全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·261·
3讨论
3．1覆膜既提高了土壤温度，又保存了土壤水分，
同时防止了雨水对土壤养分的淋溶，因此对当归的
株高、于物质积累都产生了较大的影响。特别是黑色
地膜覆盖将当归地上部分干物质迅速积累期延长了
10d左右，这对于增加植株的光合能力有重要意
义。而垄作和沟植虽然对株高没有产生明显的影响，
但是由于沟植能提高对雨水的集聚和利用，垄作能
接受更多的光照，增加光合作用面积，同时其土壤温
度也相对较高，因此这两个处理也对当归地上部分
产生了延缓衰老的作用，同时也增加了干物质在根
部的积累。
3．2 当归麻口病是影响当归产量和品质的一个重
要因素，有研究认为是由当归茎线虫引起的r8]i在土
壤中温度和湿度是影响线虫的重要因素，土壤的温、
湿度越高，线虫越活跃。垄作、黑色地膜覆盖、沟植可
能是因为对土壤温湿度及土壤结构产生了影响，抑
制了线虫的活动，表现出了一定的抗病性，但试验表
明各处理间的麻口病发病普遍率和病情指数无显著
差异，因此栽培方式对当归麻口病的影响还需做进
一步研究。
3．3试验表明，只要对传统的栽培技术进行改良均
能提高当归产量，尤其是全生育期覆黑色地膜的处
理，由于对地上部和根部当归干物质积累都产生了
有利影响，因此产量最高。据实地观察，用黑色地膜
覆盖的处理膜下行间不长杂草，这不仅对当归高产
有重要意义而且还节省了劳力和种植成本，因此，在
当归高产优质高效栽培中应大力推广黑色地膜覆盖
栽培技术。
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刺革菌科4种药用真菌的ITS区序列分析
曹小迎，蒋继宏+，孙 勇，陈凤美，刘 群
(徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州 221116)
摘 要：目的 对刺革菌科桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孑L菌及鲍姆木层孔菌4种药用真菌rDNAITS片段进
行分析，探讨该片段在中外同类真菌的系统学及鉴别研究意义。方法 对这4种药用真菌的rDNAITS区进行了
PCR扩增、测序，运用ClustalX、Mega3．1等软件对ITS区序列进行分析。结果获得rDNAITSl、ITS2和5．8S
rDNA完整序列，桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌、鲍姆木层孔菌的ITSl序列长度范围为244～324bp，ITS2
序列长度范围为229～274bp。以圆瘤孢多孔菌(DQ200923)为外类群，用分子进化遗传分析软件得到了包括这4
种药用真菌及GenBank中3个与这4种中3种相应真菌的ITS序列的系统发育树。这一分析结果与来自形态学的
鉴别结果相吻合。结论ITS序列可作为这4种药用真菌分子鉴定的依据。
关键词：刺革菌科；内转录间隔区；序列分析
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)02—0261—04
收稿日期：2006—04—11
基金项目：江苏省药用植物生物技术重点实验室开放课题(02AXLl2)
作者简介：曹小迎，女，江苏南通人，博士研究生，主要从事药用植物生物技术研究。
*通讯作者蒋继宏Tel：(0516)83403515Email：jhjiang@xznu．edu．cn
万方数据
·262· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
ITSequenceanalysisonfourfungiofHymenochaetaceae
CAOXiao—ying，JIANGJi—hong，SUNYong，CHENFeng—mei，LIUQun
(KeyLaboratoryofBiotechnologyforMedicinalPl ntofJiangsuProvince，XuzhouNormal
University，Xuzhou221116，China)
Abstract：ObjectiveToanalyzethrDNAITSsequencesOfInonotusobliquus．Phellinusrimosus，
Porodaedaleachrysoloma，andInonotusbaumii，andstu ytheutilitynphylogenesisandidentificationof
thesetrainsbetweenChinaandforeigncountries．MethodsTheITSgenefragmentsofthefourfungi
werePCRamplifiedandsequenced．TherDNAITSregionswereanalyzedbymeansofthesoftwareof
ClustalXandMega3．1．ResultsThentires quencesofrDNAITSl，ITS2，and5．8SrDNAwereob—
tained．ThesequencesofITSlinthesefourfungirangedfrom244to324bpinlengthandthoseofITS2
from229tO274bp．ThephylogenetierelationshipsoffoursequencedITSsequencestogetherwiththoseof
threes lectedfungiandBondarzewiamont na(DQ200923)downloadedfromGenBankwereconstructed，
B．montanawasdesignatedasoutgroup．Theanalysisresultwasconsistentwiththosefrommorphology．
ConclusionTheITSsequencecanbeusedtoidentifythemoleculeofthesefourmedicinalfungi．
Keywords：Hymenochaetaceae；internaltranscr bedspacers(ITS)；sequenceanalysis
木层孔菌属(PhellinusQu61．)和纤孔菌属(In—
onotHSKarst．em．Imaz．)，属于非褶菌目(Aphyl—
lophorales)的刺革菌科(Hymenochaetaceae)，是多
孔菌类中非常重要的两属。本研究中的4个种分别
为桦褐孑L蔚Inonotusbliquus(Fr．)Pilat、缝裂木层
孔菌Phellinusrimosus(Berk．)Pilat、松针层孔菌
Porodaedaleachrysoloma(Fr．)Fiasson&Niemela
和鲍姆木层孔菌I．baumii(Pilat)T．Wagner&
M．Fisch。分属刺革菌科的3个属。这4个种在属
的分类上一直很混乱，如松针层孑L菌，Donk于1971
年将它归为木层孔菌属u]，甚至到现在还有人这么
认为。但是在1984年和1989年FiassonE2]与Imaze—
ki∞1将它命名为Porodaedaleachrysoloma，并为大
多数人接受。而鲍姆木层孔菌自Pilat于1932年将
它命名为Phellinusba mii[4]，到现在还有人认为它
属于木层孔菌属。2002年Wagner等通过形态学结
合分子鉴定将它归为纡孑L菌属。5]。这4个真菌都属
于药用真菌，其中鲍姆木层孔菌和缝裂木层孔菌具
有抗氧化和游离基清除活性口’7]。缝裂木层孔菌还具
有抗肿瘤活性[8]。桦褐孔菌具有抗肿瘤DJ⋯、抗衰
老、增强免疫[11【、防治糖尿病等作用。而松针层孑L菌‘
主要用于治疗食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、
乳腺癌、子宫癌等。ITSl和ITS2是中度保守区域，
其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比
较明显。这个特点使ITS广泛应用于真菌物种的分
子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群问
的系统发育关系分析[12~15|。本实验报道了采自黑龙
江长自山桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孑L菌和鲍
姆木层孔菌的ITS序列及其相关分析。
1材料与方法
1．1材料来源：桦褐孔菌Inonotusobliquus、缝裂木
层孔菌Phellinusrimosus、松针层孔菌Poro—
daedaleachrysoloma和鲍姆木层孔菌Inonotusbau—
mZ4种药用真菌采自黑龙江长白山。经Prot．Mar
garitaA．Bondartseva鉴定。菌种由江苏省药用植
物生物技术重点实验室提供。
1．2 真菌总DNA的提取：称取0．5g液体培养基
培养的真菌菌丝体放于研钵中，用液氮速冻后，迅速
研磨成细粉，分装于1．5mI。Eppendorf管中；加入
1mLDNA提取缓冲液(500mmol／I。NaCl、100
mmol／LTris—C1pH8．0、2．0mmol／I。EDTApH
8．0)用力摇动使其充分混匀后，8000xg，15C离
心5min；弃上清液，重新加入1mI．DNA提取缓冲
液，充分混匀，8000×g，15C离心5min；弃卜清
液，加入1mL65C预热的DNA裂解缓冲液(700
mmol／I．NaCl、50mmol／I。Tris—CIpH8．0、20
mmol／LEDTApH8．0、5％CTAB、1％p巯基乙
醇)，悬浮沉淀，充分混匀，放人65C水浴30min，
不时颠倒混匀；12000×g，15C离心5min；取一k清
液，加入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混
匀至溶液呈乳浊状，静置15min；12000×譬，15(：
离心5min；取上清液，加入等体积的异丙醇，充分
混匀，4℃静置30min；12000×g，15C离心10
min；弃上清液，加入75％乙醇洗两次；】2000x譬，
15℃离心3min；弃上清液，自然风干直至无酒精
味；加入100肛LTE缓冲液，放在4C待用或一20
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·263·
℃储存。
1．3 ITS序列的扩增、纯化：PCR扩增反应在AB
公司的2400型PCR扩增仪上进行，反应体系为25
pI。，内含：双链DNA模板(约25ng)，MgCl。(25
mmol／I，)，dNTP(200／lmol／L)，正反引物(5
7
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’，5
7
TC—
CTCC—GCTTATTGATATGC37)2／1mol／L，Taq
DNA聚合酶(15U)，10×PCRBuffer(100mmol／L
TrisHClpH8．3，500mmol／LKCl，0．01％
gelatin)。扩增反应程序：95℃预变性3rain；95℃
变性1rain，55℃退火1rain，72。C延伸90S，循环
35次；72C延伸7rain。ITS扩增产物电泳后用上
海华舜生物工程有限公司生产的胶回收试剂盒回收
纯化。
科其他真菌的相关序列确定。测定的DNA序列用
ClustalX软件进行对位排列。并用分子进化遗传分
析软件(MEGAversion3．1)构建分子系统树。
2结果与分析
2．1 刺革菌科4个种的ITS序列的长度和G+C
的量：本试验所测样品的ITS序列已登陆GenBank
(注册登记号见表1)。测得的片段包括ITSl，5．8S
和ITS2全长序列以及18S，26S部分序列，长度为
677～780bp。从图1和表1可见：4种药用真菌的
ITSl长度在244～324bp，最大相差80bp，平均约
为292bp，5．8SrRNA均为147bp，且完全一致，说
明该区比较保守；ITS2长度在229～274bp，最大相
差45bp，平均长度约为254bp。
2．2刺革菌科4个种的ITS序列的遗传距离：本研
1．4 ITS序列的克隆和测序：将纯化后的产物连接 究中4种药用真菌的ITSl和ITS2区序列差异性见
到pGEM—T载体上，转入制备好的大肠杆菌DH5a表2。表中ITSl和ITS2的差异性范围分别为
的感受态中，通过蓝白斑筛选阳性克隆，通过PCR 23．4％～79．3％，22．4％～28％，说明ITSl较ITS2
检测是否有插入片段。有插入片段的阳性克隆送上 的变异幅度大。ITSl差异最小的出现在缝裂木层孔
海华诺生物有限公司测序。 菌与松针层孔菌之间，而ITS2差异最小的出现在缝
1．5 DNA序列的对位排列和系统树的构建： 裂木层孔菌与鲍姆木层孔菌之间。ITSl差异最大的
ITSl、5．8SrDNA和ITS2序列范围根据所用引物出现在鲍姆木层孔菌与缝裂木层孔菌之间，ITS2差
以及美国生物信息中心(NCBI)网站提供的刺革菌异最大的出现在松针层孔菌与鲍姆木层孔菌之间。
表1 刺革菌科ITSl和ITS2序列G+c量、长度及在GenBank的注册登记号
Table1 G+ContentsandlengthsofITSlandITS2offourfungiinHymenochaetaceae．
andtheirregisterednumbersinGenBank
100’———一桦褐孔莳MD。lCBS88
l一 ．桦褐孔菌IF08681
r一鲍姆木层孔菌MD．1CBS84——一 100L———一鲍姆木层孔蒴SFCC50029
r——————————一缝裂木层孔菌MDJCBS86
l L——_1———T[篡嚣茎；：芸：，D豫JC8：：：。
圆瘤孢多孔菌DQ200923
分支上的数字是1000次重复抽样检测的靴带值(％)
Sequencenumbersonbranchesarebootstrapvalues(％)
of1 000replications
图l 以圆瘤孢多孔菌为外类群基于ITSl、5．8S和
ITS2序列分析构建的系统树
Fig．1DendrogramofITSl，5．8S，andITS2sequences
withB．montanaasoutgroup
表2刺革菌科4种真菌间遗传距离
Table2 Geneticd stancesoffourfungi
inHymenochaetaceae
缝裂木层孔菌鲍姆木层孔菌松针层孔菌桦褐孔菌
2．3刺革菌科4个种与GenBank中相应种的ITS
序列比较：从GenBank中下载了3条分别与这4种
药用真菌中的3个同名的ITS序列及一条外源ITS
序列，通过ClustalX对这8条序列进行比对，运用
分子进化遗传分析软件MEGAversion3．1中的最
大简约法(maximumparsimony)构建系统发育树，
见图1。除本研究所测的4条序列之外，还包括桦褐
万方数据
·264· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
孑L菌IFO8681(AY558593)、松针层孔菌CFMR
5406(AY558612)、鲍姆木层孔菌SFCC50029
(AY558608)和外源序列圆瘤孢多孔菌Bon—
darzewiamontana(DQ200923)。获得的最大简约
树其长度为286步，一致性指数为0．86，保留指数
为0．79，复定一致性指数为0．80，且多数分支具有
很好的自举支持。从树上可以看出，桦褐孑L菌与朝鲜
的桦褐孔菌IF08681聚在一起，自举支持率为
100％，将其定名为桦褐孔菌MDJCBS88。鲍姆木层
孔菌与朝鲜的鲍姆木层孔菌SFCC50029
(AY558608)聚在一起，自举支持率达到100％，定
名为鲍姆木层孔菌MDJCBS84。这4个真菌又聚为
一大支，因为它们同属纤孔菌属，松针层孔菌与松针
层孔菌CFMR5406聚在一起，自举支持率为
100％，定名为松针层孔菌MDJCBS85。同时与缝裂
木层孔菌聚成一大支，说明缝裂木层孔菌与松针层
孔菌的关系较近。将缝裂木层孔菌定为缝裂木层孔
菌MDJCBS86。
3讨论
已报道的刺革菌科的真菌，主要根据子实体的
外部形态和内部微观结构进行分类鉴定。但在生产
实践上，立木或木材腐朽往往不产生子实体，在人工
培养基上也很少产生子实体，很难鉴定出这些菌的
种类。本实验采自我国黑龙江长白山桦褐孔菌、缝裂
木层孔菌、松针层孔菌及鲍姆木层孔菌4种药用真
菌的核糖体DNA中的内转录间隔区(ITS)序列进
行了测定，并与得到普遍承认的国外相应菌种的
ITS进行了比较，运用ClustalX软件和MEGAver—
sion3．1分子进化遗传分析软件进行的系统发育分
析得到了较好的结果：4种药用真菌中除缝裂木层
孔菌没查到相应的菌种ITS序列外，其他3种均与
国外相应菌种的ITS序列聚在一起。说明这4种药
用真菌与形态学上的鉴定结果一致，ITS序列测定
可作为刺革菌科一些菌种的分类鉴定依据。
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一体藉
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万方数据
刺革菌科4种药用真菌的ITS区序列分析
作者： 曹小迎， 蒋继宏， 孙勇， 陈凤美， 刘群， CAO Xiao-ying， JIANG Ji-hong， SUN
Yong， CHEN Feng-mei， LIU Qun
作者单位： 徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(2)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
1.关艳丽.李莉.陈飞.郭玲玲.华霜.孙立梅 1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定[期刊论文]-微生物学杂志 2010(3)


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