全 文 ：·878· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月
响有限。尽管花青素苷中、低剂量与雷公藤多苷都对
ConA诱导的脾细胞增殖有抑制作用，但是从病理
和炎症因子来看，中、低剂量又未能缓解病理改变，
这似乎预示雷公藤多苷与樱桃花青素苷对模型大鼠
的免疫影响机制有所不同。樱桃花青素苷不同剂量
对ConA诱导的脾细胞增殖的影响以及这种影响
对病理改变的意义还需进一步研究。
IL一6和PGE。是诱导佐剂性关节炎模型病理改
变的主要细胞因子，与模型大鼠的足爪肿胀和病理
改变正相关口’1⋯。临床中使用抗PGE。疗法能够很好
地缓解RA症状，控制RA进展[11’”]。抗IL一6疗法
也被作为RA的有效治疗方法之一，尤其在RA急
性期，能降低c反应蛋白，缓解病情[13|。已经证明花
青素苷中的cyanidin3一O一8一D—glucoside(C3G)能
抑制酵母聚糖诱导的大鼠炎症，降低IL一6和足爪中
PGE。水平，樱桃花青素苷和雷公藤都能降低血清
IL一6水平，花青素苷高剂量和雷公藤还能降低足爪
中PGE。水平，对这两种炎症因子的抑制作用或许
是它们改善模型大鼠炎症反应的途径之一。
本实验结果表明樱桃花青素苷与雷公藤都能对
大鼠的关节炎症起到保护作用，这一作用可能是通
过调节模型大鼠异常的免疫功能，降低大鼠体内炎
症细胞因子水平而产生的，但樱桃花青素苷对模型
大鼠的免疫调节与雷公藤又有所不同，这可能与花
青素所具有的多种生理作用如调节毛细血管渗透
性、保持细胞完整性，且具有较强的抗氧化等功能有
关[is,J61。因此樱桃花青素苷对佐剂性关节炎大鼠的
作用或许是多途径的，其机制还需进一步研究。
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antiinflammatoryactivitiesfanthocyaninsandtheiraglycon．
⋯～‘⋯。。⋯’⋯。“。’
槲皮素一7，47一二硫酸酯二钠对重组人肌醇磷脂
3一激酶p11013催化亚基活性的影响
刘 文，梁念慈
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023)
摘 要：目的 观察槲皮素一7，4r_二硫酸酯二钠(SQDS)对重组人肌醇磷脂3一激酶(P13一K)pllOp催化亚基的直
接作用。方法通过基因工程技术的方法获得P13一KpllOp催化亚基，用Ptdlns(4，5)P：和7_32P]ATP与重组
收稿日期：2004—09—19
基金项目：广东省重点学科基金资助项目(9306)；广东医学院青年基金资助项目(xQ9901)
作者简介：刘文(1970一)，男，广东翁源人，生物化学副教授，医学硕士，研究方向为生化药理学。
Tel：(0759)2388582—4Fax：(0759)2284104E—mail：liuw422@yahoo．corn．cn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月·879·
P13一Kp11013催化亚基一起保温的方法测定P13一K的活性；”P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提，加闪烁液于液闪计
数仪计数。结果SQDS对重组人P13一KP1lop催化亚基有抑制作用，Icso为14．88／umol／L。结论SQDS是P13一
K的抑制剂。重组人P13一Kp110B催化亚基可作为一种较为简便地筛选和开发有效的P13一K抑制剂的分子靶点。
关键词：肌醇磷脂3一激酶(P13一K)；重组蛋白；槲皮素一7，4’一二硫酸酯二钠(SQDS)
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)06—0878—04
Effectofdisodiumquercetin一7．47一disulfateonenzymeactivityofrecombinant
humanphosphoinositide3一k nasp11013catalyticsubunit
LIUWen，LIANGNian—Ci
(InstituteofBiochemistryandMolecularBiology，GuangdongMedicalC lege，Zhanjiang524023，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectofdisodiumquercetin-7，47一disulfate(SQDS)onactivityof
recombinanthumanphosphoinositide3-kinase(P13一K)P1lopcatalyticsubunit．MethodsRecombinant
humanP13一Kp110pcatalyticsubunitwasexpressedbygeneengineering．P13一Kactivitywasassayedby
incubatingrecombinantP13～KpllOpwithphosphatidylinositol一4，5一bisphosphateand[7—32P]ATP；the32P
radiolabeledlipidswereextractedwithchloroformandmethanol，thenassessedbyscintillationcounter．
ResultsSQDSshowedinhibitionontherecombinantpllOpcatalyticsubunitw hIC5014．88／lmol／L．
ConclusionSQDSisaninhibitorofP13一K．TherecombinantP13-Kp1108catalyticsubunitm ghtbeused
asamoleculartargetforsimplersc eeningandevelopmentof oreeffectiveinhibitorsofP13一K．
Keywords：phosphoinositide3-kinase(P13一K)；recombinantp otein；disodiumquercetin一7，47一disul—
fate(SQDS)
肌醇磷脂3一激酶(phosphoinositide3-kinase，
P13～K)是多磷脂酰肌醇通路中的一个重要的效应
器和涉及信号转导与细胞转化的关键酶。最近的研
究表明，P13一K是一个重要的药物靶点，P13一K特异
的抑制剂可望开发成为一种新的抗肿瘤药物[1~3]。
黄酮类化合物是广泛存在于植物界的多酚类化合
物，但多数黄酮类化合物不溶水，极大地限制了其生
物利用度和体内给药途径。本所用槲皮素作为母体
分子，采用化学方法合成出槲皮素水溶性衍生物，并
用胶束纸色谱来分离和鉴定，其结构经FAB—MS、
1H—NMR和”C—NMR确定为槲皮素一7，47一二硫酸
酯二钠 (disodiumquercetin一7，47一disulfate，
SQDS)E4,s]。研究表明SQDS对HL一60细胞生长、
重组人蛋白激酶CK2全酶及血小板聚集、胞外钙内
流、胞内钙动员、胞浆蛋白激酶C(PKC)的活性和
肌动蛋白的聚合有抑制作用[6~8]，但其药理作用的
分子机制仍未清楚。为了探讨SQDS对P13一K的作
用机制，本实验研究了SQDS对重组人P13一K
P110p催化亚基的直接作用。
1材料
1．1菌株与质粒载体：大肠杆菌BL21(DE3)由卫
生部武汉生物制品研究所引进，重组人P13一K
p110p—pBuescript11(PBS)由英国Ludwig肿瘤研
究所WaterfieldMD教授惠赠。
1．2 试剂：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)为美国
Calbiochem公司产品；槲皮素，渥曼青霉素，
LY294002，EGTA，Hepes和磷脂酰肌醇一4，5一二磷
酸(PIP2)为Sigma公司产品；[丫32P]ATP(比活
度：185TBq／mm01)为北京福瑞生物工程公司产
品；SQDS由本院化学教研室莫丽儿教授用化学的
方法，将槲皮素和硫酸起反应而合成，其质量分数为
98o,040[4’51；其余为国产分析纯产品。
2 方法
2．1 P13一KPllOp催化亚基的原核表达[9]：将
p110t3重组质粒转化感受态表达菌BL21(DE3)，挑
取单菌落加入10mL含Amp的LB培养基过夜振
荡培养，次日按250mL培养基(10g／L胰蛋白胨，
5g／L酵母提取物，5g／LNaCl，75mg／LAmp)加
2．5mL过夜培养菌，于37℃剧烈振荡培养，当
A。。。到达0．5时，加IPTG(终浓度为1mmol／L)
诱导表达。继续培养4h后收获细菌，称湿质量。然
后将250mL培养菌(约0．5g)加5mL缓冲液
(10mmol／LHepes，pH7．4，1mmol／LEGTA，
0．2mmol／LEDTA，3mmol／LMgCl，，1mmol／L
PMSF)于冰浴超声破碎，加DNaseI于4C水解
DNA60min，以300 0×g超速离心1h，获得上
清液用于P13一K的活性测定。
2．2 P13一K的活性测定：反应缓冲液100肛L，含40
mmol／LHepes，pH7．4，50mmol／LNaCl，4
mmol／LMgCl2，1mmol／LEGTA，50>mol／L
万方数据
·880· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月
ATP(含1．85×104Bq[了32P]ATP)，250pmol／L
PIP：，其中，PIP。预先超声助溶3min。另按实验设计
要求加入10肛L药物，加入酶液20pL起始反应。
反应温度30℃，反应时间10min，加入200,uL氯
仿一甲醇(2：1)终止反应。先后加入1mLHCl
(3．1mol／I。)和1mL氯仿，充分振荡以抽提磷脂。
3000×g离心10min，小心吸取下层有机相转移到
5mL离心管中，洗涤1次，加10mL闪烁液于液闪
计数仪计数。
2．3统计学处理：数据用z±s表示，组间比较采用
t检验。
3 结果
3．1 渥曼青霉素和LY294002对重组人P13一K
p110B亚基活性的影响：渥曼青霉素和LY294002
是P13一K特异的抑制剂，渥曼青霉素和LY294002
对重组P13一Kp110p亚基有抑制作用，IC。。分别为
2．15nmol／L和1．49p．mol／L。结果见表1和2。
3．2 SQDS对重组人P13一KpllOB亚基活性的影
响：SQDS对重组人P13一Kpllola催化亚基有抑制
作用，IC。。为14．8812mol／L，见表3。
表1 渥曼青霉素对重组人P13一Kp110p亚基
活性的影响(撑一3)
Table1 Effectofwortmanninonrecombinanthuman
P13一KpllOpactivity(甩一3)
与渥曼青霉素0pmol／L组比较：一P<0．01
++P表2 LY294002对重组人P13一KpllOp亚基
活性的影响(挖一3)
Table2 EffectofLY294002onrecombinanthuman
P13一KpllOpactivity(一一3)
与LY2940020nmol／L组比较：’P’P表3 SQDS对重组人P13一Kp11013亚基
活性的影响(月一3)
Table3 EffectofSQDSonrecombinanthuman
P13一Kp110Bactivity(n一3)
与SQDS0nmol／I，组比较：。P+P4讨论
P13一K是多磷脂酰肌醇通路中一个重要的效应
器和涉及信号转导和细胞转化的关键酶。PtdIns(3)
P、PtdIns(3，4)P2和PtdIns(3，4，5)P3是P13一K
的酶促反应产物，它们在细胞内起到第二信使的作
用，调节一些蛋白激酶活性如蛋白激酶A(PKA)、蛋
白激酶B(PKB)和某些PKC同工酶等，P13一K通
过这些信号传导途径参与多种生物学事件，如囊泡运
输、细胞骨架重组、肿瘤发生、细胞存活等n’2]。研究表
明某些疾病，如肿瘤、Ⅱ型糖尿病等与P13一K有密切
关系，因此，有学者提出，P13一K是一个药理靶点，其
特异的抑制剂具有临床治疗价值[3]。
在本实验中，重组人P13一Kp110p亚基有无活
性，是进行其生物学性质与生化药理学研究的前提。
本实验用PtdIns(4，5)P：、[7—32P]ATP与重组
P13一Kp110p催化亚基一起保温的反应，发现有Pt—
dins(3，4，5)P。产生，说明重组P13一Kp1 08亚基
有生物学活性。渥曼青霉素和LY294002是P13一K
特异的抑制剂，对重组人P13一Kp110B亚基均有抑
制作用，IC。。分别为2．15nmol／I。和1．49pmol／L，
与文献报道的结果基本一致[3]。因此，重组人P13一K
p110』3催化亚基可作为一个药理靶点。
槲皮素是～种广泛存在于植物中的黄酮类化合
物，是PKC和酪氨酸蛋白激酶的抑制剂。由于槲皮
素不溶于水，难于吸收，生物利用度低，因此国内外
学者在槲皮素分子中导入亲水性基团，增加溶解度，
从而增强其药理作用。目前已合成了一些水溶性槲
皮素衍生物，如槲皮素乙酸赖氨酸盐、烟酸槲皮素
酯、槲皮素磷酸酯钾等[1⋯。本课题组合成了SQDS，
并进行了一些抗肿瘤作用的研究。由于P13一K与细
胞增殖密切相关，P13一K是抗肿瘤的靶点之一，为进
一步研究SQDS的作用机制，进行了本实验。结果
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月·881·
发现SQDS是P13一K的抑制剂。这和其他证据[6~8]
均表明，SQDS具有生物学活性。SQDS抑制P13一K
的活性，因此抑制了P13一K介导的信号转导通路而
发挥作用。SQDS既具有槲皮素的作用，又增加其水
溶性，达到结构改造的目的。
本实验进一步阐明了SQDS的作用机制，这为
今后将SQDS应用于临床提供了一定的实验依据。
本实验结果还提示重组人P13一KpllO口催化亚基可
作为一种较为简便地筛选和开发有效的P13一K抑
制剂的分子靶点。
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塞隆骨提取物对体外大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8的影响
潘 明1‘2，谭言飞3，杨志荣p
(1．四川i大学生命科学学院，四川成都610064；2．四川理工学院生物工程系，四川自贡643000；
3．四川大学生物材料工程研究中心，四川成都 610064)
摘 要：目的 研究塞隆骨提取物对体外培养大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8代谢功能的调节作用，从而在细胞水平
上阐述塞隆骨防治骨质疏松的作用机制及药效成分的筛选。方法 采用超临界萃取法制备塞隆骨的脂、醇、水提液
及水煎提取液，用MTT法测定塞隆骨脂、醇、水提液及水煎液对成骨样细胞的增殖作用；测定碱性磷酸酶(ALP)
活性，观察上述提取液对细胞分化的影响。结果 10mg／mL塞隆骨脂提液和水提液对大鼠成骨样细胞ROSl7／
2．8有显著的增殖作用(P(P论塞隆骨脂和水提取液中分别存在有较高活性的促成骨样细胞增殖、分化的物质，可作为虎骨的替代中药。
关键词：塞隆骨；成骨样细胞；增殖；分化
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)06—0881—04
EffectofSailongboneextractsonratosteoblastoidcellsROS17／2．8invitro
PANMin91”，TANYan—fei3，YANGZhi—ron91
(1．CollegeofLifeSciences，SichuanUniversity，Chengdu610064，China；2．DepartmentofBioengineering，
SichuanInstituteofTechnology，Zigong643000，China；3．EngineeringResearchCenter
inBiomaterials，SichuanUniversity，Chengdu610064，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethemodulationofSailongboneextractsonratosteoblastoidcells
ROSl7／2．8invitros astoclarifythemechanismofosteoporosispreventionandactivecomponentscreen—
ingofSalongbone．MethodsSailongbonefat～solubleextract，SailongboneethanolextractndSailong
收稿日期：2004—12-24
基金项目：四川省科技厅科技攻关项目(01SG003—14)
作者简介：潘明(1966一)，女，副教授，在读博士，硕士生导师，研究方向为天然产物开发及药理药效的分子机制研究。
Tel：(028)85410362E—mail：panmingl06@163．corn
*通讯作者杨志荣
万方数据
槲皮素-7,4-二硫酸酯二钠对重组人肌醇磷脂3-激酶
p110β催化亚基活性的影响
作者： 刘文， 梁念慈， LIU Wen， LIANG Nian-ci
作者单位： 广东医学院生物化学与分子生物学研究所,广东,湛江,524023
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(6)
被引用次数： 2次

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2002,18(3)
10. 刘文.梁念慈 槲皮素对重组人肌醇磷脂3-激酶p110β催化亚基的影响[期刊论文]-广东医学院学报2005,23(1)

引证文献(2条)
1.刘文.梁念慈.黄仁彬 杨梅素、槲皮素和山萘黄素对重组人PI3K p110β催化亚基活性的影响[期刊论文]-广东医
学院学报 2006(5)
2.刘文.梁念慈.黄仁彬 柚皮素和橙皮素对重组人肌醇磷脂3-激酶p110β催化亚基的影响[期刊论文]-中药药理与临
床 2006(6)


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