌总量也存在显著差
万方数据
中革蒋ChineseTraditionalandHerhlDrugs第37卷第4期2006年4月
异，DH7a和DH5a显著地高于DH5c和DH5d。
由于克隆与培养基之间存在互作，对其进一步
分析结果表明，4种单克隆大黄毛状根在不同培养
基上蒽醌产量差异显著。以DH7a在B5培养基上蒽
醌产量最高，DH5a在WP培养基上次之，以DH5d
在B5培养基上产量最低。
3讨论
研究表明，不同毛状根无性系具有不同的生长
速率及次生代谢产物量，这是由于毛状根起源于单
细胞，这些细胞在大小、结构、遗传、生理生化特征上
各不相同，其代谢状态和合成次生代谢物的能力也
不同，因此不同毛状根克隆系之间存在很大差
异口“]。本实验诱导产生的4个单克隆毛状根株系
中，其生物量积累和5种游离蒽醌总量存在显著差
异，以克隆DH7a生长速率快，且蒽醌化合物含量
高，因此，要提高蒽醌化合物含量，必须对毛状根细
胞系进一步筛选，以获得生长速度快和蒽醌化合物
含量高的细胞系。
各种培养基由于所含组分及其比例不同，对毛
状根生长及次生代谢产物的形成有不同的影
响E9,103。不同培养基的无机元素浓度差异很大，一般
分为高盐、高硝酸钾、中盐和低盐4种类型，对植物
细胞生长和次生代谢产物的形成必然会有较大的差
异。培养基中硝态氮和铵态氮之间的比例也会影响
毛状根生长和次生代谢产物的合成口“。本实验中，
WP培养基最有利于掌叶大黄毛状根生物量积累，
显著优于MS、N6和B5培养基。对培养基优化的研
究有待进一步深入，应采用统计分析方法对培养基
中各种成分进行多因素多水平的筛选。
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半夏药材中蛋白质IEF电泳图谱的研究
黄必胜，碌科力’，曹艳
(湖北中医学院，湖北武汉430061)
摘要：目的通过对半夏及其近缘植物的蛋白质电泳图谱比较，研究半夏药材的电泳鉴别方法。方法应用等电
聚焦(isoetectrofocusing，IEF)技术，对不同产地半夏及其近缘植物块茎进行比较。结果半夏具有稳定的IEF电
泳图谱，显示具有8条特征蛋白质带．并测定了其等电点(PI)值，半夏与其几种近缘植物的IEF谱有明显的区别。
结论半夏IEF电泳图谱可作为半夏药材的鉴别依据，半夏特征蛋白质的PI值为半夏的鉴定和蛋白质分离纯化
提供了参数。
关键词：半夏；掌叶半夏；本半夏；蛋白质电泳；等电聚焦
中图分类号：R282．7 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2006)04—0598—03
收稿日期：2005—06—10
*通讯作者陈科力
万方数据
不同培养基对掌叶大黄毛状根克隆系质量的影响
作者： 杨世海， 刘晓峰， 果德安， 郑俊华， YANG Shi-hai， LIU Xiao-feng， GUO De-an，
ZHENG Jun-hua
作者单位： 杨世海,YANG Shi-hai(吉林农业大学中药材学院,吉林,长春,130118)， 刘晓峰,LIU Xiao-
feng(吉林亚泰(集团)股份有限公司,吉林,长春,130031)， 果德安,郑俊华,GUO De-
an,ZHENG Jun-hua(北京大学药学院,北京,100083)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(4)
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