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Effect of ginseng polysaccharide on expression of GM-CSF,EPO,and their receptors in K562 cells

人参多糖对K562细胞人粒-巨噬细胞集落刺激因子和促红细胞生成素及其受体表达的影响



全 文 :·1526· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
家兔体内对小檗碱的药动学研究表明,小檗碱口服
能获得有效血药浓度并维持较长时间(AUC为
211.94tlg/mL,C。。。为25.2t』g/mL)[9’10。。本研究应
用裸鼠荷人鼻咽癌模型,ig给予小檗碱10、30和50
mg/kg,连续用药10d,其中30mg/kg剂量组的肿
瘤体积中位数明显低于对照组(P<0.05)。本结果
提示小檗碱口服可以达到有效抑瘤的血药浓度。
由于小檗碱的安全性较高,至今在临床上仍然
作为常用抗菌药物广泛应用。小檗碱的体内外抗肿
瘤活性研究为其单独或者联合其他抗肿瘤药物应用
到临床肿瘤化疗方案中提供可能性和理论依据。
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人参多糖对K562细胞人粒一巨噬细胞集落刺激因子和
促红细胞生成素及其受体表达的影响
陈地龙,李静,刘永刚,王亚平+,陈婷梅,郑敏,姜 蓉
(重庆医科大学基础医学院重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆400016)
摘要:目的研究人参多糖(GPS)对人红白血病细胞株(K562)表达人粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)、
促红细胞生成素(EPO)及其受体的影响。方法采用细胞体外培养技术,RT—PCR检测GPS诱导后K562细胞中
GM—CSF、EPOmRNA的表达、免疫细胞化学方法检测K562细胞经GPS作用后GM—CSF、EPO及其受体蛋白表
达的变化、Westernblotting检测GPS诱导后K562细胞GM—CSF、EPO受体蛋白的表达。结果经GPS诱导后,
RT-PCR检测显示K562细胞GM—CSFmRNA的表达有所增强,但与对照组相比无统计学意义,EPOmRNA的表
达有明显的降低;免疫细胞化学方法检测EPO与GM—CSF蛋白的表达明显减弱,EPO与GM—CSF受体蛋白的表
达明显增强;Westernblotting检测GM—CSF、EPO受体蛋白的表达增强。结论GPS既能抑制K562细胞分泌
GM—CSF、EPO,又能明显促进GM—CSF、EPO受体的合成和分泌。
关键词:人参多糖;K562;造血生长因子
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)10—1526—04
Effectofginsengpolysaccharideonexpr ssionofGM-CSF,EPO,
andtheirreceptorsinK562cells
CHENDi—long,LIJing,LIUYong—gang,WANGYa—ping,CHENTing—mei,
ZHENGMin,JIANGRung
(KeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPh macology,CollegeofBasicMedicine,
ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
收稿日期:2006—01—27
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670880);重庆市教委资助课题[渝教科(2001)12号]
作者简介:陈地龙(197l一),男,重庆万州人,博士,副研究员,研究方向为造血调控机制。
..Tel:(023)68485614E—mail:chendilong@21cn.conl
*通讯作者 王亚平Tel:(023)68485968
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbal.Drugs第37卷第10期:2006年10月、·1527·
Abstract:ObjectiveTostudyth ffecttofginsengpolysaccharide(GPS)onthexpressioofGM—
CSF,EPO,andtheirreceptorsinK562cells.MethodsT exPressionofGM—CSFandEPOmRNAin
K562cellsinducedbyGPSweredetectedbvRT—PCR.;theexpressionofGM—CSF,EPO,andtheir
receptorproteinsK562cellsinducedbvGPSweredetectedbyimmunocytochemistry,andthe
expressionsofGM—CSFandEPOreceptorproteininK562cellstreatedbvGPSwereobservedbyWestern
blotting.ResultsThexpressionofEPOmRNAwasweakened;theexpressionsofGM—CSFandEPO
weremuchweakerandthexpressionsoftheirreceptor‘prot6insweremuchtrongerinK562cellinduced
byGPS.ConclfisionGPSca otonlyinhibitK562cellssecretionofGM—CSFand.EPO。butalso
promotethesynthesesandsecretionofGM—CSF,EPO,andtheirreceptors.
Keywords:ginsengpolysaccharide(GPS);K562;hematopoieticgrowhfactor
人参是祖国传统医学的“补气”要药,有补气生
血之功效,人参多糖(Ginsengpolysaccharide,
GPS)是人参的主要成分之一。前期的研究[1~3]表明
GPS能促进正常血细胞生成,并能抑制白血病细胞
的增殖,但这种双相调控的机制尚不清楚。本实验在
前期研究的基础上,采用实验血液学技术,探讨
GPS对人红白血病细胞株(K562)表达人粒一巨噬
细胞集落刺激因子(GM—CSF)的促红细胞生成素
(EPO)及受体的影响,旨在阐述人参对血细胞发生
的调控机制,为研制开发天然中药分化诱导剂提供
理论与实验依据。
1材料
1.1 药品:GPS,重庆中药研究所提供,质量分数
98%,以RPMI一1640培养液配制成所需浓度,滤过
除菌。
1.2重组人粒一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—
CSF):购自北京北医联合生物工程公司,活性1X
107U/mg,RPMI一1640培养液稀释为1×104U/
mL。
1.3促红细胞生成素(EPO):美国Amgen公司产
品,活性105U/mL,RPMI一1640培养液稀释为100
U/mL。
1.4人红白血病细胞株(K562细胞):本校检验系
血液学实验室惠赠,在含10%小牛血清的RPMI一
1640培养液中常规培养,每2~3天换液传代。
1.5试剂:RPMI一1640培养基,美国Gibco公司产
品;小牛血清(BS),杭州四季青公司;大鼠抗人
EPO受体单克隆抗体,晶美生物工程有限公司产
品;大鼠抗人GM—CSF受体单克隆抗体,美国
Pharmingen公司产品;Trizol,鼎国生物公司产品;
逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP混合物、DNA聚
合酶,Takara产品;DAB试剂盒,北京中山生物技
术有限公司产品;K562细胞总RNA抽提试剂:
TrizolIsolationReagent,上海申能博彩生物科技有
限公司产品;逆转录合成cDNA相关的试剂:
MMLV第一链cDNA合成试剂盒,上海生工生物
工程技术服务有限公司;PCR扩增相关的试剂:
PCR扩增试剂盒,华宝生物工程有限公司;pUCl9
DNA相对分子质量标准(DNAMaker,成分:501/
498、404、331、242、190、147、111/110、67、34/34
bp):上海复华实业股份有限公司。
2 方法
2.1 GPS诱导后K562细胞GM—CSF、EP0
mRNA表达检测:取对数生长期的K562细胞进行
分组培养。对照组:常规培养;GPS组:培养体系中
加人GPS(本室既往的研究表明随着加入GPS质
量浓度的增加和培养时间的延长,对K562细胞的
增殖抑制作用越明显,根据MTT方法分析,确定
40t-g/mL为最适药物质量浓度[4]),每组设3个复
孔,置37℃、5%C0:的孵箱中培养,在培养第6天
取样,RT—PCR检测K562细胞中GM—CSF、
EPOmRNA表达。
2.1.1总RNA提取:所有器具均经DEPC浸泡处
理,并灭菌i取K562细胞,用DEPC处理过的冰冷
PBS洗涤2次;每1×106个细胞加入1mLTrizol,
Trizol法提取RNA,28S、18S两条带清晰,A260/
A280=1.840,RNA置于一70℃待用。
2.1.2逆转录反应(RT):从一70℃取出RNA
进行反应。参数:30℃、10min,42℃、30min,
99℃、5min,5℃、5min。
2.1.3PCR引物序列:EPO,上游引物:57
GGCCCTGTTGGTCAACTCT37,下游引物:57
CCGGAGGAAATTGGAGTAGAC37;GM—CSF,匕
游引物:57GAGCCGACCTGCCTACCAGA37,下游
引物:5
7
GCAGTCAAAGGGGATGACAAG37;参
数:94℃预变性5min,94℃、30S,55℃、30S,
72℃、1min,30次循环,72℃延伸10min。
2.2 GPS诱导后K562细胞GM—CSF、EPO及相
万方数据
·1528· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
关受体蛋白表达检测:取对数生长期的K562细胞
进行分组培养,对照组:常规培养;GPS组:培养体
系中加入GPS(终质量浓度为40pg/mL)。分别在
培养第3、6天取各组K562细胞,PBS洗涤后离心
甩片,以大鼠抗人EPO、GM—CSF、EPO受体、GM—
CSF受体单克隆抗体进行免疫细胞化学SP法染
色。图像分析仪计数每例300个细胞,计算阳性细
胞表达率。
2.3 Westernblotting法检测GPS诱导后K562
细胞胞浆中GM—CSF、EPO受体的表达:取对数生
长期的K562细胞进行分组培养。对照组:常规培
养;GPS组:培养体系中加入GPS(终质量浓度为
1、10、40、100ug/mI.)。分别在培养第6天收集
K562细胞。分别提取各组1×107个细胞的胞浆蛋
白和核蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,实验中求
得的直线回归方程为:y=36.112X一1.676(r=
0.996,y为蛋白量,X为吸光度值)。变性不连续
SDS—PAGE,然后将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶
转移至硝酸纤维素膜(电转移法),显现固定于硝酸
纤维素滤膜上的抗原,进行Westernblotting检测。
将晾干后的NC膜用MieroteeScanMakerE6系统
扫描,ImageMasterVDSoftware2.0测定各显色
条带的绝对吸光度(A)值,计算每弘g蛋白对应的
A值,结果以A值/,g蛋白表示。 L
2.4统计学处理:用SAS统计软件进行方差分析,
秩和检验等。
3 结果
3.1 GPS诱导后K562细胞GM—CSF、EPO
mRNA表达:GPS(40>g/mL)诱导K562细胞6
d,通过RT—PCR技术检测GM—CSF、EPOmRNA。
结果显示:与对照组相比,经GPS诱导后的K562
细胞,GM—CSFmRNA的表达有所增强,但与对照
组相比无统计学意义;EPOmRNA的表达有明显的
降低(P表l GPS对K562细胞GM—CSF和EPOmRNA表达
的影响(工士s,n一3)
Table1 EffectofGPSonexpressionofGM—CSFand
EPOmRNAinK562cells(z±S,n一3)
与对照组比较:’P<0.05
。P<0.05口5controlgroup
3.2 GPS诱导K562细胞GM—CSF、EPO蛋白表
达:GPS(40弘g/mL)诱导K562细胞3、6d,通过
免疫细胞化学检测EPO、GM—CSF的蛋白表达。结
果显示:与对照组相比,经GPS诱导后,K562细胞
的EPO与GM—CSF蛋白表达明显减弱(P<
0.01)。见表2。
表2 GPS对K562细胞EPO和GM—CSF及其受体蚤白
表达的影响(j±s,n=10)
Table2 EffectofGPSonexpressionofEPOand
GM—CSF,andtheirreceptorprotein
inK562cells(j±s,n=10)
组别
作用时问/
d
m性率似
EP0蛋白 GM—CSF蛋白
EPo
受体蛋白
GM.CSF
受体蛋白
与对照组比较:一P。’P<0.01uscontrolgroup
3.3 GPS诱导K562细胞后GM—CSF、EPO受体
蛋白的表达:GPS(40/19/mL)诱导K562细胞3、6
d,通过免疫细胞化学检测EPO及GM—CSF受体蛋
白表达。结果显示:与对照组相比,经GPS诱导后
K562细胞的EPO与GM—CSF受体蛋白表达明显
增强(P<0.01)。见表2。
GPS(1、10、40、100ptg/mL)诱导K562细胞6
d后,通过Westernblotting检测GM—CSF及EPO
受体蛋白。结果显示:与对照组相比,经10、40ug/
mLGPS诱导后的K562细胞胞浆中EPO受体蛋
白表达增强,但GPS的终质量浓度需达到100弘g/
mI。,GM—CSF受体蛋白的表达才明显增强。见表3。
表3 Westernblotting检测GPS对K562细胞胞浆
中蛋白GM—CSF和EPO受体蛋白表达的影响
(j士s,n一”
Table3 EffectofGPSonexpressionofGM—CSFand
EP0receptorproteininplasmaofK562cells
detectedbyWesternblotting(i士s,疗=3)
与对照组比较:‘P’P<0.05。。P<0.01口5controlgroup
4讨论
造血生长因子(hematopoieticgrowthfactor,
HGF)通过复杂的细胞因子网络,在造血调控中发
挥重要作用。现代血液学研究证明:HGF与造血细
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1529·
胞膜上相应的受体结合,启动造血调控信号的传导,
最终通过基因表达的产生调节细胞的增殖与分化。
髓系白血病是克隆性疾病,恶性祖细胞在其增殖及
自我更新的过程中也受HGF调控,但HGF在白血
病发病机制中的作用及在白血病临床应用方面尚有
不同观点[5’6]。HGF对大多数髓系白血病细胞具有
促增殖效应,而无明显诱导分化作用。早期认为
HGF在体内有两方面生物学作用[7]:(1)激活相应
的特异性受体产生一个有丝分裂信号,导致细胞增
殖;(2)通过对其他细胞刺激因子受体的调节而使其
激活,导致细胞分化成熟。某些白血病细胞株(如
K562)表达高亲和力的GM—CSF、白细胞介素3
(IL一3)受体。GM—CSF、EPO通过其受体引起信息
传递途径中某些蛋白激酶的酪氨酸和丝氨酸磷酸化
使细胞得以增殖,进一步的研究发现,对单位剂量生
长因子来说,细胞有高亲和力的HGF受体,并不一
定表示细胞对相应细胞生长因子产生增殖反应。
GPS是人参“补气生血”或促进血细胞发生的
有效成分之一。GPS能促进小鼠造血干/祖细胞的
增殖分化[8~3引。K562细胞与正常人多向性造血祖
细胞的生物学特征相似,既往的研究表明,GPS可
以诱导K562细胞向粒系、红系成熟方向分化[4],但
GPS诱导K562分化与造血生长因子及相关受体的
关系尚不清楚。
研究表明白血病细胞可以自分泌HGF,使其大
量增殖,而不能促进其诱导分化成熟。本实验结果显
示:GPS诱导K562细胞表达EPOmRNA的水平
与对照组相比有所降低,但对K562细胞表达GM—
CSFmRNA无明显影响;免疫细胞化学检测表明
GPS诱导K562细胞表达GM—CSF、EPO蛋白明显
降低,这提示GPS能从基因转录水平和蛋白表达水
平两个层次抑制K562细胞分泌GM—CSF、EPO
(HGF),从而抑制细胞的增殖。
HGF与其受体结合,启动_系列信号转导途径
是造血细胞分化成熟的关键,因此探讨HGF受体
的数量与活性可以反映GPS诱导白血病细胞分化
的分子机制。本研究结果表明:GPS诱导K562细胞
后,表达GM—CSF、EPO的受体均出现明显的增加,
这表明GPS能促进K562细胞表达GM—CSF、EPO
受体,这可能与GPS促进K562细胞向粒系、红系
细胞分化有着密切关系。
综上所述,GPS诱导K562细胞向成熟方向分
化,是通过抑制白血病细胞自分泌GM—CSF、EPO
等细胞因子以及促进其细胞因子受体的表达,而抑
制白血病细胞增殖,促进白血病细胞分化。推测
GPS是通过抑制K562细胞分泌细胞因子,但可促
进K562细胞表达有关细胞因子受体,细胞因子与
相关受体结合,激活信号转导途径,促进K562细胞
向成熟方向分化。
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作者单位: 重庆医科大学基础医学院,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆,400016
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2006,37(10)
被引用次数: 1次

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