全 文 ：·1450· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
化合物Ⅵ：白色固体，易溶于氯仿，ESI～TOFMS
优／2：333[M+H]+，355[M+Na]+；1H—NMR(CD—
C13，500MHz)艿：3．61(1H，m，H一3)，3．66(1H，m，
H一12)，6．98(1H，brs，H一16)，0．88(3H，s，H一18)，
0．86(3H，s，H一19)，2．39(3H，s，H一21)。”C—NMR
(CDCl3，125MHz)艿：36．7(t，C一1)，31．5(t，C一2)，
71．2(tt，C～3)，38．0(t，C一4)，44．9(d，C一5)，28．5(t，
C一6)，31．3(t，C一7)，32．6(d，C一8)，53．2(d，C一9)，
35．6(s，C～10)，29．3(t，C一11)，73．7(d，C一12)，52．1
(s，C一13)，54．1(d，C一14)，32．2(t，C一15)；149．8(d，
C一16)，155．5(s，C一17)，11．7(q，C一18)，12．1(q，C一
19)，199．0(s，C一20)，26．7(q，C一21)。根据1H—NMR、
13C—NMR和2D—NMR以及参考文献数据‘16]，推断
化合物Ⅵ为3p，12p二羟基一孕烷一16一烯一20一酮。
化合物Ⅶ：白色固体，易溶于氯仿，ESI—TOFMS
m／z：333[M+H]+，355[M+Na]+；1H—NMR(CD—
C13，500MHz)艿：4．08(1H，in，H一3)，3．67(1H，m，
H—12)，6．99(1H，brs，H一16)，0．88(3H，s，H一18)，
0．84(3H，s，H一19)，2．39(3H，s，H一21)。13C—NMR
(CDCl3，125MHz)艿：35．7(t，C一1)，29．1(t，C一2)，
66．5(d，C一3)，31．9(t，C一4)，39．2(d，C一5)，28．3(t，
C一6)，31．3(t，C一7)，32．6(d，C一8)，53．2(d，C一9)，
36．2(s，C一10)，29．4(t，C一11)，73．7(d，C—12)，52．1
(s，C一13)，54．1(d，C一14)，32．1(t，C—15)，149．9(d，
C一16)，155．5(s，C一17)，11．0(q，C一18)，11．7(q，C一
19)，199．1(s，C一20)，26．7(q，C一21)。与化合物Ⅵ对
照，”C—NMR谱C一3信号从艿71．2位移至艿66．5，
其他数据基本一致，所以确定化合物Ⅶ为3a，128一二
羟基一孕烷一16一烯一20一酮。
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苦瓜子蛋白分离纯化及其理化性质鉴定
李 碌，温博贵。，陈爱云，陈玮莹，吴健宜，李冠武
(汕头大学医学院病理系肿瘤分子生物学研究室，广东汕头 515041)
摘 要：目的 建立苦瓜子蛋白分离纯化的方法。方法 应甩阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱Hiprep16／lo
收稿日期：2006—03—30
基金项目：广东省教育厅自然科学研究项目(Z02041)
作者简介：李琛(1972一)，山西人，博士，主要从事肿瘤分子生物学研究。
*通讯作者温博贵Tel：(0754)．8900473E—mail：bgwen@stu．edu．cn
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1451·
SOURCE30S和HiLoad26／60Superdex75预装柱从苦瓜种仁中分离纯化苦瓜子蛋白。结果分离纯化出14个
组分的苦瓜子蛋白，它们均为碱性蛋白质，相对分子质量在(1．3～2．9)×104，等电点在9．3～9．6。结论应用本法
能获得供生物活性研究用苦瓜子蛋白组分。
关键词：苦瓜；蛋白组分；纯化
中图分类号：R284．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)10—1450—05
Separationandpurificationofpr teinsinseedsofMomordicachar ntia
andidentificationOftheirphysicochemicalcharacters
LIJing，WENBo—gui，CHENAi—yun，CHENWei—ying，WUJian—yi，L1Guan—wu
(LaboratoryforMolecularBiologyfTumor，DepartmentofPathology，MedicalCollegeofShantouUniversity，
Shantou515041，China)
．Abstract：ObjectiveAmethodwasdevelopedfortheisolationandpurificationofproteinsnthe
seedsofMomordicacharantia．MethodsTheproteinswereisolatedanpurifiedfromtheseedsofM．
charantiabyaprocedureinvolvingextractingwithacetonesanda eriesofchromatographiesonHipr p16／
10SOURCE30SandHiLoad26／60Superdex75．ResultsFourteenproteinfractionswerepurifiedfrom
theseedsofM．charantia．Theyareallbasicproteinswiththemoleculeweightrange(1．3—2．9)×104and
isoelectricpointrange9．3——9．6．ConclusionThebioactiveproteinscanbepurifiedromtheseedsofM．
charantiabyaprocedureinvolvingextractingwithacetonea daseriesofchromatographiesonHipr p16／
10SOURCE30SandHiLoad26／60Superdex75．
Keywords：MomordicacharantiaL．；proteinfractions；purification
苦瓜Momordicachar ntiaL．为葫芦科苦瓜属
一年生草质藤本植物，性味苦寒，具有清热解毒、滋
养强壮等功效，成熟果实常作蔬菜食用，在我国、．东
南亚、土耳其等地均有广泛的栽种和药用历史。土耳
其人自古以来应用苦瓜疗伤和治疗消化性溃疡[1]，
印第安人也有应用苦瓜治疗疟疾等传染性疾病的历
史[纠。国内外大量研究证实，苦瓜具有抗感染[2“]、
降血糖‘5~7。、抗肿瘤[8～101和抗HIV病毒Ell,123的功
效。苦瓜因其潜在的药用价值日益引起国内外学者
的关注，人们期望从苦瓜中提取有效的生物活性物
质以用于治疗肿瘤、糖尿病和艾滋病。
本实验应用阳离子交换和凝胶过滤色谱对苦瓜
种仁蛋白的丙酮粗提物进行纯化，并对其基本理化
性质进行了鉴定。
1材料和方法
1．1 材料与试剂：新鲜苦瓜产自潮汕地区，葫芦科
苦瓜属一年生草质藤本植物。蛋白质标准品(相对分
子质量1．9×104～1．19×105)为MBI公司产品；丙
烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为BBI公司产品；甘氨酸、
SDS、Tris、过硫酸铵、TEMED为Amresco公司产
品；两性电解质(Ampholytes，pH3～10)和考马斯亮
蓝R250为Sigma公司产品；考马斯亮蓝G250购自
华美生物工程公司；牛血清白蛋白(BSA)为B．M公
司产品；NP一40为Fluka公司产品。
1．2仪器设备：AKTA蛋白质纯化仪购自Amer—
shamPharmaciaB otech公司；Hiprep16／10
SOURCE30S预装柱和HiLoad26／60Superdex75
预装柱购自PharmaciaBiotech公司；MAXI冻干机
购自Bio—Rad公司；GL一20B调整冷冻离心机为上
海安亭科学仪器厂产品；Bio—RadMini—proein皿
cell电泳槽；Bio—RADModelPower／PAC3000电
泳仪；DY600型中压电泳仪为汕头市广播仪器厂产
品；岛津UV一120—02紫外分光光度仪；Bio—Rad
UniversalHOODSN75S凝胶成像系统。
1．3苦瓜子蛋白的分离纯化
1．3．1丙酮沉淀苦瓜子蛋白：新鲜苦瓜子去壳取仁
后，称取湿重为250g的苦瓜种仁以预冷的500mL
0．85％NaCI(含2mmol／L巯基乙醇，1mmol／i。
PMSF)浸泡并机械捣烂，4℃放置过夜。离心(6000
r／min，10rain)，上清液以0．8倍体积的冷丙酮沉
淀，离心(6000r／min，10min)后取上清液再以1．2
倍体积的冷丙酮沉淀，离心(6000r／rain，30min)后
沉淀部分以双蒸水溶解，置于透析袋中4℃对双蒸
水透析24h，再对0．05mol／LNa2PO。(pH5．O)缓
冲液透析24h。
1．3．2阳离子交换色谱：取上述透析过的苦瓜子蛋
白丙酮粗提物上样于Hiprep16／10SOURCE30S
阳离子交换色谱柱，以0．05mol／LNaH2PO。(pH
万方数据
·1452· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
5．0)和0．05mol／LNa2HP04(pH9．0，含0．3mol／
I．NaCl)B液)做步进梯度洗脱，即0％～lo％B液
1个柱体积(cv)，10％～30％B液10CV，30％_
100％B液6CV，体积流量2mL／min。应用SDS—
PAGE电泳检测各洗脱组分，将相同的组分合并，聚
乙二醇浓缩，Bradford法测定蛋白质的量。
1．3．3凝胶过滤：将上述阳离子交换柱洗脱的苦瓜
子蛋白组分上样于HiLoad26／60Superdex75色谱
柱进行凝胶过滤，经0．05mol／I，磷酸缓冲液[含
0．1mol／LNaCI(pH6．8)]洗脱，体积流量2mL／
min。分别收集洗脱峰蛋白组分，SDS—PAGE电泳检
测各洗脱组分，将相同的组分合并，冷冻干燥。
1．4 SDS—PAGE测定苦瓜子蛋白质相对分子质
量：取苦瓜子蛋白丙酮粗提物、纯化各阶段的苦瓜子
蛋白样品和最后的纯化产物20弘I。(大约20肛g蛋
白)在15％分离胶上电泳，电压40V，电泳4h。凝胶
硝酸银染色，后经凝胶成像系统扫描储存，并计算苦
瓜子蛋白的表观相对分子质量。
1．5 等电聚焦法(IEF)测定苦瓜子蛋白的等电点
(pI)[13|：上样量为每管200弘g蛋白。
1．6苦瓜子蛋白的双向凝胶电泳：按文献方法[13。，
电泳条件为40V，4h。
2结果
苦瓜子蛋白丙酮粗提物经Hiprep16／10
SOURCE30S阳离子交换柱洗脱后，得到6个主要
的色谱峰(图1)，经SDS—PAGE显示，均为不均一
的蛋白质?昆合物。将上述阳离子交换柱洗脱蛋白质
组分分别在HiLoadSuperdex75柱上进行凝胶过
滤：(1)HPl经凝胶滤过后得到3个色谱峰。经SDS—
PAGE鉴定，峰HPl—751为不均一的蛋白质混合
物，含两个主要蛋白质成分，表观相对分子质量(下
同)分别为2．8×104、1．5×104，峰HPl—753显示为
均一蛋白质，相对分子质量为1．4×104。(2)HP2经
凝胶滤过后得到2个色谱峰，经SDS—PAGE鉴定，
峰HP2—751有两个主要蛋白质成分，相对分子质量
分别为2．9×104、1．5x104，其中2．9×104蛋白质
量远高于1．5×104蛋白质。峰HP2—752显示为均一
蛋白质，相对分子质量为1，5×104。(3)HP3经凝胶
滤过后得到3个色谱峰，峰HP3—751在SDS—PAGE
图谱中显示主要的3个蛋白质条带，其中量最多的
蛋白质成分相对分子质量为2．8×104，峰HP3—752
含有相对分子质量分别为2．9×104和1．4×104的
两个蛋白组分，峰HP3—753显示为均一蛋白质条
带，相对分子质量为1．5×104i(4)HP4经滤胶滤过
后得到1个色谱峰，经SDS—PAGE电泳，凝胶银染
在1．3×104处显示为一负染条带，考马斯亮蓝染色
则显示均一蛋白质条带，相对分子质量1．3×104，
可见此蛋白质为不嗜银的蛋白。(5)HP5经凝胶滤
过后得到3个色谱峰，在SDS—PAGE图谱中均显示
为均一蛋白质条带，相对分子质量分别为1．9×
104、2．2×104和1．4×104。(6)HP6经凝胶滤过后
也得到3个色谱峰，经SDS—PAGE鉴定，含有两个
蛋白质条带，相对分子质量分别为2．2×104和
1．8×104，HP6-752在SDS—PAGE图谱中显示为均
～蛋白质条带，相对分子质量为2．2×104，HP6—753
显示为两个蛋白质条带，相对分子质量分别为2．1×
104和1．3×104。
苦瓜子蛋白HP2—751和HP3—751在双向电泳
图谱中显示为单个斑点。应用等电聚焦(IEP)测定
了苦瓜子蛋白纯化所得9个组分的等电点(PI)，见
表1。
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图l Hiprep16／10SOURCE30S阳离子交换色谱图
Fig．1Hiprep16／10SOURCE30SChromatogramof
extractfromM．charantiaseedsbyacetone
表J苦瓜子蛋白组分的等电点
Table1 Isoelectricpointofproteinfractions
fromM．charantiaseeds
3讨论
直到目前为止，从苦瓜中分离的所有具有抗肿
瘤活性的蛋白质都属于I型核糖体失活蛋白，包括
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年lo月·1453·
MAP30、a—momorcharin、-momorcharin、mo—
mordin—I、momordin一Ⅲ、7一momorcharin均为单链
碱性蛋白质。纯化的方法多用丙酮分级沉淀、CM—
Sepharose离子交换色谱以及Sepharose6B—CL和
SephadexG一100凝胶过滤色谱。叶国杰等It4]应用丙
酮分级沉淀、CM—SephadexC一50离子交换色谱和
SephadexG一75凝胶过滤色谱法，从苦瓜子中分离
纯化了a—momorcharin和／3-momorcharin，测得它
们的相对分子质量分别为28625和29076，等电点
分别为9．10和9．32。齐文波等Ds]应用Sepharose
6B亲和色谱、CM一23离子交换色谱和SephadexG一
75凝胶过滤色谱亦得均一成分的a—momorcharin
和B—momorcharin，他们测得的n—momorcharin和
-momorcharin的等电点分别为8．9和9．1。Val—
bonesi等n6]应用S—Sepharose柱、SephadexG一50
柱、CM—Sepharose柱和RedSepharose柱成功分离
子momordinI和momordinⅡ。这些分离纯化苦
瓜蛋白的方法均应用了CM—Sepharose或CM—
SephadexC一50，为弱阳离子交换剂，虽然可以很好
地分离苦瓜蛋白，但是柱体积随着离子强度和pH
的变化而有很大的改变，每次纯化完毕后必须将柱
重装才能保证良好的柱效，这给实验带来了一定的
困难。
本实验选用Hiprep16／10SOURCE30S预装
柱，既具有很高的柱效，柱体积又不随离了强度和pH
值而发生变化，无须很高的离子强度(小于0．3mol／
LNaCl)即可使苦瓜子蛋白的丙酮粗提物得到很好
的分离。文献报道应用阳离子交换色谱分离苦瓜蛋白
均采用线性离子梯度洗脱[14““，发现在离子强度低
于30％B液(O．3mol／LNaCl)时，大部分苦瓜子蛋
白被洗脱下来，但是彼此重叠，因此引入了步进梯度
洗脱，使苦瓜子蛋白得到很好的分离。经Hiprep16／
10SOURCE30S阳离子交换色谱，得到6个主要的
色谱峰：HPl、HP2、HP3、HP4、HP5和HP6。经SDS—
PAGE鉴定，他们均为不均一的蛋白质混合物。进一
步将阳离子交换色谱得到的6个色谱峰分别在
HiLoad26／60Superdex75柱(分离蛋白质相对分子
质量范围3000～70ooo)上进行凝胶过滤色谱，最终
得到了14个蛋白质组分。其中HPl—753、HP2—752、
HP3—753、HP4、HP5—751、HP5—752、HP5—753和
HPL6—752均显示为单一蛋白条带，相对分子质量分
另0为：1．4×104、1．5×104、1．5×104、1．3×104、
1．9×104、2．2×104、1．4×104和2．2×104，测得它
们的等电点分别为：9．1(HP2—752)；9．4(HP3—753)；
9．3(HP4—751)；9．3(HP5—751)；9．3(HP5—753)；9．6
(HP6—752)。这些蛋白质的相对分子质量与等电点与
文献报道[I””]有所，不同，但它们均为碱性蛋白质。
HP2—751含有两个主要的蛋白质成分，相对分子质量
分别为2．9×104和1．5×104，但是以2．9×104蛋白
为主。HP3—751以2．8×104蛋白质量最多。等电聚
集测得其PI均为9．4，相对分子质量与文献报
道[14J5‘~20]的苦瓜蛋白a—momorcharin和7-mo—
morcharin类似，但是等电点略有不同，他们是否为
已知的苦瓜蛋白质尚需进一步纯化后，进行氨基酸序
列测定方可得知。本工作所纯化的苦瓜子蛋白，其抗
肿瘤活性组分的研究将另文发表。
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东北红豆杉针叶中两个双重排紫杉烷内酯化合物的结构鉴定
李力更1，涂光忠2，金怡珠2，曹聪梅1，张嫂丽1，史清文”
(1．河北医科大学药学院天然药物化学教研室，河北石家庄050017；2．北京微量化学研究所，北京100091)
摘 要：目的 研究东北红豆杉Taxuscuspidata针叶中的化学成分。方法采用硅胶柱色谱及制备薄层色谱法分
离、纯化化学成分，用一维和二维核磁共振技术鉴定化合物结构。结果从东北红豆杉针叶的甲醇提取物中分离出
两个罕见的双重排紫杉烷内酯类化合物wallifoliol(I)和tasumatrolH(m)。结论此两种化合物为首次从东北红
豆杉中分离得到，在氘代氯仿溶液中化合物1在室温下可以转化成5a一乙酰基一2a一苯甲酰氧基一4a，70，9a，13a，20一五
羟基一11(15—1)，11(10—9)双重排紫杉烷一11一烯一10，15一内酯(Ⅱ)。
关键词：东北红豆杉；紫杉科；双重排紫杉烷内酯
中图分类号：R284．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)10—1454一05
StructuralidentificatiOnOftwobisabeotaxanel ctonesfromneedlesofTaxuscuspidata
L1I。i—gen91，TUGuang—zhon92，JINYi—zhu2，CAOCong—meil，ZHANGMan—lil，SHIQing—wenl
(1．DepartmentofM dicinalNaturalProductChemistry，SchoolofPharmaceuticalSciences，HebeiMedicalUniversity，
Shijiazhuang050017，China；2．BeijingInst tuteofMicrochemistry，Beijing100091，China)
Abstract：ObjectiveTostudych micaIconstituentsfromtheneedlesofTaXltScuspidata．Methods
ChemicalconstituentswereisolatedbycolumnchromatographyandpreparativeTLC．Thestructureswere
identifiedonthebasisof1D—and2DNMRspectralanalyses．ResultsTWOrarebisabeotaxanel ctones
wereisolatedfromthemethanolextractofT．cuspidataneedles．q-、hestructureswereestablisheda 46-
acetoxy一2a—benzoyloxy一7B，9a，13a—trihydroxy一5，20一epoxy一11(15—1)，11(10—，9)bisabeotaxa一11一an一
10，15-lactone(wallifoli01)(I)and5a—acetoxy一2a—benzoyloxy一4a，76，9a，13a，20一pentahydroxy一11
(15—1)，11(10----9)bisabeotaxa一11一en一10，15-lactone(tasumatrolH)(Ⅲ)．ConelusionBothof hem
areisolatedfromthisplantforthefirsttime．CompoundI canbeconvertedinto20一acetoxy一2a—benzoy—
loxy一4a，5a，76，9a，13a—pentahydroxy一11(15—1)，11(10÷9)bisabeotaxa一11一an一10，15一lactone(Ⅱ)in
CDCl3solution，butitisstableinacetone-d6solutionatambienttemperature．
Keywords：TaxuscuspidataSieb．etZucc．；Taxaceae；bisabeotaxanelactones
由于紫杉醇对乳腺癌和卵巢癌的神奇疗效、独
特的抗癌机制、新颖的结构及有限的资源，引起全世
界的研究者对紫杉类化合物的强烈关注。尽管已有
超过400个紫杉烷类化合物报道[¨，但是紫杉醇的
生物合成途径目前仍未搞清楚，而且不断有新的紫
杉烷类化合物被分离得到‘2～3。东北红豆杉Taxus
收稿日期：2006—03—26
基金项目：教育部国家留学回国人员科委基金项目(2003AA22352)
作者简介：李力更(1963一)，男，河北唐山人，副教授，南开大学化学系毕业，长期从事天然药物化学的教学、科研工作。
一*通讯作者史清文Tel：(0311)86265634E—mail：qing—wen@hotmail．com
万方数据
苦瓜子蛋白分离纯化及其理化性质鉴定
作者： 李璟， 温博贵， 陈爱云， 陈玮莹， 吴健宜， 李冠武， LI Jing， WEN Bo-gui， CHEN
Ai-yun， CHEN Wei-ying， WU Jian-yi， LI Guan-wu
作者单位： 汕头大学医学院,病理系肿瘤分子生物学研究室,广东,汕头,515041
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(10)
被引用次数： 3次

参考文献(20条)
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引证文献(3条)
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2011(6)
2.王集会.韩春超 苦瓜蛋白提取工艺的研究[期刊论文]-齐鲁药事 2009(1)
3.孔立华.朱新产 苦瓜果肉蛋白的纯化及抑制作用研究[期刊论文]-江西农业学报 2009(7)


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