全 文 ：·134· 中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
·综述·
ISSR标记技术及其在药用植物遗传育种中的应用
王明明，宋振巧，王建华。
(山东农业大学农学院，山东泰安271018)
摘要：简单重复序列问扩增(ISSR)是在简单重复序列(SSR)基础上发展起来的一种新技术。该技术以锚定的微
卫星DNA为引物，对与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增。ISSR标记具有较长
的引物序列，退火温度高，表现出较好的稳定性，且结合位点丰富，可以检测到基因组中多个位点的差异，能够揭示
出比限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物扩增多态DNA(RAPD)、SSR更多的多态性信息。对ISSR标记技
术的原理、特点及其在药用植物种质鉴定、遗传多样性、居群遗传结构、进化与亲缘关系分析以及分子辅助育种等
研究方面的应用进行了综述。
关键词：分子标记；ISSR；药用植物；遗传育种
中图分类号：R282．21 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)01—0134一04
Inter—simplesequencerepeatanditsapplicationinmedicinalpl ntgeneticbreeding
WANGMing—ming，SONGZhen—qiao，WANGJian—hua
(CollegeofAgronomy，ShandongAgriculturalUniversity，Taian271018，China)
Keywords：molecularmarker；ISSR；medicinalplant；geneticbreeding
药用植物在人类疾病的防治以及天然药物的筛选中占
有重要地位。我国地域辽阔，药用植物资源丰富，但是药用植
物的基础研究一直比较薄弱，尤其是遗传育种方面更为缺
乏，这在一定程度上限制了我国药用植物资源的深入开发和
利用。在药用植物的研究利用过程中也存在一些问题，如缺
乏系统的整理和准确的鉴定，导致中药材存在同物异名、同
名异物的现象普遍存在，市场上正品、伪品、替代品共存；由
于缺乏简便、有效的种质特性评价方法，未能在种植中加以
选优去劣，导致多数药用植物种质混杂，质量难以保证；虽然
有些大宗药材已实施GAP种植，但优质高产品种仍十分匮
乏。因此要取得药用植物研究特别是遗传育种方面的突破性
进展，高新技术的支持和应用是十分必要的。
借鉴大田作物的成功经验，在加快药用植物遗传育种进
程中，DNA分子标记技术将起到关键作用。DNA分子标记
是指在DNA水平上，以个体问遗传物质内核苷酸序列变异
为基础的遗传标记，它能够直接反映基因组DNA间的差
异。相比形态、细胞学、生化及同工酶等标记手段具有快速、
微量、特异性强的特点；不受生长发育阶段、供试部位、环境
条件的影响，特别适合中药正伪品鉴别、种质鉴定等方面的
研究，尤其是在种质资源遗传多样性评价、基因定位、分子标
记辅助育种等方面显示出广阔的应用前景。
简单重复序列间扩增(inter—simplesequencerep at，
ISSR)是一种新型的分子标记，由加拿大蒙特利尔大学的
Zietkiewicz等于1994年提出。它结合了随机引物扩增多态
DNA(randomamplifiedpdymorphicDNA，RAPD)和简单重
复序列(simplesequencerepeat，SSR)标记技术的优点，与以
往的分子标记相比，能够提供更多的基因组DNA信息。现
已广泛应用于药用植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分
析、遗传多样性与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、
分子标记辅助育种等方面研究。
1 ISSR标记的技术原理及特点
真核生物基因组中广泛存在着由1～4个碱基对组成的
简单重复序列，又称微卫星(microsatellite)，如(AG)。、
(GACA)。、(GT)。等。ISSR分子标记就是用锚定的微卫星
DNA为引物，在SSR序列的37或5’端加锚2～4个随机核
苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导
致锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进
行PCR扩增。所扩增的Inter—SSR区域的多个条带可通过
聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨[1]。
ISSR标记技术试验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地
进行基因文库构建、杂交和同位素显示等步骤；重复序列和锚
定碱基的选择是随机的，无需知道任何靶标序列的SSR背景
信息，从而降低了技术难度和实验成本；无需活材料，无组织
器官特异性，能实现全基因组无编码取样；采用了较长的引物
(15～24bp)，退火温度较高，因此，引物具有更强的专一性，
增强了实现的可重复性。ISSR标记的缺点就是，在PCR扩增
收稿日期：2006—05—12
作者简介：王明明(1984一)，男，山东省潍坊市人，硕士研究生，主要从事药用植物资源开发与分子生物学方面的研究。
*通讯作者王建华Tel：(0538)8248076E—mail：jhwangjh@163．corn
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中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月· 35·
时需要一定时间摸索最适反应条件；呈孟德尔式遗传，即显性
遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。
2 ISSR标记技术在药用植物遗传育种中的应用
2．1 种质资源鉴定：药用植物种质资源的鉴定和评价对于
育种亲本选择、丰富遗传基础以及种质资源合理利用开发等
方面都是非常重要的。传统药用植物种质资源的鉴定评价方
法依赖于宏观特征，如叶片形状等，但可用的形态性状少且
受环境影响大，因此需要高效、准确、不受环境因素影响的鉴
定技术。沈颖等[2]使用ISSR标记技术对石斛属(Dendrotnum
Sw．)9种植物进行了石斛种间鉴别。沈永宝等∞1通过5条
ISSR引物产生的特异性片段就可鉴别出13个银杏Ginkgo
bilobaL．主要栽培品种oKojoma等[41利用ISSR引物可区分
无法采用HPLC法区分的大麻CannabissativaL．2个样品。
Gardner等口1使用2个ISSR引物可区分32个铁线莲属
(ClematisL．)蔓生栽培品种。周延清等[6,73用RAPD和ISSR
技术对怀地黄RehmanniaglutinosaLibosch．f．
hueichingensis(ChaoetSchih)Hsiao进行了种质分析。结果
表明，ISSR标记技术的多态性和重复性优于RAPD技术。
因此ISSR技术是一种快速、准确可以产生足够多态位点的
标记方法，且不受环境影响，可在分子水平进行种质资源鉴
定、评价研究，从而为进一步加快育种进程提供了可能。
在遗传物质和生态因子长期作用下使药材产生“道地
性”，如泰山的白首乌，然而道地药材的遗传学特征及“道地
性”的本质至今尚无充分的科学证据。探索道地药材的遗传
基因、揭示道地药材的本质是药用植物遗传育种研究的重要
内容之一。目前对这方面的研究还较少。左云娟等[8]采用
ISSR分子标记技术结合实地形态观察的方法，鉴定道地药
材江枳壳品种，而且指出同一产地同一品种的不同样品存在
同名异物和同物异名现象。因此，对药用植物的道地品种种
质资源的搜集鉴定、探索道地药材的遗传本质、选育优质高
产新品种具有重要意义。长期以来，中药材缺乏系统的整理
和准确的鉴定手段，市场上存在伪劣品并不鲜见，正伪品的
鉴定方面，分子标记技术有其优越性。
2．2检测遗传多样性和居群遗传结构：ISSR技术在生物学
中最主要的应用是分析和评估种群的遗传多样性。物种的遗
传多样性是长期进化的结果，也是其生存和发展的前提。对
物种遗传多样性和遗传结构的研究，是探讨其适应性、生存
力的基础，也是分析濒危物种致濒机制的基础，从而帮助制
定科学有效的保护策略和措施。由于ISSR技术能提供较大
数目的DNA片段，可以扫描基因组内的多态位点，因而是
一种用于分析物种、种群、不同品系，甚至是个体间遗传差异
的理想方法。
Nan等[93对来自4个自然居群和栽培材料的60个四季
报春PrimulaobconicaHancessp．obconica进行了ISSR遗
传多样性分析，结果显示自然居群的遗传多样性高于栽培居
群。Ge等[1叮利用ISSR对穗花杉Amentotaxusargotaenia
(Hance)Pilger的遗传多样性和居群遗传结构进行了分析。
马永等n妇利用ISSR技术对叉孢苏铁CycassegmentifidaD．
Y．WangetC．Y．Deng遗传多样性进行研究，从103条引
物中筛选出12条用于所有样品的扩增。结果表明，种级水平
上，叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平，且各居群间
有着很高的遗传分化度。葛永奇等[12。l对2个栽培和3个野
生银杏群体进行ISSR检测。结果表明，银杏具有丰富的遗
传变异。邱英雄等[1朝对7个野生群体的明党参Changium
smyrnioidesWolff和1个栽培群体的川明参Chuanminshen
violaceumShehetShan进行ISSR遗传多样性和遗传结构
分析。结果表明，明党参群体水平的遗传多样性高于川明参
群体，且遗传变异主要存在于不同群体间。
进一步通过相关分析、聚类分析等数量遗传分析可进行
不同亲缘物种间的遗传聚类的划分，这种划分可反映出与地
理分布的相关性，确定是否呈现一定的地域性，从而为这些
物质的保护、可持续利用奠定理论基础。吴卫等C14]使用22
个 SSR引物检测了70份鱼腥草Houttuyniacordata
Thunb．种质资源遗传多样性。根据ISSR遗传相似系数划
分的类群主要同染色体数目有关，也与地理分布有一定关
系。张木清等[1钉采ISSR分子标记技术检测了8省区的30
个斑茅Erianthusar ndinaceus(Retz．)Jesw．，根据研究结
果进行聚类和主成分分析，可将30个斑茅无性系归为4大
类，同一地区的斑茅无性系基本聚在同一类，呈现出一定的
地域性分布规律。梁洪卉等[163利用形态性状和ISSR分子标
记对冬虫夏草Cordycepssinensis(Berk．)Sacc．的分析表
明，青海省不同地区的冬虫夏草可分为环青海湖产区和其他
产区两大类，说明青海省的冬虫夏草表现出明显的地域性分
布。周俊亚[17]和彭云滔[18]分别对栽培罗汉果Siraitia
grosvenorii(Swingle)C．Jeffrey样品和野生罗汉果进行了
遗传多样性分析，不同样品的遗传关系与产地有关，同一地
区的关系较近，而不同地区的样品间差异明显。宾晓芸等n9]
对金花茶CamellianitidissimaChi的研究也得出相同的结
论，金花茶4个自然分布居群间的遗传距离与地理距离成显
著的正相关。而Jian等n叩应用11个ISSR引物研究了来自
华南地区的6个自然种群的红植植物银叶树Heritiera
HttoralisDryand．的遗传多样性表明，不同的生境(海生和
陆生)并没有对银叶树的种群分化在基因水平上带来显著影
响。Li等[21]对中国南方7个不同鸭舌草Monochoria
vaginaHs(Burro．f．)PreslexKunth居群进行ISSR分析认
为居群问的遗传多样性与地理分布有较低的相关性。
在濒危、特有药用植物研究方面，ISSR标记技术可以对
物种濒危程度进行评价，从而有助于制定科学有效的保护策
略和措施。杨淑达等[223应用ISSR标记分析了中国西南地区
特有植物滇牡丹PaeoniadelavayiFraneh．。结果表明，滇牡
丹遗传多样性水平较高，居群间遗传分化大，滇牡丹并不濒
危。李群等[2胡利用ISSR分子标记对四川濒危植物延龄草
TrilliumtschonoskiiMax m．7个自然居群的遗传多样性水
平和遗传结构进行了研究，与其他一些濒危植物相比，延龄
草的遗传多样性较低。肖龙骞等[24]利用100个ISSR引物中
筛选出的11个能够扩增出清晰条带的引物对贵州苏铁
万方数据
·136· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
@casguizhouensisK．M．LanetR．F．Zou的12个自然居
群的遗传分析表明，贵州苏铁遗传多样性水平比较低。刘美
华等[25]通过ISSR标记技术对昆仓锦鸡儿Caragana
polourensisFranch．及其近缘种吐鲁番锦鸡几c．
turfanensisKom．遗传多样性进行检测，与在相同生境中生
长的濒危植物小沙冬青Ammopiptanthusn usC engf．的
遗传多样性作了比较。结果表明，不同的遗传多样性水平可
能是造成它们生长状态不同的主要原因之一。
2．3药用植物进化与亲缘关系：ISSR分子标记可从DNA
水平有效揭示药用植物物种自然居群、品种中遗传结构的基
因流动与演变等系统发育与亲缘关系的真实本质，可真实地
阐明生物的遗传背景差异、物种演化与亲缘关系。药用植物
进化与亲缘关系是遗传育种研究的重要内容，决定了这些种
质在今后育种实践中的有效利用，为药用植物的开发利用提
供真实的生物学依据。
Huang等[2“．采用ISSR分子标记研究了番薯属
(1pomoeaL．)植物的亲缘关系，发现三浅裂野牵牛，．
trifida(H．B．K．)G．Don与常见栽培植物甘薯1．batatas
(L．)Lam．最为接近，而I．ramosissima(Poir．)Choisy和
I．umbraticolHouse与常见栽培甘薯亲缘关系最远。Sun
等[271利用ISSR标记技术分析了来自中国和美国的野葛
Puerarialobata(Willd．)Ohwi、食用葛P．edulisPamp．、山
葛P．montana(Lour．)Merr．、三裂叶葛藤P．phaseoloides
(Roxb．)Benth．、粉葛P．thomsoniBenth．的亲缘关系，与
其他同属植物相比，来自美国和中国的野葛样品具有较近的
亲缘关系。曹雅男等[28]利用RAPD和ISSR方法对4种正品
龙胆亲缘关系进行分析表明，坚龙胆Gentianarigescens
Franeh．与三花龙胆G．trifloraPal ．、龙胆G．scabra
Bunge、条叶龙胆G．manshuricaKitag．的遗传距离较远；而
三花龙胆和龙胆亲缘关系较近。汪岚等口叼使用7个ISSR引
物对12个莲藕品种进行分析，将其分为美洲莲、美洲莲与亚
洲莲的杂交后代和亚洲莲3个大类；与以前的RAPD研究
不同，中国莲与日本莲有很近的亲缘关系。
2．4基因定位与分子标记辅助育种：育种目的在于实现现
有品种改良，品种改良的实质就是对目的基因进行选择并实
现优异基因集成的过程。因而，实现目的基因的快速定位，提
高其选择效率，是加快育种进程的关键。基因定位就是筛选
与目的基因连锁的遗传标记。分子标记相对于形态标记具有
无可比拟的优越性，在育种中的应用日益增加。Ratnaparkhe
等[3叩利用ISSR引物定位鹰嘴豆CicerarietinumL．中抗镰
刀菌萎蔫病基因，结果发现UBC一855500和UBC一8251200
与该抗病基因连锁，遗传距离分别为5．2cM
(centimorgans)和5．0cM，并将其转化为序列特征化扩增区
域(sequenceharacteredamplifiedregion，SCAR)标记。利用
分子标记可以在育种过程中进行亲本性状的鉴定、检测，辅
助选择亲本及子代，加速品种的培育，缩短育种周期。
遗传连锁图谱是随着各类分子标记的发展而形成的，有
着极其重要的意义，可用来定位和标记目标基因，推动标记
辅助育种在生产中的应用。同时它也利用图谱克隆重要基
因，是揭示多基因性状遗传基础的重要工具。遗传连锁图谱
研究的目的是寻找足够的多态分子标记，将所有基因定位到
特定染色体的特定区域，最好是在染色体步查距离内。因为
ISSR能够揭示高度多态性，遍布于整个染色体上，所以它是
绘制遗传连锁图的理想标记。Winter等口妇构建了一个354
个标记包括37个ISSR标记的完整的鹰嘴豆抗镰刀菌萎蔫
病基因分子图谱，该图谱总长2077．9cM，平均图距为
6．8eM。Santra等利用C．arietinum(FI，IP84—92C，抗病亲
本)×C．reticulatum(PI599072，感病亲本)，获得F5和F6
的重组自交系群体，通过RAPD、ISSR和同工酶引物对该群
体进行扩增，建立了一个总长为981．6cM，平均图距为8．4
cM的抗壳二孢叶枯病分子图谱。
3展望
ISSR标记技术在药用植物遗传育种中发挥了重要作
用。当然ISSR标记亦存在～些缺点，限制了其在某些方面
的应用。目前ISSR技术主要应用于农作物、果树、林木、花
卉、草坪等方面的研究，在药用植物方面的应用虽已有一些
报道，但相对较少。ISSR标记以其多态性高、可重复性强、简
便快速等优势，必将使其在药用植物“道地性”基因定位、道
地药材机制、中药品质与标准化、濒危珍稀动植物保护与利
用、中药化学型(有效成分)与基因型相关性分析等方面发挥
更大的作用。
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AnalysisofpatentprotectionofChinesemateriamedicainUSA
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作者简介：杨莉(1981一)，女，博士研究生，主要从事药品知识产权保护方面的研究。
Tel：13889355679E—mail：yanglishanxi@126．corn
万方数据
ISSR标记技术及其在药用植物遗传育种中的应用
作者： 王明明， 宋振巧， 王建华， WANG Ming-ming， SONG Zhen-qiao， WANG Jian-hua
作者单位： 山东农业大学农学院,山东,泰安,271018
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(1)
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