全 文 ：·886· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
ⅡA的代谢，是丹参酮ⅡA代谢的一个关键步骤；
CYP2D6也部分参与了药物的代谢。由于药物间代
谢性相互作用是影响药物在体内浓度水平的一个重
要因素，因此抑制丹参酮ⅡA上述的代谢途径将会
降低其代谢速率，提高丹参酮ⅡA在体内的水平。提
示CYP2C19、CYP3A1、CYP2D6的抑制剂与丹参
酮ⅡA之间有潜在的药物相互作用，前者可以降低丹
参酮ⅡA的代谢速率。本研究对丹参酮ⅡA的体外代
谢作了初步的探讨，为进一步药物相互作用研究和
进行人体试验提供参考和依据。
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p一榄香烯对人膀胱癌BIU一87细胞磷脂膜功能及Bcl一2表达的影响
李传刚1，李墨林2，周 琴3，舒晓宏，刘用楫1，韩国柱3
(1．大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁大连116023；2。大连医科大学病理生理教研室，
辽宁大连116027；3．大连医科大学药学院，辽宁大连116027)
摘 要：目的 探讨p榄香烯对人膀胱癌BIU一87细胞磷脂膜功能及Bel一2表达的影响。方法[32P]Pi同位素参
入，提取细胞磷脂进行HPTLC分析细胞磷脂(PC及PE)代谢，考马斯亮蓝法测定细胞膜蛋自水平，分析细胞脂
膜流动性及流式细胞仪测定Bcl一2表达的变化。结果随着p榄香烯浓度的增加，[32P]Pi参人细胞PC、PE量明显
降低，膜蛋白水平及Bel一2表达明显降低，其最大抑制率分别为：41．1％、43．3％、43％、50％，呈明显的量效关系
(P
关键词：p榄香烯；人膀胱癌；磷脂；HPTLC；Bcl一2
中图分类号：R285．5 文献标识码；A 文章编号：0253—2670(2007)06—0886—04
Effectsofp—elemeneonphosphatidemembranefu ctionandBcl一2expression
ofhumanbladderca cinomaBIU一87cells
LIChuan—gan91，LIMo—Iin2，ZHOUQin3，SHUXiao—hon93，LIUYong—jil，HANGuo—zhu3
(1．DepartmentofUrinarySurgery，secondAffiliatedHospital，DalianMed calU ivercity，Dalian116023，China；
2．DepartmentofPathophysiology，DalianMedicUniversity，Dalian116027，China；3．School
ofPharmacy，DalianMedic lUniversity，Dalian116027，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsofpelemeneonthephosphatidemembranefu ction
andBcl一2expressionofhumanbladercarcinomaBIU一87cells．MethodsPho phatidylch01ine(PC)and
phosphalidylethanolamine(PE)contentsweremeasuredbytheme hodf[32P]Piincorporationand
HPTLCseperation，the1evelofmembraneproteinwasdeterminedbyCoomassiebrilliantblue。the
expressionofBcl一2wasobservedbyflowcytometry，andthemembranefluidityof heBIU一87cellswas
examined．ResultsComparingw ththecontr01，the肛elemenecouldmark dlyinhibitthelevelofPC，
PE，membraneprot in，andBcl一2expressioninadose—dependentmanner，themaximuminhibitionrates
are41．1％，43．3％，43％，and50％(P<0．05)，respectively，aswellasthemembranefluidityofthe
收稿日期：2006—11-24
基金项目：辽宁省科技厅自然科学基金计划资助项目(20062156)
作者简介：李传刚(1967一)，男，大连人，辽宁省中西医结合学会理事，博士，教授，硕士生导师，从事中西医结合防治膀胱肿瘤的临床及
．⋯。料词￡]三饩，已发表论文20余麓。Tel：13591397759E—mail：ehuangang—li@hotmail．tom
*通讯作者舒晓宏E—mail；schuxh@yahoo．corn．cn
万方数据
中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·887·
humanBIU一87cells．ConclusionpElemenecadecreasetheBIU一87cells
7
phosphatidemetabolism，Bcl一
2expression，anditsmembranefluidity，whichindicatet atPC，PEcontentsandBcl一2expressionmaybe
closelyrelatedotheapoptosisfthehumanbladderca cinomaBIU一87cells．
Keywords：pelemene；humanbladderca cinoma；phosphatide；HPTLC；Bel一2
细胞与周围环境的联系必须通过细胞膜来完
成，膜磷脂的变化通常影响膜的各种理化性质，生物
膜的流动性最易被影响，而生物膜流动性异常就可
造成细胞功能有紊乱或破坏[1]。p榄香烯是中药温
莪术的抗癌有效成分，临床应用榄香烯膀胱灌注预
防浅表性膀胱癌术后复发有良好疗效[2]，笔者在证
明p榄香烯可诱导人膀胱癌BIU一87细胞凋亡的基
础上[3]，进一步研究其对BIU一87细胞膜磷脂功能
及Bcl一2表达的影响，探讨肿瘤细胞凋亡分子机制。
1材料与方法
1．1 材料：p榄香烯，质量分数98．8％，大连市医
药科学研究所；a2P]Pi，(666MBq／mL)中国原子
能科学研究所；磷脂标准品：磷脂酰胆碱(PC)、磷
脂酰乙醇胺(PE)，DPH(1，6一二苯基一1，3，5一己三
烯)，Sigma公司产品；抗Bcl一2鼠抗人单克隆抗体
及FITC标记的羊抗鼠二抗，BD公司；硅胶G一60
高效色谱薄层(HPTLC)板，德国Merck公司；其
他试剂均为国产分析纯。
1．2方法
1．2．1细胞培养及同位素参入：肿瘤细胞为人体膀
胱移行细胞癌细胞系BIU一87艮]。常规方法细胞培
养，收集细胞，按每瓶1×107个细胞分配人培养瓶
中，进行[32P]Pi同位素参入，根据以前研究结
果[3]，加入p榄香烯的终浓度为0、0．5、1．0mmol／
L，参入无载体[32P]Pi(终剂量为：444kBq／mL)，
置37℃、5％CO。孵箱中参入1h，作用完毕，温
PBS液洗细胞，加Folch分配液[氯仿一甲醇一水
(8：4：3)]，提取细胞膜磷脂。
1．2．2磷脂提取及HPTLC分析：Folch分配下相
(主要为氯仿相)用氮气吹干定容，于HPTLC板上
点样(色谱板用前于110℃活化1h)，同时点磷脂
标准品作为对照，在氯仿一甲醇一冰醋酸一甲酸一水
(70：30：12：4：2)溶剂系统展开，色谱板用醋酸
铜试剂显色后观察结果。p2p-]pi参入试验，色谱展
开后碘显色，刮下相应的PE和PC条带，液闪计数
仪(LS5801，Beckman)测cpm值。
1．2．3 肿瘤细胞膜蛋白水平的检测：肿瘤细胞经
0、0．5、1．0mmol／L的p榄香烯作用24h后，收集
细胞，肿瘤细胞膜影泡的制备按照文献方法[5]，用4
mol／L的KCI抽提肿瘤细胞膜蛋白，在0．01mol／
L、pH7．4的磷酸盐缓冲液透析，透析前后分别在4
℃条件下以17000r／rain离心30min；然后用考
马斯亮蓝法测定蛋白水平。
1．2．4肿瘤细胞脂膜流动性的测定：肿瘤细胞经
0、0．5、1．0mmol／L的p榄香烯作用24h后，以
DPH为荧光探针，2×10叫mol／L的DPH参入细
胞，25℃、30min温育，PBS定容，参照文献方法[6]，
用650一60型荧光光度计(日立，日本)测定肿瘤
细胞脂膜的流动性。
1．2．5肿瘤细胞Bcl一2蛋白水平的检测：肿瘤细胞
经0、0．5、1．0mmol／L的肛榄香烯作用24h后，收
集5×105个细胞，固定于冷无水乙醇中，洗涤后分
别加入抗Bcl一2鼠抗人单克隆抗体，置4℃冰箱30
min，洗涤后加入FITC标记的羊抗鼠二抗，作用结
束后过滤，在流式细胞仪(BD公司，美国)上分析
(用PBS代替单克隆抗体作用的作为阴性对照)，用
分析软件CellQuest软件处理数据，得出Bcl一2蛋
白阳性表达率。
1．2．6统计方法：应用SPSS10．0统计分析软件，
样本率的比较采用t检验。
2 结果
2．1 p榄香烯对[32P-IPi参入PC的影响：由表1
可知，p榄香烯明显抑制[-32p]pi向PC参入，随着p
榄香烯浓度的增加，-32P]Pi参入PC量明显降低，
抑制率分别为25．9％、41．1％，呈明显的量效关系，
经统计学处理差异有显著性(P<0．05)。
2．2 8一榄香烯对[-azp]pi参入PE的影响：由表1可
知，p榄香烯明显抑制[32P]Pi向PE参入，随着p一榄
香烯浓度的增加，[韶P]Pi参入PE量明显降低，抑
制率分别为32．3％、43．3％，呈明显的量效关系，经
统计学处理差异有显著性(P
可知，随着p榄香烯浓度的增加，肿瘤细胞膜蛋白水
平明显降低，抑制率分别为29．2o／4、43％，呈明显的
量效关系，经统计学处理差异有显著性(P
随着p榄香烯浓度的增加，肿瘤细胞膜的微黏度(11)
值明显升高，即可以降低肿瘤细胞膜脂的流动性；经
万方数据
·888· 中单芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
表1 is_榄香烯对人膀胱癌BIU一87细胞磷脂膜功能的影响(矬=3)
Table1 Effectof[3-elemeneonphosphatidemembranefu ctionofhumanbladderca cinomaBIU一87cells(万一3)
与0mmol／L比较：4P
2．5 B一榄香烯对肿瘤细胞Bcl一2蛋白水平的影响：
随着8一榄香烯浓度的增加，肿瘤细胞的Bcl一2蛋白
水平分别为：19．3％、14％、9．6％，抑制率分别为
27．2％、50％，呈明显的量效关系，经统计学处理差
异有显著性(P<0．05)。
3讨论
p一榄香烯是从中药温莪术提取的抗癌有效成
分，榄香烯化学结构具有榄香烯烷骨架的倍半萜烯，
相对分子质量为204，基础药理研究证明其具有抗
炎、抗肿瘤、诱导人膀胱癌BIU～87细胞凋亡之功
效[33；临床应用榄香烯膀胱灌注预防浅表性膀胱癌
术后复发具有良好疗效[2]。
磷脂是细胞膜重要组分，PC是磷脂的主要组
分，PC不仅是细胞组分区域化分布的物质基础，而
且还以其降解产物参与细胞的信息传递和代谢调
控，与细胞的生长、增殖、分化及癌变均有密切的关
系，很多疾病包括肿瘤都伴有膜磷脂代谢的变化，研
究膜磷脂的变化不仅有助于阐明这些疾病及肿瘤的
发病机制，而且有助于疾病的诊断和治疗；在大多数
哺乳动物细胞中，PC主要是通过CDP一胆碱通路合
成，同时PE甲基化生成PC的通路作为重要补充，
PEMT2(磷脂酰乙醇胺N一甲基转移酶2)是此通
路的关键酶[71；PE也是膜磷脂的主要组分，PE量增
高能维持癌细胞的稳定性，使之适应宿主组织的微
环境而得以存活，从而能够发展成为临床转移病
灶[8]。本实验结果显示，经p一榄香烯作用肿瘤细胞
后，膜磷脂组分的量发生了明显的改变，PC及PE
水平降低，此结果提示，经p榄香烯作用肿瘤细胞
后，可能PEMT2活性受到抑制，导致PE甲基化生
成PC的通路受到了抑制，使PC的合成减少。
流动性是细胞膜的主要动力学特性，是反映细
胞功能状态的综合指标；膜脂质成分及膜蛋白影响
细胞膜的流动性，磷脂是细胞膜的重要组分，磷脂分
子的活动是细胞脂膜流动性的基础，磷脂(PC与
PE)量的改变，膜成分的变化(包括磷脂及膜蛋白)
可以引起细胞膜空间构象的改变，进而影响其流动
性及细胞膜的功能，包括存在于膜上酶的活性和膜
的通透性，扰乱了细胞内钙稳态的正常代谢环境，肿
瘤细胞膜的流动性与其凋亡程度成负相关，进而起
到抗肿瘤的作用[9]。本研究证明p榄香烯可以明显
降低BIU一87细胞脂膜流动性，这可能是肿瘤细胞
膜磷脂及膜蛋白量的变化影响所致。在本实验条件
下，JB一榄香烯可以明显抑制BIU一87细胞磷脂代谢、
膜蛋白及细胞脂膜流动性，提示细胞膜磷脂(PC及
PE)与膀胱癌细胞凋亡有密切关系。
Bcl一2蛋白位于核膜及内质网上，是一个
21000的磷蛋白，癌基因bcl一2通过Bcl一2蛋白质
的过表达将肿瘤细胞阻滞在G。／G。期而抑制细胞凋
亡，促进肿瘤细胞的生长和演变Do]，在本实验条件
下，随着p榄香烯浓度的增加，肿瘤细胞的Bcl一2蛋
白水平明显降低，呈明显的量效关系，提示Bcl一2在
p一榄香烯体外抗肿瘤诱导膀胱癌细胞凋亡中有重要
作用，但榄香烯是如何调控这些基因的表达还需要
进一步探讨。
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蕨麻石油醚部位的抗氧化活性研究
张 丽，李灵芝，龚海英，王鲁君，佟巍
(武警医学院药物化学教研室，天津 300162)
蕨麻为蔷薇科植物鹅绒委陵菜Potentilla
anserinaL．的干燥块根，又名人参果、长寿果，藏医
称“卓老沙僧”。始载于《西藏常用中药材》，《中药大
辞典》、《青海植物志》、《中国高等植物图鉴》等均有
记载。《中华藏本草》中记载其块根中含有碳水化合
物、蛋白质、脂肪、鞣质、黄酮、甾醇、胆碱、甜菜碱、组
氨酸等成分。蕨麻性平，味甘，健脾益胃，生津止渴，
益气补血，止咳利痰，利湿，亦有滋补之效。研究表明
蕨麻多糖具有抗氧化、抗疲劳作用，并能提高机体的
免疫力与应激能力。前期研究发现，蕨麻石油醚部位
[petroleumfractionofP．anserina(PFPA)]具有
明显的抗缺氧作用[1]。本实验系统研究蕨麻石油醚
部位体外抗自由基作用，以进一步深入探讨其抗缺
氧作用机制。
1材料
蕨麻购自青海，粉碎后60％乙醇回流提取，减
压除净乙醇，加水悬浮后，用石油醚(60～90℃)萃
取，减压回收石油醚，得浓缩物(相当生药250g／
g)，测得其中含棕榈酸0．35mg／g。
邻苯三酚、苯甲酸、硫酸亚铁胺、依地酸钠、甘露
醇、30％双氧水均为分析纯，实验用水为双重蒸馏水。
UV一1601型紫外分光光度计(日本岛津)；
RF一2401型荧光分光光度计(日本岛津)。
2方法
2．1蕨麻石油醚部位体外清除氧自由基(O。7)的
作用
2。1．1邻苯三酚白氧化法[2]：反应温度为25℃，样
品组取o．1mol／LPBS缓冲液(pH8．34)2．5mL，
分别加入4．0mL样品和2．5mL邻苯三酚溶液
(0．5mmol／L)，总体积为9．0mL；样品对照组加
0．1mol／LPBS缓冲液5．0mL及样品4．0mL。空
白组加PBS2．5mL、蒸馏水4．0mL及邻苯三酚
2．5mL；空白对照组加PBS5．0mL及蒸馏水4．0
mL。样品质量浓度分别为10、15、20g／L。于325
nm处测定各体系在反应开始后10min时的吸光
度(A)值，按照以下公式，计算样品对体系中o。7
的清除率。
清除率一∞空--A,t)／A空x100％
其中，A空一A空白一A空白对照；Am=Am品一A样品对照
2．1．2抗O：7对红细胞的氧化作用：红细胞取自正
常人静脉血，用生理盐水洗3次，再用等渗磷酸缓冲
液配成10mL／L红细胞悬浮液。配制不同反应体
系，C体系为0．50mL红细胞悬液、2．30mLPBS、
样品(15g／L)0．10mL及0．10mL邻苯三酚溶液
(50mmol／L)；b体系以PBS代替样品；a体系不加
邻苯三酚。加入邻苯三酚启动反应后，立即用紫外分
光光度计测定各反应体系A值(A一439nm)随时
间变化曲线，并测定反应10rain后的吸收光谱[3]，
并绘制各反应体系在反应10min后的吸收光谱及
A值随时间变化曲线。
2．2 蕨麻石油醚提取物体外清除羟自由基
(·OH)的作用：根据Fenton反应原理[4]，实验时
反应液中分别加入质量浓度为5、0．5、0．01、0．005
g／L的样品。反应体系含1．5mLPBS(150mmol／
L、pH7．4)，1．0mL苯甲酸溶液(6mmol／L)，0．25
mLFe2+一EDTA溶液(0．189mmol／L)，0．25mL
收稿日期：2007一01—22
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30672774)
作者简介：张丽(1973一)，女，天津人，讲师，硕士，主要从事药物分离及药物分析工作。
Tel：(022)60578189E—mail：langshuo@sina．corn
万方数据
β-榄香烯对人膀胱癌BIU-87细胞磷脂膜功能及Bcl-2表达的
影响
作者： 李传刚， 李墨林， 周琴， 舒晓宏， 刘用楫， 韩国柱， LI Chuan-gang， LI Mo-lin，
ZHOU Qin， SHU Xiao-hong， LIU Yong-ji， HAN Guo-zhu
作者单位： 李传刚,刘用楫,LI Chuan-gang,LIU Yong-ji(大连医科大学附属第二医院,泌尿外科,辽宁
,大连,116023)， 李墨林,LI Mo-lin(大连医科大学,病理生理教研室,辽宁,大连,116027)
， 周琴,舒晓宏,韩国柱,ZHOU Qin,SHU Xiao-hong,HAN Guo-zhu(大连医科大学药学院,辽宁
,大连,116027)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(6)
被引用次数： 6次
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