全 文 ：中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月-555-
·药理与临床·
熊果酸体外抗胃癌细胞SGC7901机制的研究
张奕颖1，邓 涛1，胡志芳2，张秋萍2，江华2
(1．武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉430060；2，武汉大学医学院免疫系，湖北武汉430071)
摘要：目的探讨熊果酸(ursolicacid，UA)体外抑制胃癌细胞SGC7901生长的作用机制。方法体外培养人
胃癌细胞株SGC7901，MTT法观察不同浓度UA作用不同时间对细胞生长的影响；不同浓度UA(o～40／tmol／
L)处理SGC7901细胞24h后，倒置显微镜观察细胞形态变化；荧光染料Hoechst33258染色和流式细胞仪检测
细胞凋亡情况；WesternBlotting法检测凋亡相关蛋白Bcl一2和Bax的表达。结果20～40pmol／LUA可抑制
SGC7901的生长，并呈浓度和时间依赖性，其作用12、24、36、48h的Ic∞分别为(57．50±1．18)、(34．28士2．05)、
(27．54±1．11)、(24，83土1．02)pmol／l。。20～,10t．tmoi／LuA作用24h后．SGC7901细胞变圆，出现不同程度的漂
浮；同时细胞被阻滞于G。／G，期并发生凋亡，随药物浓度升高，凋亡率增加，凋亡相关蛋白Bcl一2表达减少．Bax无
明显变化。结论熊果酸对SGC7901细胞具有较强的抗肿瘤活性，其机制可能与细胞毒作用、增殖抑制作用眦及
下调凋亡相关蛋白Bcl一2表达而促进凋亡有关。
关键词：熊果酸；胃癌细胞SGC7901；细胞毒性；增殖}细胞凋亡lBel一2
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：02532670(2006)045550
AntitumormechanismofursolicacidonhumangastriccancercelllinesSGC7901invitro
ZHANGYi—yin91，DENGTa01，HUZhi—fan92，ZHANGQiu—pin92，JIANGHua
2
(1．DepartmentofGas roenter0109y，People。sHospital，WuhanUniversity，Wuhan430060，China；
2．DepartmentofImmunology，MedicalCollege，WuhanUniversity·Wuhan430071，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethepotentialmechanismof nhibitionofursolica id(UA)on
growthof umangastriccancerc llIinesSGC7901invitro．MethodsSGC7901cellswereculturedinvit
FO，MTTassaywasusedtOobserveth ffectofUAongrowthofSGC7901cellsinvariousconcentrations
fordifferenttimes．AfterSGC7901cellsweretreatedbv0—40umol／LUAfor24h．morphological
changesw reobservedbyinvertedmicroscope．Apoptoticchangesw redetectedbyfluorescencemi—
croscopyandflowcytometry(FCM)．ProteinexpressionsfBcl一2andBaxweredeterminedbyW stern
blotting．ResultsUA(20—40pmol／L)couldsignificantlyinhibitt,hegrowthofSGC7901cellsina
dose—andtimedependentma ner，theICsnvalueofUAforSGC7901c,ellsfor12，24，36，and48hwere
(57．50±1．18)，(34．28土2．05)，(27．54±1．11)，and(24．83土1．02)p．mol／I，，respectively．AfterUA
(2040umol／L)treatmentfor24h，SGC7901cellsturnedroundandfloatedatdifferentl vels；SGC7901
cellswerearrestedatGo／Glphaseandapoptosiswasnduced，andtheapoptoticratewasincreasedlong
withtheincreaseofUAconcentration．MeanwhileBcl一2proteinxpressiondecreased，whereasBaxpro
reinexpressionunchanged．ConclusionUAhasa trongerantitumoreffectonSGC7901cells．Cytotoxic
effect，proliferationnhibition，andapoptosismaybeinvolovedinthemechanismofUA，andtheapoptosis
causedbvUAmaybeenhancedbydecreaseofBcl2proteinxpression．
Keywords：ursolicacid(UA)；gastricc ncerc lllinesSGC7901；cytotoxicity；proliferation；apopto—
sis：Bcl一2
熊果酸(ursolicacid，UA)又名乌索酸、乌苏
酸，属于三萜类化合物，广泛分布于熊果、白花蛇舌
草等多种天然植物中。UA可抑制多种肿瘤细胞增
殖并诱导其凋亡”“，但其作用机制尚不十分清楚。
本研究旨在观察UA体外对人胃癌细胞SGC7901
的影响，进一步探讨uA的抗癌作用机制。
鉴鍪最营!薪：i碧蓑等厅基金资助项目。：。。，A，。。。：，
作者简介：T张e奕l：颖(0n2797)9873h19女47’4河南88省04洛71阳44市仝窖鬻大cli学ck；翟亳嚣磊意要声研究生’主要从事消化道肿瘤药物预防研究
万方数据
·556· 中草嚆cMn皓eTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
1材料
小牛血清为三利公司产品，RPMI1640培养基
为Hycolone公司产品。UA[质量分数>90％，用二
甲基亚砜(DMSO)溶解，并调整DMSO终体积分
数为0．06％]、碘化丙啶(PI)和Hoechst33258染
料均为Sigma公司产品。四甲基偶氮唑蓝(MTT)
为Amresco公司产品。小鼠抗人Bcl2单克隆抗
体、小鼠抗人Bax单克隆抗体分别为Neomarkers
公司和SantaCruz公司产品。ECI。化学发光试剂盒
为KirkegaardPerryLaboratories公司产品。
xDs一1B倒置显微镜为重庆光电仪器有限公司产
品。GENiOSVA200荧光酶标仪为澳大利亚Tecan
公司产品。BX51荧光显微镜为日本Olympus公司
产品。EPICSA1．TRAⅡ流式细胞仪为美国Beck—
mail公司产品。
2方法
2．1细胞培养：胃癌细胞株SGC7901购自上海细
胞研究所。将SGC7901细胞接种于含10％小牛血
清的RPMI—l640培养基中，置37C、5％CO。培养
箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
2．2 MTT法检测细胞生长抑制率：将SGC7901
细胞制成2×104／mI．的细胞悬液，以每}L200“L
接种于96}L培养板。待细胞贴壁后，加入UA使其
终浓度分别为0、10、20、30、40gmol／L，每个药物浓
度组各设3个平行孔。于UA作用12、24、36、48h
时分别加人MTT，4h后离心弃上清液，每孔均加
入DMSO100“I。，混匀后置于酶标仪于570Ilm波
长处测吸光度(A)值。计算生长抑制率[抑制率一
(1—4ⅫⅫ／A目月Ⅱ)×100％]，并采用Bliss法计算
半数抑制浓度(IC。。)。实验重复3次。
2．3 倒置显微镜观察细胞形态变化：SGC7901细
胞用0、10、20、30、40gmol／I，UA分别处理24h
后，倒置显微镜下观察细胞形态变化并进行摄影。
2．4 Hoechst33258染色检测凋亡细胞：用0、20、
40t_￡mol／I。UA分别处理SGC7901细胞24h，胰酶
消化后，1500r／min离心5min，收集细胞．加入固
定液[甲醇一冰醋酸(3：1)]4C固定15min，离心
弃固定液，加入Hoeehst33258染液37C避光染色
40rain。离心弃染液，PBS洗涤2次后，滴片，紫外光
激发下荧光显微镜观察并拍照。实验重复3次。
2．5流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的改变：
0、10、20、30、40／』mol／LUA分别处理sGC7901细
胞24h后，收集2×106个细胞，用70％乙醇4c
固定12h。离心弃乙醇，加入RNA酶(1mg／mI。)，
37C水浴30rain后，加入PI综合染液(PI质量
浓度为124pg／mI。，TritonX100体积分数为
．124％)lml。，4c避光染色30min，流式细胞仪
进行检测。实验重复3次。
2．6 WesternBlotting检测Bcl2、 ax蛋白表达：
分别收集0、10、20、30、40pmol／I。uA作用24h的
细胞3×106个，加入裂解液100”I。、冰浴30rnin
后，离心提取上清液，并用荧光酶标仪测定蛋白浓
度。以SDS—PAGE电泳分离蛋白(每泳道150ug)
后，4(1、60mA转印过夜至硝酸纤维素(NC)膜，
封闭后分别加入一抗(Bcl一2、Bax)孵育2h，漂洗后
用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h，再次漂洗
后用ECI。化学发光试剂盒进行检测。结果进行灰
度扫描后，QuaillilyOne分析软件测定平均吸光
度。实验重复3次。
2．7统计学处理：所有数据均以j±5表示，采用
SPSS12．0统计软件对数据进行f检测。
3结果
3．1 UA对SGC7901细胞生长的影响：与对照组
(0／*mol／LUA组)相比，20～40txmol／I，UA呈剂
量和时间依赖性地抑制SGC7901生长，而10
／tmol／l。UA无抑制作用，见图l。UA作用12、24、
36和48h的IC。。分别为(57．50土1．18)、(34．28士
2．05)、(27．54±1．11)、(24．83±1．02)gmol／I。。
100
}75
苷
兰50
覃
业
}25
0
2 24 36 48
图l UA对SGC7901细胞的生长抑制作用(月一3)
Fig．1InhibitionofUAongrowth
ofSGC7901cells“一3)
3．2 UA对SGC7901细胞形态的影响：对照组(0
pmol／I。UA组)与10pmol／I，UA组细胞生长旺
盛，成多边形，胞膜光滑，轮廓明显，状态良好；20、30
pmol／I。UA组细胞生长均轻度抑制，部分细胞变圆
漂起，胞膜皱缩，但胞膜完整；40pmol／I。UA组细
胞生长重度受抑，绝大部分细胞漂起、变圆、肿胀或
缩小，细胞体积大小不一致，并有细胞碎片形成，见
图2。
3．3 UA对SGC7901细胞凋亡的影响：荧光显微
万方数据
中革葛ChineseTraditionalandHerbDrugs第37卷第4期2006年4月·557·
⋯一0、10、20、30、40pmol／I，UA
图2不同浓度UA作用24h后SGC7901细胞形态的改变
Fig．2MorphologicchangeofSGC7901cellsafterUAtreatmentfor24hinvariousconcentrations
镜观察发现：不同浓度uA作用24h后，0pmol／L
UA作用组染色质分布均匀，呈弥散均匀蓝白色荧
光；而20bLmol／LUA作用组部分细胞染色质呈浓
染的块状或颗粒状，聚集于核周边或裂解成碎片，并
出现凋亡小体；40pmol／I。UA作用组较多细胞胞
内染色质分布不均，形成荧光斑点，呈凋亡特征性
改变。
3．4 UA对SGC7901细胞周期和凋亡率的影响：
流式细胞仪分析表明，不同浓度UA作用24h后，
与对照组(0Fmol／LUA)相比，20、30、40umol／L
UA可使G。／G、期细胞比例随UA浓度增加而逐渐
增加，而s期和G：／M期细胞比例下降，同时细胞
凋亡率逐渐升高，差异均具有显著性(P
0．05)，见表l。
表l不同浓度UA作用24h对SGC7901细胞周期和
凋亡率的影响(』±j．n一3)
Tablej EffectOilcellcycleandapoptotieratofSGC7901
cellsafterUAtreatmentfor24hinvarious
concentrations(i士s，n一3)
0(对照)
10
20
30
1 47士025
1 63士O25
9 10±2．39。+
2630±l25’+
3520土26。’
与0pmoI／I，UA组比较：’P<005一P<0．01
‘P
影响：WesternBlotting结果表明，不同浓度UA作
用24h后，20～40ttmol／I．UA组Bcl一2蛋白表达
水平下降，并呈浓度依赖性，与对照组相比差异具有
显著性(P<0．01)，而Bax的表达无明显改变；10
pmol／I。UA组两种蛋白的表达与对照组相比差异
均无显著性(P>0．05)，见表2。
4讨论
近年来UA抗肿瘤作用日益受到重视，研究发
表2不同浓度UA作用24h对SGC7901Bcl一2和Bax
蛋白表达的影响(x±s，n一3)
Table2 EffectonBcl一2andBaxproteinxpressions
ofSGC7901cellsafterUAtreatmentfor24h
invarlousconcentrations(i±s，一3)
UA浓度／ 平均吸光度
0．945士067
0．58l士0，136+。
0．304士0042‘‘
与0／’mol／i—UA组比较；一J’<00】一，<0Ⅲ010pmol／I，UAgroup
现UA对人结肠癌细胞系HT29、人白血病细胞系
Hl。60、人肺癌细胞系A549、人表皮样癌细胞系
A431等多种肿瘤细胞系均有较强的抗肿瘤活
性口*-43。本研究发现uA对人胃癌细胞系SGC7901
也有较强的抑制作用，并呈浓度和时间依赖性，uA
作用24h的Ic。。为(34．28±2．05)pmol／I。。用低
于IC50的UA(20～30Fmol／1．)处理SGC7901细
胞24h后，细胞生长受到抑制，但形态完整，同时
G。／G。期细胞增多，s期及G：／M细胞减少．细胞凋
亡率增加；而用高于Ic。。的UA(40itmol／L)作用
相同时间后，细胞除发生G。／G期阻滞和凋亡外，还
有较多细胞出现肿胀以及细胞碎片形成等坏死表
现，提示UA可通过细胞毒、增殖抑制和诱导凋亡
作用抑制SGC7901细胞的生长。
细胞凋亡是由凋亡相关基因进行调控的细胞自
主性死亡过程，凋亡相关基因包括凋亡抑制基因，如
Bcl一2、P53和凋亡促进基因如Bax、Fas等，通过其
相应蛋白产物发挥调控凋亡的作用。Bcl2和Bax
同属于Bel2家族，Bcl一2蛋白通过维持线粒体完整
性抑制细胞色素C(cytoehromeC，cyt—C)释放、拮
抗Bax等凋亡促进蛋白的作用以及调节内质网内
Ca2+流动进而影响细胞内Ca2}水平来抑制细胞凋
亡。Bcl一2／Bax升高，细胞不易凋亡，反之则易于凋
亡口羽。本研究证实随UA浓度增加．Bcl2蛋白的
ⅢⅢm叭㈣蜘蜘枷枷蜘拟Ⅲ黜|言{暑
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万方数据
-558· 中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4,El
表达逐渐减弱，Pax蛋白的表达无明显变化，Bcl2／
Bax逐渐降低，细胞凋亡率逐渐增加。有学者认为
uA通过抑制Bcl一2表达并同时增加Bax表达而促
进肿瘤细胞凋亡：“⋯，这与本实验结果不尽相同。由
此推测：uA对凋亡相关基因的影响可能因细胞不
同而有所差异，UA可能通过下调凋亡抑制基因
Bcl2表达，进而下调Bcl一2／Bax，从而促进
SGC7901细胞凋亡。
综上所述，本研究证实UA对胃癌细胞
SGC7901有明显的生长抑制作用，其具体机制可能
与细胞毒作用、干扰细胞周期而抑制细胞增殖以及
下调凋亡相关蛋白Bcl一2的表达促进凋亡有关。
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女贞子对去卵巢大鼠钙代谢及维生素D依赖型基因表达的影响
张岩“2，黄文秀2一，陈斌3，梁秉中5，昊春福1，姚新生3
(1．沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016；2．中药及分子药理国家重点实验室，广东深圳518057
3．沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳110016}4．香港理工大学应用生物与化学技术系，香港；
5香港中文大学矫形外科及创伤学系，香港)
摘 要：目的 研究补肾中药女贞子对去卵巢大鼠钙代谢及维生素D依祯型基因表达的影响。方法 太鼠去卵巢
手术处理4周后，19给药治疗t4周。血清、尿液及粪便中钙水平采用比色法测定。RT—PCR技术分析小肠及肾脏
基因表达。结果大鼠去卵巢后体内钙流失显著增加，表现在血钙F降，尿钙及粪钙排泄增加。女贞子可“有效舫
止尿钙及粪钙排泄增加，并恢复血钙水平。RT—PCR分析表明雌二醇和女贞子都可以抑制去卵巢引起的小肠维生
素D受体(VDR)mRNA表达下降。女贞子对肾脏25羟基维生素D1一羟化酶(1一OHase)及2j一羟基维生素D24一
羟化酶(24一OHase)mRNA无明显作用，但却可以提高肾脏钙结合蛋白9k(CaBP一9k)及钙结合蛋白28k
(CaBP28k)的基因表达。结论女贞于能够改善雌激素缺乏所引起的钙失衡状态，主要是通过提高小肠对活性维
生素D的敏感性及加强肾脏对钙的重吸收而发挥作用的。
关键词；女贞于；钙代谢；维生素D；基因表达，去卵巢
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)04055804
EffectofFructusLigustriLucidioncalciummetabolismandvitaminD—dependent
geneexpressionsinovariectomizedrats
ZHANGYan。2，WoNGMan—sau2一，CHENBin3，LEUNGPingChun95，
WUChun—ful，YAOXinshen93
(1SchoolofPharmacy，ShenyangPharm ceuticalUniversity，Shenyang110016，China；2．StateKeyLaboratoryof(hina
MedicineandMolecularPh macology．Shenzhen518057．China：3．SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，
ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China；4．DepartmentofA pliedBiologyandChemical
Technology，theHongKongPolytechnicUniversity-HongKongSAR，ChinaI5．DepartmentofOrthopaedics
andTraumatology，theChinesUniversityofHongKong，HongKongSAR，China)
鏊霎品智：警譬嚣募踌政区科技研究发展计划(AoF／P-10／01)项目资助课题(BQ76713_zF89)
作者简介：娄究学榴j；i7)5孝j葛磐霭亨5；曼!，亡意墨薷嚣主嵩蠹篙学翟慧曼士研究生，研究方向为抗骨质疏松中药筛选及作用机制
万方数据
熊果酸体外抗胃癌细胞SGC7901机制的研究
作者： 张奕颖， 邓涛， 胡志芳， 张秋萍， 江华， ZHANG Yi-ying， DENG Tao， HU Zhi-fang
， ZHANG Qiu-ping， JIANG Hua
作者单位： 张奕颖,邓涛,ZHANG Yi-ying,DENG Tao(武汉大学人民医院,消化内科,湖北,武汉,430060)
， 胡志芳,张秋萍,江华,HU Zhi-fang,ZHANG Qiu-ping,JIANG Hua(武汉大学医学院,免疫系
,湖北,武汉,430071)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(4)
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