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Advances in studies on tissue and cell culture in medicinal plants of Panax L.

人参属药用植物组织和细胞培养的研究进展



全 文 :·616· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
CRs、TLR2、TLR4、Dectin一1、甘露糖受体,但是由于多糖结
构的多样性和复杂性,可以想象,多糖受体也是多样的,今后
还会有更多的多糖受体被揭示。
多糖作用的信号转导机制也是今后研究的重要课题,其
研究策略将是以作用的受体为信号传人的起始点,以某种细
胞效应(如吞噬、趋化、合成或分泌细胞因子)为终点观测指
标,确定其中的信号转导通路。通过研究有望发现新的药物
作用靶点,为建立新的药物筛选模型提供信息。
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人参属药用植物组织和细胞培养的研究进展
陈巍1,高文远¨,贾伟2,段宏泉1,肖培根3
(1.天津大学药物科学与技术学院,天津300072;2.上海交通大学药学院,上海200030;
3.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京 100094)
摘 要:从愈伤组织的诱导及培养、试管苗再生、悬浮培养、反应器培养及转基因器官培养等5个方面介绍了人参
属药用植物组织与细胞培养的研究进展。日本和韩国已经分别实现了人参悬浮细胞和不定根培养的工业化;我国
尽管已经开发了人参愈伤组织的一些产品,但在人参属药用植物组织和细胞培养的工业化方面还有一段路要走。
关键词:人参属;组织培养;细胞培养;生物反应器
中图分类号:R282.21 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)04—0616—05
Advancesinstudiesontissueandcellcultureinmedicinalpl ntsofPanaxL.
CHENWeil,GAOWen—yuanl,JIAWei2,DUANHong—quanl,XIAOPei—gen3
(1.CollegeofPharmaceuticalScienceandTechnology,TianjinUn versity,Tianjin300072,China;2.SchoolofPharmacy,
收稿Et期:2004—06—11
*通讯作者Tel:(022)87401895E—mail:pharmgao@tju.edu.cn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·617·
ShanghaiJi oTongUniversity,Shanghai200030,China;3.InstituteofMedicinalPl nt,ChineseAcademy
ofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCo lege,Beijing100094,China)
Keywords:PanaxL.;tissuec lture;cellculture;bioreactor
人参属包括许多著名的药用植物,如人参Panaxgin—
sengC.A.Mey.、西洋参P.quinquefoliusL.、三七P.
pseudo—ginsengvar. otoginseng(Burkill)HooetTseng、竹
节参P.japonicusC.A.Mey.和珠子参P.japonicusC.
A.Meyervar.m幻oT(Burkill)C.Y.WuetK.M Feng
等。这些药用植物具有增强免疫力、抗疲劳、保护心肌细胞、
抑制细胞凋亡、抗肿瘤、健胃、抗炎、降糖、调脂等多种功效,
在人类保健和治疗上应用广泛。由于这些药用植物的大田栽
培周期较长,并且容易受气候、环境、栽培条件以及病虫害的
影响,长期供不应求,且价格较贵。为此,多年来进行了不断
的努力,采用组织和细胞培养的方法来解决部分人参属药用
植物的资源供应问题。本文对这些研究加以综述,为今后的
相关研究提供参考。
1愈伤组织的诱导与培养
早在1964年,罗士韦等就开始了人参愈伤组织的培养,
并获得了初步的成功;1974年Hang等对西洋参愈伤组织进
行了诱导和研究[1];1978年郑光植等利用三七的根茎诱导
出了愈伤组织。从此,对人参属药用植物愈伤组织的研究全
面开展起来。
1.1愈伤组织的诱导:迄今为止,人参属植物体各个部位,
如茎尖、茎段、皮层、花瓣、子叶等,都能成功诱导出愈伤组
织。但是不同种人参属植物以及同一植物的不同器官的诱导
条件不同,见表1。
表1人参属5种药用植物愈伤组织诱导时外植体的选择
Table1 Explantsusedincallusinductioninfive
kindsofmedicinalpl ntsofPanaxL.
植物 外植体
人参 根、茎、叶片、叶柄、花药、花丝、子房、果肉、原生质
体等,其中以根和茎作外植体最为常见
西洋参 根、花蕾、花药(主根切块或根块的中心部分和外层
部分愈伤组织诱导率较高,而花蕾或花药愈伤组
织诱导率较低)
三七 根、根块、叶、叶柄、花序、花蕾(其中茎、叶柄和叶的
诱导率最高;其次是花蕾和根块;根和根茎诱导
愈伤组织最低)
竹节参 花芽、茎、叶、根茎、根、须根
珠子参 叶柄
1.2培养基和培养条件:培养基的种类、植物生长调解剂、
光照、pH值、温度等对愈伤组织的诱导成功与否非常重要。
表2列出了人参等5种植物愈伤组织诱导的最佳培养基和
培养条件。
1.3诱导子的影响:周立刚等口1的实验表明,在培养基中分
别加入适当浓度的红花、人参和黑节草的寡糖素,均能影响
人参和西洋参愈伤组织的生长和皂苷的合成。
2试管苗的再生
人参、西洋参、三七和竹节参的试管苗都已获得,这使得
这些贵重药材的快速繁殖成为可能。人参、西洋参、三七和竹
节参的试管苗可以通过形态发生途径如胚胎发生,或器官发
生途径如不定芽的方式获得,培养基和培养条件见表3,4。
表2人参属5种药用植物愈伤组织诱导的
最佳培养基和培养条件
Table2 Optimalediaandconditionsncallusinduction
infivekindsofmedicinalpl ntsofPanaxL.
影响因素
人参 SH 2,4-D5 KT0.1 5.8抑制生长23士1
西洋参 MS2,4-D2.5 KT0.8 5.8色散光 23~27
三七 MS2,4-D2~3KT0.7 5.8促进生长 26
竹节参 B5NAA3 6-BA0.1 5.8促进生长25土2
珠子参 MSNAA2 KT0.1 5.8抑制生长2l土1
对于西洋参来说,将MS培养基中的MgS04·4H20含量由370
mg/L降低到92.5mg/L,可使愈伤组织生长速度提高1.33%Eli
Callusgrowthratewasimproved1.33%whenMgS04·4H20
wasdecreasedto92.5mg/Lfrom370mg/LinMSmediumintissue
cultureofP.quinquefoliumE1]
表3人参属4种药用植物胚胎诱导和分化的
培养基和培养条件
Table3 Mediaandconditionsforsomaticembryogenesis
infourkindsofmedicinalpl ntsofPanaxL.
3细胞悬浮培养
与固体培养相比,细胞悬浮培养具有增殖速度快、培养
规模大、提供大规模的均一培养物等优点,因此,也是人参属
药用植物组织培养的研究重点。
3.1碳源的影响:当培养基中蔗糖的质量浓度从20g/L增
加到40g/L时,三七细胞的干重从8.9g/L增加到11.9g/
L;过高质量浓度蔗糖(60g/L以上)抑制三七细胞的生长,
但有利于三七细胞中人参皂苷的合成;在培养过程中对糖进
行适当的补充,可以使三七细胞中人参皂苷的产量提高口]。
人参细胞培养时,当蔗糖的质量浓度为30g/L、接种量为干
重3g/L时,在培养的第26天,人参细胞的产率最高,为
83%;高质量浓度的蔗糖(60~80g/L)有利于人参皂苷的合
成,当蔗糖质量浓度为60g/L、接种量为6g/L时,人参皂苷
的产量最高,为275mg/LHj。
万方数据
·618· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
3.2氮源的影响:在各种营养物质中,氮源对人参和西洋参
培养细胞中人参皂苷和人参多糖产量的影响最大。在250
mL摇瓶培养中,当氮源的总浓度为60mmol/L时,人参和
西洋参的生长速率和细胞的生物量随No。一/NH。+的值对人
参皂苷和人参多糖的合成也有影响;当只用NO。一作氮源时,
西洋参中人参皂苷和人参多糖产量最大。如果NH。+初始浓
度高于20mmol/L,人参细胞的生长就会受到抑制;当氮源
的浓度在5~20mmol/L(N03一或NO。:NH4+一2:1)时,
人参中人参皂苷的产量相对较高[5~7]。
3.3磷源的影响:无机磷酸盐对人参、西洋参细胞生长以及
人参皂苷、人参多糖产量有显著影响。当无机磷酸盐的浓度
分别为1.04、0.65mmol/L时,人参和西洋参细胞的生长最
佳;当培养基中磷的浓度为0.42mmol/L时,人参细胞中人
参皂苷和人参多糖产量最高,分别为643mg/L、2.18g/L;当
培养基中磷的浓度为1.25mmol/L时,西洋参细胞中人参皂
苷和人参多糖的产量最高,分别为960mg/L、1.8g/L[8]。
3.4金属离子的影响:研究表明,K+的初始浓度和活性物质
生物量的积累呈线性关系。细胞消耗的K+取决于培养基中
初始K+浓度,并和对N源的消耗呈线性关系。K+的浓度对
人参多糖产量影响较小,但对人参皂苷产量的影响很大,在
20~80mmol/L内,增加K+的浓度可以显著的提高人参皂
苷的产量[9]。钟建江等[1阳研究了Cu2+对三七细胞生长及人
参皂苷和多糖的影响,结果发现,在摇瓶培养中,Cu”可以促
进三七细胞的生长,增加了人参皂苷和多糖的影响,结果发
现,在摇瓶培养中,Cu”可以促进三七细胞的生长,增加人参
皂苷和人参多糖的产量。当Cu2+的浓度为1.0tlmol/L时人
参多糖的含量和产量最高,分别为16.1%和1.26g/L;当
Cu2+的浓度为6.0txmol/L时,人参皂苷(65.5mg/L和0.04
g/g)和人参多糖(62.6mg/L和0.041g/g)的产量和产率最
高。当MS培养基中Cu2+浓度为1ttmol/L、磷浓度为3.75
mmol/L、蔗糖浓度为50g/L时,三七细胞的培养效果较佳。
3.5诱导子的影响:诱导子是能够诱导植物细胞发生一种
或几种反应,并形成特征性自身防御反应的分子。它可以通
过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力或活化次生代谢途
径中特定酶基因,诱导新酶的形成,引起次生代谢途径通量
和反应速率的改变,从而提高次生代谢产物的产量。诱导子
的应用有时可以大大促进次生代谢产物的合成,许多学者在
人参属药用植物细胞悬浮培养过程中对诱导子的应用做了
尝试(表5)。
表5 人参属3种药用植物细胞悬浮培养中诱导子的应用
Table5 Elicitorutilizationincellsuspensionculture
inthreekindsofmedicinalpl ntsofPanaxL
3.6其他因素的影响:周立刚等[171从工艺学的角度研究了
西洋参悬浮细胞培养的影响因素,结果表明,适合于细胞悬
浮培养的培养液的体积为三角瓶总体积的1/5到2/5,渗透
压增大可以显著地提高细胞中人参皂苷的含量,但会抑制西
洋参细胞的生长。张以恒等[18,x9]对三七的高密度培养进行了
研究,发现接种量对产物的形成有一定的影响,但对细胞增
数的影响更大;在摇瓶培养中采用12层纱布比棉花塞更有
利于氧的供应;在培养过程中适当补料可以增加三七细胞中
人参皂苷和人参多糖的产量。
4反应器培养
植物细胞的反应器培养是实现工业化生产的前提。人参
细胞的工业化大规模培养早在20世纪80年代已经在El本
实现,在此基础上,人参不定根的大规模反应器培养也于近
年在韩国投产n“。
.1常用的反应器:对于人参属药用植物来说,常用的生物
反应器有机械搅拌式和空气提升式2种。现在有一种新型的
搅拌反应器——离心叶轮式生物反应器已用于三七细胞的
高密度培养,其细胞产量和人参皂苷的产量比传统的涡轮式
反应器明显提高心⋯。
4.2影响反应器培养的因素
4.2.1培养基:Woragidbumrung等[21]研究发现,在1L的
同心管空气提升式生物反应器中,添加50%的改良MS培养
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·619·
基,三七的细胞干重、生长速率、人参皂苷和人参多糖的产量
比使用MS培养基高出很多。Hu等[223的研究发现,使用改良
MS培养基后,无论是在1L气泡柱反应器还是在同心管空
气提升式反应器中,三七细胞的密度、生物合成速率、人参多
糖和人参皂苷的产量和产率都比摇瓶培养中的高。
4.2.2pH值:当pH值稳定在5.8左右时,对于人参、西洋
参和三七来说,有利于细胞的生长和人参皂苷产量的提高。
4.2.3氧分压:在生物反应器中,氧分压21.3~29.3kPa是
三七细胞生长、人参皂苷和人参多糖合成的最佳范围。低浓
度的分压不适合三七细胞的生长,但过高的氧分压也会限制
三七细胞的生长、人参皂苷和人参多糖的产量[2“。
5毛状根和冠瘿瘤的培养
得用毛状根农杆菌的Ri的质粒转化人参细胞形成人参
毛状根和利用土壤农杆菌的Ti质粒转化西洋参细胞形成冠
瘿瘤,都已取得了成功。
5.1人参毛状根培养:人参毛状根中含有Ri质粒,其中有
一段TL—DNA片段,它包含rolA、rolB和rolC3个基因,其中
rolA、rolB基因对毛状根中人参皂苷产量的影响很小,而
rolC基因对人参毛状根中人参皂苷的产量的提高具有重要
作用[2“。实验证明,人参毛状根具有可以在无激素的培养基
上快速生长、拥有亲本植物的次生代谢途径、遗传稳定、生长
迅速等特点。
5.1.1不同菌株的影响:Shu等[25]分别利用毛状根农杆菌
ATCCl5834和MAFF03—01724感染人参的叶柄形成毛状
根。结果发现,毛状根农杆菌ATCCl5834形成的毛状根中人
参皂苷的产量高于毛状根农杆菌MAFF03—01724形成的人
参毛状根。
5.1.2培养条件的影响:对于毛状根农杆菌ATCCl5834转
化成的毛状根来说,在不含植物激素的B。液体培养基中生
长最好;在half—macro—sah加强B。培养基中,人参皂苷的产
量最高[2⋯。对于毛状根农杆菌KTCT2744转化的毛状根来
说,以不含植物激素、pH值为5.8、蔗糖浓度为3%的1/2MS
培养基为基本培养基,氮源的浓度为30mmol/L,磷酸盐的
浓度为0.62mmol/L,在23℃下培养,其生长情况最好。当
接种量为0.4%时,其生长速率最高[z⋯。
5.1.3人参毛状根的反应器培养:在各种反应器中,波浪式
反应器最利于人参毛状根的生长,定期补充和更新培养基以
及长期培养可以提高人参毛状根的产率和合成人参皂苷的
能力[2⋯。Jeong等乜81的实验表明,在5L的生物反应器中,经
过39d的培养,毛状根的生物量是接种时的55倍;在19L
的生物反应器中,经过40d的培养,毛状根的生物量是接种
时的38倍。
5.2西洋参冠瘿瘤培养
5.2.1培养基的影响:西洋参冠瘿瘤在MS固体培养基上生长
量最大;在White培养基上人参皂苷Rb,合成量最大[2⋯。
5.2.2接种量的影响:接种量的多少对冠瘿瘤的生长有很
大的影响。西洋参接种量鲜重在2~6g/瓶时,对其生长有
利;接种量鲜重为6g/瓶时,人参皂苷产量较高‘2⋯。
5.2.3pH值的影响:当pH值为5.4时,西洋参冠瘿瘤生长
量最高;pH值为5.6时,西洋参冠瘿瘤在无激素的MS培养
基上人参皂苷的合成能力最强,人参皂苷Rb。的含量明显高
于其他pH值下的含量‘2⋯。
5.2.4肌醇的影响:在无激素的MS培养基内附加不同浓
度的肌醇对细胞生长及人参皂苷Rb。积累影响显著。肌醇质
量浓度为0.05g/L时,明显促进人参皂苷Rb。的积累,浓度
过高或过低,都将抑制人参皂苷Rb。的积累。肌醇质量浓度
为0.10g/L时,有利于冠瘿瘤的生长[2⋯。
6结语
综上所述,人参属药用植物的组织和细胞培养研究比较
深入,涉及了组织和细胞培养的各个方面。更为重要的是,日
本和韩国已经在人参悬浮细胞和不定根培养的工业化方面
取得了成功。我国已经有通过人参愈伤组织培养开发的产
品,如丁佳宜系列化妆品等,但我国在人参属药用植物组织
和细胞培养的工业化方面还没有成功,这与我国对该属药用
植物的大量利用很不相称。相关学科应联合攻关,共同推进
这项事业的进步。
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中药炮制的现状浅析
邹节明,王力生
(桂林三金药业股份有限公司,广西桂林541004)
摘要:随着人们的中药用药习惯由传统汤剂向现代中成药转变,以及中药由行业垄断环境进入与西药激烈竞争
的市场环境,中药炮制面临着严峻的考验。中药炮制在规范工艺、提高饮片的安全性、改善贮藏环境以及加强理论
与实践相结合方面均有大量的工作值得开展。
关键词:中药;炮制;现状
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2004)05—0620—04
SuperficialanalysisofChinesemateriamedicaprocessingstatus
ZOUJie—ming,WANGLi—sheng
(GuilinSa jinPharmaceuticalCo.,Ltd.,Guilin541004,China)
Keywords:Chinesemateriam dica;processing;status
中药炮制是一门传统的制药技术。从古人将天然药物洗
除泥沙,发展到40多种炮制方法和系统的炮制理论,集结了
数代医药学家的聪明智慧。从《黄帝内经》到《雷公炮炙论》,
再到《本草纲目》,中华民族在中医药领域取得的成就一直位
居世界医药先进水平之列,中药炮制技术也就成为体现该历
史时期中药制药技术先进性的代名词。宋代沈括在《苏沈良
方》一书中记载了用皂角自小便中提炼秋石的方法,被认为
是我国提炼激素的开始。明代陈嘉谟在《本草蒙筌》中“五倍
子”项下介绍的没食子酸的制法,比瑞典药学家舍勒制备没
食子酸的工作早200余年。
收稿日期:2004—12—13
作者简介:邹节明(1943一),湖南常德人,教授级高级工程师,博士生导师,主要从事中药新药研究与开发工作。
万方数据
人参属药用植物组织和细胞培养的研究进展
作者: 陈巍, 高文远, 贾伟, 段宏泉, 肖培根, CHEN Wei, GAO Wen-yuan, JIA Wei,
DUAN Hong-quan, XIAO Pei-gen
作者单位: 陈巍,高文远,段宏泉,CHEN Wei,GAO Wen-yuan,DUAN Hong-quan(天津大学药物科学与技术学
院,天津,300072), 贾伟,JIA Wei(上海交通大学药学院,上海,200030), 肖培根,XIAO
Pei-gen(中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(4)
被引用次数: 11次

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