全 文 ：#!榄香烯衍生物!IP诱导 ;R& 细胞
凋亡的机制研究
于志瀛
广东食品药品职业学院! 广东 广州 $+$#
摘要#!目的$于;R& 细胞株中$对
#
!榄香烯衍生物IP!
#
!榄香烯 )5色氨酸进行抗肿瘤作用研究) 方法#体外细胞培
养$凋亡检测%流式细胞术和蛋白免疫印迹等技术进行机制研究) 结果#IP在低于 &$
0/S*G
f时可以抑制白血病细胞;R&
生长并诱导凋亡+IP可以引起细胞内E
+
H
+
的蓄积并活化.BUABUM5)+过氧化氢酶可以阻断IP引起的E
+
H
+
蓄积和凋亡) 结论#
IP主要通过E
+
H
+
的蓄积引起细胞凋亡)
关键词#!
#
!榄香烯衍生物+抗肿瘤+凋亡+E
+
H
+
的蓄积+;R& 细胞
稿件编号#!+$$*$($)$$
通信作者#!于志瀛$PMS#!$+$+((&(#
!!
#
!榄香烯是从中药温莪术挥发油中分离出来的
油状单体$是榄香烯抗肿瘤 ) 种有效成分之一$ 属
于不含氧的倍半烯烃类)
#
!榄香烯虽然有其他抗肿
瘤药物所不具有的优势./ $但因为它为脂溶性化合
物$临床使用的剂型只有乳剂$稳定性较差$因此在
临床上只能作为二线药物$极大的限制了
#
!榄香烯
的临床应用) 先前的研究发现$在
#
!榄香烯结构中
引入亲水性基团$可以改善水溶性的同时提高抗癌
活性.+/ ) 对
#
!榄香烯 ) 位氨基酸取代衍生物的活
性筛选中发现$) 位色氨酸取代
#
!榄香烯!IP抑
制细胞生长及诱导细胞凋亡的能力明显强于母体化
合物
#
!榄香烯$结构见图 ) 本文对化合物IP的凋
亡诱导作用机制进行了研究)
图 !IP的化学结构
!材料
_!药物!IP由沈阳药科大学徐莉英教授合成并
惠赠$纯度 *(d*e)
_(!试剂与仪器!单抗F4>F!
#
!B.@N2 ! 8B2@B
氧化氢酶!<4P$8ND0B公司++a$%a5二氯荧光素乙
二酯!X
置荧光显微镜!德国莱卡公司+流式细胞仪!RM.@/2
XN.KN2U/2+9N2N电泳仪!RN/5>BJ)
_&!细胞株!人类急性髓细胞性白血病细胞株
;R& 由广州军区广州总医院医学实验科惠赠) 细胞
接种于含有 $e胎牛血清!QR8$$$ _*0Gf青
霉素$$$ _*0Gf链霉素$$d+e;BE
的 >F9:5
#&$ 培养液中$在 )% h$e
饱和湿度的培养箱
内培养)
(!方法
(_!细胞生长抑制活性测定!通过改进的 9PP法
测得) 取对数生长期 ;R& 细胞! i$个=0G接
种于 *# 孔板$每孔 *$
G$使细胞数约为每孔 i
$
&个$设空白组%对照组%用药组+用药组加 $
G
化疗药物工作液$对照组加 $
G不含药物的工作
液$空白组只加培养液) 每计量组种 ) 个附孔$在
)% h$e
培养箱中培养 %+ ?后$每孔加9PP溶
液 +$
G$& ? 后每孔加 $e十二烷基硫酸钠 $$
G$( ?后用酶标仪测定 %$ 20处吸光度2.)/ ) 利
用公式求得细胞生长抑制率j f!2加药孔=2对照孔 i
*&+)*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
$$e)
(_(!凋亡的检测!利用丫啶橙!4H和溴化乙啶
!IR双染法考察凋亡细胞的形态学变化) 取对数生
长期细胞$以每孔 i$个=0G接种于 + 孔板中$每
孔 + 0G) 药物处理后$取 0G细胞悬液$离心$弃去
上清液$重悬于 +
GFR8中$然后加入4H=IR等体
积混合液 )
G!$$ 0D*G
f
4H$ $$ 0D*G
f
IR$
混匀) 取 +$
G混合液点于洁净载玻片上$用盖玻片
封片$在荧光显微镜下观察并拍照) IR拒染并出现
核皱缩%发芽%发泡以及凋亡小体的细胞被认为是凋
亡细胞) 在镜下不同区域随机选择 )$$ 个细胞$凋亡
细胞占其百分比为细胞凋亡率)
细胞凋亡可进一步由流式细胞仪检测中的 O
亚倍体峰变化情况进行确认) 细胞! i$#个经
药物处理相应时间后$离心收集$经 %$e乙醇固定
过夜后收集样品$在 D*Gf的>;BUM溶液中 )% h
孵育 )$ 0N2后$加入相应体积的 F:试剂至终浓度
为 $ 0D*Gf) 样品X;4含量利用流式细胞仪检
测$激发波长 &(( 20$吸收波长 #+ 20$定量计数
万个细胞$数据采用
(_&!细胞内过氧化氢!E
+
H
+
水平检测!细胞内的
E
+
H
+
含量可以利用其特异性荧光探针X
X
0/S*G
f
$在 )% h$e
培养箱中孵育 ?后$加入受试药物处理指定时
间) 收集各组细胞$FR8 润洗 + 次后经流式细胞仪
检测其荧光强度!激发波长 &* 20$ 吸收波长 +
20) 将 $$
0/S*G
f
E
+
H
+
处理细胞 ? 作为阳
性对照组)
(_Q!线粒体膜电位检测!线粒体膜电位的变化可
以通过具有膜通透性的阳离子染料 >?+) 进行检
测$线粒体对其摄取量与线粒体膜电位成正比) 细
胞! i$#个经FR8 润洗后$加入>?+) 至终浓度
为 $d+ 0D*Gf$于室温避光孵育 +$ 0N2./ ) 细胞
样品经FR8润洗后经流式细胞仪检测其荧光强度
!激发波长 &* 20$吸收波长 ) 20)
(_$!蛋白免疫印迹技术!细胞内的蛋白样品!$
D蛋白通过>:F4裂解缓冲液.$ 00/S*GfPCNU
盐酸$$ 00/S*Gf氯化钠$$de十二烷基硫酸钠
!8X8$e ;F5&$$$de脱氧胆酸钠$ 00/S*Gf
F98Q$$$
0/S*G
f
SMLAMA@N2和 + 0D*GfBAC/@N25
N2$ AE(d$/裂解得到) RCBJV/CJ 方法定量蛋白后$
利用非连续 8X8 聚丙烯酰胺凝胶电泳将裂解得到
的蛋白样品进行分离$再通过电转移装置将蛋白转
移到硝酸纤维素膜上) 用 $d+e的丽春红对膜染色
以确定各孔道的蛋白是否等量上样并是否成功转移
至膜上) e的脱脂奶粉对膜封闭后$在 & h对硝酸
纤维素膜孵育待测蛋白的特异性抗体$过夜) 滤膜
加入免疫印迹化学发光试剂!I
片感光记录下来.#/ )
&!结果
&_!IP的细胞生长抑制作用!用直接细胞计数方
法考察了IP对白血病 ;R& 细胞的生长抑制活性)
在 $ g&$
0/S*G
f浓度处理下$IP可以剂量依赖
性地抑制 ;R& 细胞的生长) 在 )$$&$
0/S*G
f
时$IP可以明显降低 ;R& 细胞的存活率) 见图 +)
色氨酸!PC6和
#
!榄香烯!ISM单独给药和联合给
药的情况见图 +) 单纯的色氨酸或
#
!榄香烯在低于
$
0/S*G
f处理浓度时$均没有明显的生长抑制
和细胞毒性作用) 此结果提示$IP的抗肿瘤活性来
自于该衍生物本身结构$与色氨酸或
#
!榄香烯各自
的抗肿瘤活性无直接关联)
与对照组相比$n$d$$+$n$d$)
图 +!化合物IP的细胞生长抑制作用和细胞毒性
*+)*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
&_(!IP的凋亡诱导作用!4H=IR荧光双染法凋
亡检测结果显示$分别用 +$$)$$&$
0/S*G
f的IP
处理;R& 细胞 + ? 后$细胞出现了染色质凝固%边
缘化%凋亡小体及核断裂等典型的凋亡形态学改变$
凋亡率分别为 )d*e$)&de$de+&$
0/S*G
f
的 IP处理 ;R& 细胞 #$+$+& ? 的凋亡率分别为
(d+e$de$(*d#e)
化合物IP对;R& 细胞的凋亡诱导活性可经F:
染色后$通过流式细胞术进一步得以确证) $$+$$
)$$&$
0/S*G
f的 IP对 ;R& 细胞进行处理$+ ?
后所致凋亡细胞分别为 +d%e$ d)e$ )&d*e$
(d)e) 上述结果表明$在 ;R& 细胞株中$IP通过
凋亡诱导作用来发挥其细胞毒性作用$而且 I9可
以明显诱导;R& 细胞凋亡)
&_&!<4P对IP诱导的E
+
H
+
蓄积和UL\5O 峰比例
增加的阻止作用!用 +$$)$$&$
0/S*G
f的 IP处
理细胞 ( ?后$流式细胞仪检测细胞内 E
+
H
+
的蓄积
情况$结果表明IP处理细胞内 E
+
H
+
的含量显著升
高$分别是 d(e$)d(e$(d&e) 结果提示$细
胞内E
+
H
+
的大量产生可能是IP诱导细胞凋亡的原
因)
为了进一步探讨细胞内E
+
H
+
蓄积是否在IP诱
导的细胞凋亡过程中发挥重要作用$考察了抗氧化
剂过氧化氢酶!<4P对 IP诱导细胞凋亡的影响)
结果表明$对 ;R& 细胞预处理 <4P能够显著逆转
IP诱导活性氧蓄积和 UL\5O 峰的比例增加$分别
从 (d&e下降到 d)e和 (d*e下降到 #d(e)
同时;4<不能阻断IP诱导的细胞内的E
+
H
+
蓄积$
也不能逆转IP诱导的细胞凋亡)
&_Q!<4P对 IP诱导的 ;R& 细胞线粒体膜电位的
下降和.BUABUM活化的逆转作用!&$
0/S*G
f
IP
处理;R& 细胞 ( ?后可以显著诱导线粒体膜电位的
下降$<4P能够完全逆转 IP诱导线粒体膜电位的
下降$从 )$de恢复到 d#e) 结果表明$IP可能
是通过线粒体介导的凋亡途径来诱导 ;R& 细胞发
生凋亡的$而此途径的活化可能源于细胞内大量
E
+
H
+
的产生)
IP能够剂量依赖性地下调 .BUABUM5) 前体蛋白
AC/.BUABUM5) 的蛋白表达水平$同时 .BUABUM5) 的特
异性底物 F4>F也出现了 (* $$$ 的裂解条带) 如
图 ) 所示$对 ;R& 细胞预处理 ;4<和 <4P结果与
E
+
H
+
蓄积%线粒体膜电位的下降相平行) <4P能够
完全阻断IP所致的 F4>F裂解%.BUABUM5) 的活化$
而;4<不能)
图 )!<4P对 IP诱导的;R& 细胞.BUABUM5)
活化的逆转作用
Q!讨论
#
!榄香烯和色氨酸在单独给药! n$
0/S*
G
f
时$仅有很微弱的生长抑制作用) 将两者联合
给药$在生长抑制上也未见有增强的作用) 此结果
表明$IP生长抑制活性和细胞毒活性是来自于 IP
化合物本身$而非
#
!榄香烯和色氨酸作用的加和)
在;R& 细胞中 E
+
H
+
的蓄积程度与 IP诱导的
凋亡程度密切相关$本研究观察了抗氧化剂;4<和
<4P对IP诱导细胞凋亡的影响) 结果表明$只有
预处理了<4P的 ;R& 细胞才能够显著逆转 IP诱
导活性氧蓄积和细胞凋亡$鉴于;4<只能提高细胞
内O8E的水平$且不能阻断IP诱导的细胞内E
+
H
+
的蓄积和细胞凋亡$因此推测 IP诱导细胞凋亡是
通过使细胞内E
+
H
+
的蓄积而实现的)
线粒体功能的损伤被认为是活性氧介导的细胞
凋亡途径中的重要事件之一.$%/ $且 .BUABUM5) 的活
化在线粒体介导的凋亡途径中发挥了关键的作
用.$(/ ) 本结果表明$IP诱导的线粒体膜电位下降
和.BUABUM5) 活化$也同时被 <4P所逆转) 因此 IP
产生的凋亡机制是使细胞内 E
+
H
+
蓄积
%
线粒体损
伤
%
.BUABUM5) 活化
%
F4>F断裂
%
细胞凋亡)
在解释IP引起细胞内 E
+
H
+
蓄积的机制方面$
有研究表明$色氨酸可以引起肿瘤细胞内E
+
H
+
的蓄
积$且在色氨酸的羧基上进行改造修饰可以提高其
对肿瘤的抗增殖作用.*/ ) 色氨酸改造修饰后的化
合物在体内外实验中都能有效地抑制鼠源的白血病
细胞生长.$/ ) 因此推测$化合物 IP是
#
!榄香烯结
构的引入增加了色氨酸的凋亡诱导活性)
本研究证明IP可以诱导肿瘤细胞;R& 发生凋
*#+)*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
亡$其凋亡机制是通过诱导细胞内活性氧的蓄积$继
而损伤线粒体的功能$从而引起细胞凋亡的发生+
IP的生长抑制活性可能是由于
#
!榄香烯的结构增
加了色氨酸的抗肿瘤活性+提示
#
!榄香烯结构可作
为活性增强基团引入到其他的抗肿瘤药物结构中)
参考文献#
. /!石灵春$汪波$张维彬d中草药有效成分
#
!榄香烯在肿瘤防
治中的运用 .W/d现代中西医结合杂志$ +$$$$ !&#
)*%d
. + /!TL G$PB/8$ZB2DT$M@BSdP?MU62@?MUNUB2J B2@N5AC/SNVMCB@NlM
MVM.@U/V\M@B5MSM0M2MJMCNlB@NlMU,N@? 0PH>N2?N\N@N/2 B.@NlN@6
.W/dRN//CD9MJ . ) /!陈新峰$杨菁d用9PP法进行白血病体外药物敏感性检测的
临床意义.W/d福建医科大学学报$+$$*$&)!+##*d
. & /!QLKLU?N0Bc$ P/6/U?N0B8d42@N@L0/CB.@NlN@6/VB0N2/B.NJ JM5
CNlB@NlMUN2 @?MACN0BC6U.CMM2N2D.W/dOB22$ *%$ ##!#+*d
. /!WN2D $` XBNW$ MJ0B2 >9$ M@BSd4CUM2N.@CN/7NJM
UMSM.@NlMS6N2JL.MUB.L@MAC/06MS/.6@N.SMLKM0NB.MSBA/A@/UNU
lNBB?6JC/DM2 AMC/7NJM5JMAM2JM2@AB@?,B6.W/dRS//J$ ***$
*&!##+$+d
. # /!ZB2D>$ GN<9dI@?B.C62N.B.NJ \L@6S5MU@MCN2JL.MUBA/A@/UNU
N2 SMLKM0NB.MSU@?C/LD? B?6JC/DM2 AMC/7NJM0MJNB@MJ AB@?,B6
N2JMAM2JM2@/VDSL@B@?N/2M85@CB2UVMCBUMF5 N2?N\N@N/2 .W/d
. % /!GNL 9W$ ZB2D]$ GNET$ M@BSd9N@/.?/2JCNBSJ6UVL2.@N/2 BU
B2 MBCS6MlM2@N2 @?MAC/.MUU/VBA/A@/UNUN2JL.MJ \6,//JV/CJN2 :
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+$$&$ *&!+#&d
. ( /!GNF$ ;N1?B,B2 X$ RLJN?BCJ1/:$ M@BSd<6@/.?C/0M.B2J J4PF5
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+
H
+
B2J B.@NlB@N/2 /V.BUABUM5)d
+
H
+
N2 ;R&
.MSd
.a>C V?DEH/!
#
!MSM0M2MJMCNlB@NlM+ B2@N@L0/C+ BA/A@/UNU+ ?6JC/DM2 AMC/7NJM+ ;R& .MS
E?-# bQ(Y`NT\T++((&
责任编辑!张宁宁#
*%+)*
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[/Sd)$ :UULM!$
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