全 文 ：·1864· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
银杏叶提取物对缺血再灌注小鼠脑细胞凋亡的保护作用
洪森荣，尹明华
(上饶师范学院，江西上饶334001)
摘要：目的探讨银杏叶提取物对脑缺血再灌注诱导小鼠脑细胞凋亡损伤的保护机制。方法小鼠采用双侧颈
总动脉结扎法建立重复全脑缺血再灌注模型。术后48h，制备石蜡切片(HE染色)检测脑组织海马CAl区锥体细
胞形态学变化；用紫外分光光度计检测脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平，同时用RT—
PCR技术检测缺血再灌注过程中小鼠海马凋亡蛋白抑制剂XIAP(X—chromosomelinkedinhibitorofapoptosis
protein)mRNA的表达。结果全脑重复缺血再灌注可以使海马CAl区幸存的锥体细胞数量减少(尸
关键谲：银杏叶提取物I脑缺血再灌注；细胞凋亡
中图分类号：R286．10 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)12—1864一04
ProtectionofextractfromGinkgobilobaleavesoncellapoptosisinmice
inducedbycerebralischemia-reperfusion
HONGSen—rong，YINMing—hua
(ShangraoNormalCo lege，Shangrao334001，China)
Keywords：theextractfromleavesofGinkgobilobaL．；cerebralischemia—reperfusion；cellapoptosis
银杏叶提取物是从银杏GinkgobilobaL．叶中
提取的银杏内酯和黄酮类有效部位[1]。现有的研究
表明，银杏叶提取物具有扩张血管和促纤溶功能，对
脑缺血再灌注损伤[2]和心肌缺血[3]均有保护作用，
但对脑缺血的作用机制远未阐明。近年的研究表明，
细胞凋亡是脑缺血病理作用的重要环节，是造成脑
缺血后继发性损害的重要机制[4]。大量的研究表明，
凋亡蛋白抑制剂(inhibitorsofapoptosisproteins，
IAPs)基因家族的X一染色体连锁凋亡蛋白抑制
(XIAP)参与了多种脑损伤的凋亡调控机制，使脑
缺血后caspase一3活性下降，神经细胞凋亡减少，脑
损伤减轻[5]。有研究表明，银杏叶提取物能显著减轻
小鼠脑缺血再灌注后海马CAl区迟发性神经元死
亡，具有脑保护作用[6]。但银杏叶提取物改善脑缺血
再灌注损伤的作用是否与其改变脑组织的XIAP
mRNA表达有关，目前还未见报道。因此本研究建
立重复脑缺血再灌注脑损伤小鼠模型，从抗细胞凋
亡作用方面探究银杏叶提取物对缺血诱导小鼠脑损
伤的保护作用，为阐明银杏叶提取物抗脑缺血的脑
内机制提供进一步的实验依据。
1材料与方法
1．1实验动物与药品：1月龄ICR雄性小鼠(清洁
级)，体重(25土3)g，浙江金华药品检验所动物中
心提供。银杏叶提取物注射液(含黄酮3．5mg／
mL，德国威玛舒培博士药厂)；地塞米松(国产药
品)；SOD试剂盒(北京创新三泰生物技术有限公
司)；MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；总
RNA提取试剂盒(北京赛百盛生物有限公司)；一
步法RNAPCR(AMV)试剂盒(大连宝生物工程
有限公司)。其余药品为国产分析纯。
1．2动物分组与给药：健康雄性小鼠随机分6组：
假手术组，模型组，银杏叶提取物高、中、低剂量组
(40、20、5mg／kg)和阳性药物组(地塞米松0．5
mg／kg)，每组36只。小鼠适应3d后，银杏叶提取
物组和阳性药物组分别ip银杏叶提取物注射液和
地塞米松，连续给药9d。模型组和假手术组在相同
时间点ip等量生理盐水。第7天给药后30rain行
脑缺血再灌注手术。
1．3动物模型的制备：小鼠用1．275g／kg乌来糖
(amidocynogen)ip麻醉后，分离两侧颈总动脉，用
收稿日期：2007—01—08
作者筒介：洪森荣，男，硕士研究生。E—mail：hongsenrong@163．corn
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第i2期2007年12月·1865·
无创动脉夹夹闭两颈总动脉造成前脑缺血，15min
后松开动脉夹恢复血流即为再灌注，10min后再次
阻断血流15rain，松开动脉夹实行再灌注，并缝合
颈部皮肤。假手术组分离两侧颈总动脉但不阻断血
流。在缺血再灌注期间维持体温(37±0．2)℃，以
避免温度变化对实验结果的影响。
1．4病理学检查：缺血再灌注后48h断头取脑，固
定后脑组织按常规方法进行石蜡包埋，切片，常规
HE染色，观察缺血再灌注后脑组织海马CAl区锥
体细胞的形态变化。参照Kato等口3分级方法对海
马CAl区组织学改变进行分级：0级，无神经元死
亡；I级，散在神经元死亡；Ⅱ级，成片神经元死亡；
Ⅲ级，几乎全部的神经元死亡。同时进行幸存神经元
(神经元形态结构基本正常，无核固缩，核仁清晰)计
数，每片于每侧相应部位取3个视野，每只小鼠重复
5次，共15个视野分别计数，累加取均值，即为每只
小鼠样本幸存神经元密度值，每组制作12只动物的
切片，其均值为每组小鼠幸存神经元密度值。
1．5SOD活性和MDA测定；按SOD和MDA试
剂盒的方法用紫外分光光度计测定。
1．6 RT—PCR检测XIAPmRNA的表达：脑组织
RNA提取：按试剂盒提供的方法提取RNA并检测
总RNA质量。反转录聚合酶链反应(RT—PCR)扩
增RNA：从1弘g总RNA合成单链cDNA。XIAP
和p-actincDNA以特异引物用一步法RT—PCR
试剂盒扩增。采用的正反引物(由上海生工公司
合成)pactin：5，-TGCCCATCTATGAGGGGTA—
CG一3’；5t_TAGAAGCATTTGCGAGGCTACG一37；
XIApE8]：57一TCTGGTGTGAGTTCTGATAGG一3’；
5-TGGATACCACTTAGCATGCTG一3’。XIAP的
cDNA合成和PCR的条件为：1×(50℃，30rain；
94℃，2min)；36×(94℃，30s；．50℃，30s；
72℃，1min)f1×(72℃，5rain)。paetin的
cDNA合成和PCR的条件为：1×(94℃、3min)；
30×(94℃、1min，59．5℃、1min，72℃、1min)；
1×(72℃、1rain)；1×(72℃、10min)。PCR结果
1．5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相，DNA
条带用QuantityOne凝胶分析软件进行半定量
分析。
1．7统计方法：本实验所有数据表示为X士s，各组实
验数据用One—WayANOVA分析后，进行t检验。
2结果
2．1 对脑缺血再灌注小鼠海马CAl区锥体细胞形
态的影响：HE染色表明，假手术组海马CAl区锥
体细胞层次排列整齐，细胞形态规则，未见明显缺血
损伤；模型组小鼠海马CAl区锥体细胞稀疏，排列
紊乱细胞体积缩小，细胞轮廓消失，可见细胞吸收后
遗留的空泡等一系列死亡的表现。脑缺血再灌注48
h后，海马CAl区大量神经元均出现明显变性，幸
存神经元显著减少，组织学分极显著提高。银杏叶提
取物和地塞米松治疗后，细胞层次紊乱程度降低，神
经细胞形态尚规则，死亡细胞明显减少。结果见
表1。银杏叶提取物可提高海马CAl区神经元的缺
血耐受性，使脑缺血诱发的迟发性神经元死亡减轻。
2．2 对脑缺血再灌注小鼠脑SOD活性和MDA
水平的影响：脑缺血再灌注后，脑组织SOD活性显
著降低，而MDA水平显著升高；银杏升提取物和地
塞米松可显著提高小鼠脑SOD活性，降低MDA
水平。结果见表2。
表1 银杏叶提取物对脑缺血再灌注小鼠海马CAl区
神经元密度和组织学等级的影响
Table1 EffectofextractfromG．b／／obaleavesonneuronal
densityandhistologicalgradeinhlppocampusCAl
ofcerebralischemia-reperfusionmice
与假手术组比较；04P<0．01
与模型组比较：’P
MDA水平的影响(；士s，拜=12)
TaMe2 Ef譬∞tofextractfromG．bilobaleavesonSoD
acHvltyandMDAlevelInbrainofcerebral
lschemia—reperfusionmice( 士s，辟=12)
与模型组比较：’P
响：缺血再灌注48h后，小鼠海马细胞凋亡蛋白抑
万方数据
·1866· 中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
制剂XIAPmRNA的表达显著下调，降低了
58．72％。银杏叶提取物和地塞米松均可逆转XIAP
mRNA的下调，与模型组相比，低、中、高剂量的银
杏叶提取物和地塞米松分别使XIAPmRNA表达
上调49．22％、57．14％、58．02％、53．99％。见图1。
l一假手术组2一模型组3一地塞米松组4～6一银杏叶提取物5、
20、40mg／kg组与假手术组比较：44P<0．01与模型组比
较：一P<0．01A—XIAPmRNA表达的RT—PCR和凝胶电泳
B-XIAPmRNA表达条带密度值的半定量分析(；士s，n=lZ)
I-Shamgroup2-modelgroup3-Dexamethasonegroup
4--6-extractfromG．bilobale ves5，20。40mg／kggroups
44P
electrophoresisB-semi—quantificationanalysisofbandintensity
ofXIAPmRNAexpression6士j。n=lZ)
圈1银杏叶提取物对脑缺血再灌注小鼠脑组织
XIAPmRNA裹达的影响
Fig．1EffectofextractfromG．bilobale ves
011expressionofXIAPmRNAInbrain
ofcerebralischemiareperfusionmice
3讨论 、
大量的研究表明，细胞凋亡参与缺血引起的神
经细胞死亡过程。脑缺血时，缺血中心区细胞快速发
生坏死，半影区则主要以凋亡的机制发生迟缓性细
胞死亡[8]。本实验结果表明，脑缺血再灌注诱发小鼠
海马CAl区神经细胞形态发生严重变性，幸存神经
元减少。已有的研究表明，再灌注可导致进一步的脑
损伤，这种再灌注的损伤机制，与氧自由基的生成密
切相关[9]。组织中的SOD是机体清除自由基的主要
抗氧化酶，能减少氧自由基和过氧化脂质的生成。因
此，脑组织和细胞中SOD活性的高低可反映机体
清除自由基的能力，而过氧化脂质的分解终产物
MDA的水平则可反映组织细胞受自由基损伤的程
度[10。。本研究发现，重复脑缺血再灌注模型小鼠脑
组织SoD活性的显著下降、MDA水平的显著升
高，提示脑缺血再灌注损伤与脑细胞对自由基的清
除能力下降导致过氧化损伤有密切关系。因此，阻止
自由基形成，阻断脂质过氧化反应是减轻脑缺血再
灌注损伤的有效途径之一。
自由基可攻击细胞膜的不饱和脂肪酸，诱发氧
化反应，产生过氧化脂质，从而损害细胞膜、细胞器
和酶的功能，使DNA发生突变、交联、单链断裂等
结构和功能变化，影响信息传递、转录和复制，从而
干扰能量代谢或与细胞因子相互作用或通过
cGMP／非cGMP依赖方式作用于细胞凋亡基因，启
动凋亡程序诱导细胞凋亡[I¨。半胱氮酸蛋白酶
caspases是最重要的细胞凋亡基因，它是细胞凋亡
通路中最后的凋亡执行者[12‘。但各种caspases的活
性可被凋亡蛋白抑制辩(1APs)家族抑制而阻止凋
亡的发生[1引。X1AP是新近发现的凋亡蛋白抑制剂
家族(IAPs)成员，可抑制多种刺激引起的细胞凋
亡[5]。已有实验证明，XIAP可通过抑制caspases激
活而阻止凋亡的发生[5]。在本实验中，发现脑缺血再
灌注后XIAPmRNA的表达大幅度下调。由此可以
看出，XIAP是干涉脑缺血再灌注后神经元损伤发
展的一个重要因子，相对较高水平的XIAP表达有
助于缺血后神经细胞的存活，抑制脑内神经元的凋
亡，所以，XIAP表达的逐渐下调很可能是脑缺血再
灌注诱发的迟发性神经元损伤的原因之一。
银杏叶提取物是一种黄酮类物质，以往的研究
发现银杏叶提取物能抑制神经元凋亡，具有明显的
脑保护作用[14。。本实验进一步证实了这一观点。以
地塞米松为阳性药物对照，银杏叶提取物干预脑缺
血后，CAl区幸存神经元显著增多，细胞松散程度
有所减轻，SOD活性提高，同时还观察到XIAP
mRNA表达显著上调，且其上调幅度与银杏叶提取
物成剂量依赖性。这说明银杏叶提取物对脑缺血损
伤有较明显的保护作用j本实验结果显示，SOD的
活性增强，氧自由基减少，从而使XIAPmRNA表
达上调可能是银杏叶提取物抗脑缺血再灌注损伤的
分子机制之一。由此推测，银杏叶提取物可能通过减
少自由基的生成，减缓脑缺血诱导的XIAPmRNA
表达下调，减轻神经细胞变性，从而阻止细胞凋亡，
对缺血的脑组织起到保护作用。
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天麻素对酸中毒诱导的大鼠海马神经元损伤的保护作用
曾祥慧，葛亚坤，严 明，郑筱祥。
(浙江大学生物医学工程与仪器科学学院，浙江杭州 310027)
脑组织pH值下降、酸中毒是很多疾病如脑外
伤、癫痫、脑中风的病理现象，也是导致神经元损伤
的主要致病因素[1’2]。天麻素是天麻的主要有效成
分，具有抗谷氨酸兴奋性毒性和氧自由基损伤作
用口“]，并且广泛用于神经系统疾病的治疗。近年来，
对天麻素的药理作用展开了广泛的研究，如抗血管
性痴呆、抗神经衰弱、抗癫痫等作用。本实验采用原
代培养的大鼠海马神经细胞，建立酸中毒细胞模型，
观察天麻素对酸性环境下海马神经元的影响，为该
药更好的临床应用提供进一步的理论基础。
1材料
1．1 动物：新生SD大鼠(1日龄)，由浙江省医学
科学院动物中心提供，动物合格证号：SCXK(浙)
2003—0001。
1．2药品与试剂：天麻素(质量分数99．6％)，由昆
明制药集团有限公司提供；阿米洛利(中国药品生物
制品检定所)；Fluo一3／AM(MolecularProbe，美
国)；PI染料(Caltag，美国)；胰蛋白酶(Amresco
公司，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公
司)；DEME培养基(Gibco，美国)；Neurobasal培
养液及B27补充物(Gibco，美国)。
1．3仪器：FACSort流式细胞仪，美国BD公司产
品；Zeiss510型激光共聚焦显微镜，德国Zeiss公司
产品；inoLabLevel1pH计，德国WTW公司产品；
BB5060型C02恒温培养箱为德国Heraeus公司
产品。
2方法
2．1 海马神经细胞原代培养：取1日龄SD大鼠，
处死后无菌条件分离出海马组织，剪碎后加入
0．25％胰蛋白酶液，37℃振荡消化20min，1000
r／rain离心10min，收集细胞，用DMEM完全培养
液(含10％胎牛血清)重新悬浮后，以2×105／cm2
将海马细胞分别接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培
养板和培养皿内。置37℃、5％CO。、饱和湿度的培
养箱内培养，12h细胞贴壁后DMEM完全培养液
换为Neurobasal培养液(加2％B27补充物、0．5
mmol／L谷氨酰胺、50U／mL青霉素、50yg／mL链
霉素)。以接种当天为培养第1天，至培养第3天加
入终浓度为3,umol／L的阿糖胞苷以抑制非神经细
胞的增殖，培养9d后用于各项实验。
收稿日期；2007-04-25
作者简介：曾祥慧(1976一)，男，江西省南康市人，博士研究生，研究方向为抗心脑血管疾病药物及抗肿瘤药物筛选与评价。
E—mail：zeng89@hotmail．com
*通讯作者郑被祥T。el：(0571)87951091E—mail；ZXX@mail．bme．zju．edu．cn
万方数据
银杏叶提取物对缺血再灌注小鼠脑细胞凋亡的保护作用
作者： 洪森荣， 尹明华， HONG Sen-rong， YIN Ming-hua
作者单位： 上饶师范学院,江西,上饶,334001
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(12)
被引用次数： 9次
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