全 文 ：中革蔼ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月·585·
·药材与资源·
铁皮石斛RNA提取及RT—PCR检测
李标“2，王伯初“2，唐坤“2，刘毅1，戴传云2，段传人2
(1．重庆邮电学院生物信息学院，重庆400065；2．重庆大学生物工程学院
生物_J=『学与组织工程教育部重点实验室，莺庆400044)
摘要：目的有效地提取铁皮石斛高质量的RNA，为研究环境胁迫对铁皮石斛生长与代谢影响的分于表达机制
奠定基础。方法建立声波处理的刺激组与对照组．改良苯酚氯仿法制备的RNA，分光光度法检测其量．1．0％变
眭琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；所得的总RNA经过RTPCR扩增，6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测显
示其差异cDNA片段。结果提取的总RNA：。。／A洲为3．16⋯A。／AⅢ为1．96，产量达0．27I,g／rag，电泳条带清
晰．完整陛良好，可筛选出明显的差异eDNA片段，分于质量在240～600bp。结论用该方法能高质高量地提取富
含多糖的药用植物总RNA。
关键词：铁皮石斛；RNA提取；声渡；RTPCR
中圈分类号：R282．1 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2006)叫一0585一。l
RNAExtractionandRT—PCRdetectionofDendrobiumcandidum
I。1Bia01～，WANGBochul～．TANGKunl’2，I，IUY11，I)A1Chuanyun2，1)UANChuan—ren2
(1 CollegeofBioinformation，ChongqingUniversityofPosts＆Telecommunications·Chongqing400065， hina；
2．KevLaboratoryforBiomechaniesandTissueEngineeringundertheStateMinistryofEducation，
CollegeofBioengineering，ChongqingUniversity，Chongqing400044，China)
Abstract：Objective’FhehighqualityRNAfromtheplantletofDendrobiumcandidumwasisolated
efficiently．Itlaida foundationostudythemechanismofmolecularexp essiononitSgrowthand
metabolismundernvironmentalstress．MethodsT egroupsstimulatedbysoundwaveandthecontrol
groupswereestablished．’IotalRNAwaspreparedbyamodifiedphenol—chloroformmeth d．Thecont nt
wasdeterminedbya spectrophotometer．TheinlegrityofRNAwasdetectedbylectrophoresiswith1．0％
denaturedagarosegeI．ThetotalRNAobtainedwasamplifiedbvRTPCR．ThedifferentialcI)NAbands
weredisplayedon6％denaturedpolyacrylamidegelbyelectr。ph。resisand lverstaining．ResultsThe
ratiosftotalRNAn26。／n2∞andA删／n2舯were3．16and1．96，respectively，Tileyieldwas0．27／19／mg
freshweight．7IhebandswereclearonagarosegelandtheintegrityofRNAwasgood．Thedifferential
cDNAbandswerescreenedwithmolecularweightof240600hp．ConclusionThemethodofmodified
phenolchloroformcanbeusedtoisolateRNAfromD．candidiumwithhighqualityandhighyield．
Keywords：，ⅪndrobiumCandid“，nWaIl，exT．indl；RNAextraction；soundwave；RT—PCR
植物生长发育是一系列基因表达和内外环境因
子影响共同作用的结果。分离和提纯植物体内的总
RNA，逆转录成cDNA，进行差异基因筛选克隆、
Northern杂交和蛋白质体外翻译实验等，都需要高
质量的RNA。
铁皮石斛DendrobiumcandidumWail．ex
I．indl．是一种富含多糖的药用植物[1一，尚未见到铁
皮石斛总RNA提取的报道。利用适当的声波胁迫
铁皮石斛的特异基因表达，可以提高其多糖的量
3．42％。为r研究适当的声波胁迫对铁皮石斛次生
代谢产物表达的影响及其特异表达基因的筛选，必
须得到高质量的RNA。有关植物组成RNA的提取
方法已有不少报道”’“。由于植物组织中律往富含多
糖；而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很
难将它们分开“]，致使污染多糖的RNA样品无法
用于进一步的分子生物学研究。
收稿日期：2005—06-23
基金项目：国家自然科学基金f30470431)；重庆市科委自然科学基金(CSPC2005BBl094)}重庆大学优秀博上论文风险基金贷助
(200301)
作者简介李标(i970)，男，湖北黄梅人，重庆邮电学院生物信息学院讲师．2003年3爿考^重庆大学牛物工程学院在职博士研究
生．研究方向为生物力学与植物分子生物学。Tel：(023)60712795Fax：(023)6246(1025
Email：cquptlibiao@yahoo．corncll}libiao@126c m
万方数据
·586· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
本实验首先采用了RNeasyP[antMird试剂盒
(Qiagen)提取铁皮石斛的总RNA，但收率不高，不
能满足后续研究。但采用改良酚一氯仿法提取适当声
波处理的铁皮石斛刺激组和对照组的总RNA，并通
过逆转录差异显示PCR扩增检测，发现此方法能够
得到良好的总RNA并能满足实验的要求。
l材料和方法
1．1 实验材料：铁皮石斛接种2个月的无菌试管苗。
1．2实验方法
1．2．1声波刺激处理：对生长2个月的铁皮石斛组
培苗，在频率1000Hz、声强100dB的声波刺激下，
每天8：30～9；30刺激1h，连续刺激6d，建立对
照组(c)和刺激组(s)，刺激方法参见文献[5]。
1．2．2总RNA提取：取500mg嫩叶片，加液氮研
磨．加入研磨缓冲液(1％SDS以HCI调节pH至
8．2．0．18mol／I，Tris，0．09mol／LiCl，4．5
mmol／l。EDTA)15 mI．，再研磨。
将含样品的缓冲液移人试管中，加入等体积的
苯酚一氯仿混合液。剧烈震荡试管10min，室温下，
3000r／min，离心15min分离(可再用酚一氯抽提一
次)。取出上清液，加入0．1倍体积的(一20C保存
的)异丙醇，放入一20C保存1h。
接着离心(1000r／min，30min，4C)，沉淀溶
解在0．75mLSDW中(可再离心除去不溶物)。产生
的黏液包含RNA、DNA和碳水化合物，将其转移至灭
菌的离心管中，通过添加相同体积的8mol／LiCl，并且
20C保温至少1h。再次按以上方法沉淀。
将沉淀溶解在500”I，SDW中，并再次离心。将
上清液移人新离心管中，加LiCI．并离心。沉淀溶解
在200ffL250mmol／I。乙酸钾中，RNA用2．5倍体
积的冰乙醇沉淀，并在一20C保温30min，接着再
次沉淀。
用200,uI。80％乙醇洗沉淀，真空下干燥并且最
终溶解在lOo～500,ul。SDW中。对不溶解的物质再
次离心除去，最终的上清液转入一新的离心管中。将
RNA样品在一70C下保存，备用。
1．2．3RNA量的鉴定：RNA最用紫外分光光度计
(UV一756B)测定其质量浓度及A。／A：。。和A。／
A。。。的比值，用1．2％的变性琼脂糖电泳来检测总
RNA完整性。
1．2．4DDRT—PCR和PAGE检测：所用的锚定引
物为￡HT．，M：5’一AAGCTTTTl、TTTTTTA／G／
C一3’(上海生工合成)，以制备的总RNA为模板进
行逆转录反应。每管20“I。反应体系，操作如下：2
”g的总RNA，4．96m．20,umol／L的锚定引物，加
DEPC处理水到ll儿；充分混匀，70C水浴5min，
冰上骤冷；依次加入4pL5×M—MuLVRT逆转录
酶Buffer，2弘I。10mmol／l，4×dNTP．0．5弘L2 U
RNase抑制剂，加DEPC处理水定容至19pI。；37
C水浴5min，加1,ul。M—MuI，V逆转录酶(20U／
止)42C维持60min；后在70C维持】0min，冰上
骤冷。逆转录产物可以立即PCR扩增，也可以放
置一20C保存。
选用了8个随机引物HAP(HAPl，
AeCTTGATTGCC：HAP2，AAGCTTCGACT。
GT{HAP3，AAGCTTTGGTCGA；HAP4，AA—
GCTTCTCAACC：HAP5，AAGCTTAGTAGGC；
HAP6，AAGCTTCGACCAT；HAP7，AAGCTT—
AACGAGG；HAP8，AAGCTTTTACC—GC)(上
海生工合成)，以逆转录产物为模板进行PCR扩增。
反应体系包括：9gI。无菌双蒸水，2p1．10×PCR缓
冲液(pH8．4)，1．2pL25mmol／I。MgCl。，1．6PI
25ffmol／I。4×dNTP混合物，2pI。2Pmol／I．H～
AP，2pL2pmol／LHT。M(与逆转录同)，2pI。逆
转录产物，0．2pL5U／UI，TaqDNA聚合酶，总反
应体系20止。
PCR反应条件：95C、2min；94C、30s，42
C、2min，72C、30s，40个循环；72C延伸5min。
配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶，250V恒压电泳9
h，银染干胶后扫描。
2结果
2．1 RNA产率和纯度：分别提取了铁皮石斛刺激
组和对照组新鲜材料各500mg左右，每组各提了3
管，结果见表l。不论是对照组还是刺激组，从500
mg铁皮石斛新鲜材料中均可得到120～140／xg的
总RNA，平均得率0．27pg／mg。其AⅢ／A。乎均为
1．96，4。／A。。。平均为3．16，显示RNA很纯，没有
被蛋白质或酚等污染；同时，也显示经声波处理的刺
激组均比其对照组所含的总RNA要高，刺激组平
均产率为0．274btg／mg，对照组平均产率为0．266
bLg／mg。
2．2 RNA完整性：对铁皮石斛每一刺激组和对照
组的总RNA进行了1．0％琼脂糖电泳检测，如图1
所示。28S和18S的两条带都比较清晰，且28S的带
亮大约是18s的两倍，说明提取的总RNA完整性
很好。声波刺激组均比对照组的带亮。
2．3 RT—PCR检测：将铁皮石斛响应声波刺激的
处理组和对照组总RNA进行逆转录，再以此为模
万方数据
中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月·587·
裹1 刺激组与对照组总RNA质量比较
Table1 ComparisonoftotalRNAquantitybetween
stimulatedgroupsandcontrolgroups
泳遭S·-C-．s2一c2．srB分别为相对应的声渡刺撒组
和对照组的总RNA电泳垤1
LanesSlCI—SC2，andSa-CxsimuhaneousisolationRNA
e】ectroph。roEramofrel tivesoundstimulationndc trol
groupsre pectively
图1铁皮石斛总RNA(I嚷)1．0％琼脂糖凝胶电泳图
Fig．1Agarosegel(1．O％)electrophorogramoftotal
RNA(1嵋)isolatedfromcallusofD-candidum
板进行差异显示PCR扩增，经6％变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳，银染干胶后扫描，结果如图2所示。
不同的锚定引物和随机引物的PCR产物，经过
6％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，声波刺激组和对照
组比较，具有较为清晰的差异条带，相对分子质量在
240～600bp。而且，多次重复逆转录和RT—PCR产
物，具有稳定的重现率。说明所提的总RNA活性很
好，质量稳定，能够进行后续研究。
3讨论
利用RT—PCR进行分离克隆特定条件下差异显
示的基因，最重要的一点就是必须首先获得完整性良
好的纯化总RNA“。在常规的方法中，通过SDS一盐
酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或
K。离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一
些多糖；透过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留
在上清液中，但即使通过这些步骤仍会发现有相当多
的多糖与RNA混杂在一起”]。所以针对不同的植
物，都需要有一套有效的方法来解决其RNA分离纯
化时多糖的污染，而多糖的污染是提取植物RNA时
SA7和CA7、SC2和CC2、SG3和CG3分别为刺激组与对蹦组
币同的锚定引物和随机引物对。差异最示的条带用箭头标小，M
为已知的分子量标记
SA7andCA7，SC2andCC2．SG3and(1(，3differetuu⋯州r
cn“pl⋯farL anchoredprimerandanarbitraryprimerof
KtimulatedandcontrolgrouDs·respeelively．Bandindicatedby
anHrrowis a differentiallyd splayedbandMis known
molecularsizemarker
图2铁皮石斛总RNA的RT—PCR产物6％PAGE
电泳银染图
Fig·2Sliver-stainedelectrophorogram6％PAGE
analysisofRT—PCRproductfromtotalRNA
extractedfromcallUSofD．carldidum
常遇到的一个棘手问题。在完整的细胞内这些物质在
空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎
后，这些物质就会与RNA相互作用，会形成难溶的
胶状物与RNA共沉淀下来1]；而且多糖可以抑制许
多酶的活性“]，因此如何除去多糖便成为富含多糖植
物进行分子生物学操作中常见的难题。
本实验中，首先采用SDS一盐酸胍处理可以部分
去除一磐多糖；但是由于铁皮石斛中多糖的量太大，
仅通过此法完全去掉RNA中的多糖是不可能的。
因此，采用在K+离子存在的情况下，用预冷的(一
20C)无水乙醇沉淀RNA，可以进一步地除去
RNA中的多糖。在实验中首先采用I。iCl除去多糖．
因此避免了在高浓度K离子存在时会因多糖沉淀
而使RNA和多糖共同沉淀，而达不到去掉多糖的
目的n]。本方法可从大量材料中分离提取高质量的
植物总RNA(图1)，如用酚／氯仿重复抽提一次，其
RNA的纯度会更佳。本方法也适用于微量材料(100
mg左右)。用此方法能够提取到高质量的铁皮石斛
总RNA，并能顺利地进行逆转录和PCR扩增，已筛
选出多条响应声波胁迫的特异裘达的eDNA片段。
对其后续的Northern杂交、克隆测序和全cDNA
的合成等工作正在进行中。
References：
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利用RAPD分析13种石斛属植物的遗传多样性和亲缘关系
王慧中，卢江杰，施农农，应奇才
(杭州师范学院生物化学与分子生物学杭州市重点实验室。浙江杭州 310036)
摘要：目的通过对18种石斛属植物进行遗传多样性和亲缘关系分析．为更好地开发利用石斛资源奠定基础。
方涪随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析遗传多样性，UPGMA类平均法进行聚类分析。结果利用筛选出
的lO个随机引物对供试材料DNA进行随机扩增，共得到188条带．其中多态性带有180条，多态性百分率为
95．74％。采用uPGMA类平均法对扩增出的谱带进行遗传聚类分析，得出反映各种间亲缘关系的树状图。在遗传
距离(D)一0．63处，可将供试材料分为3类，RAPD对基因组的分析结果与传统分类学的结果差异不大。结论该
标记技术对石斛属植物的遗传多样性和分类研究是可行的。
关键词：石斛属；RAPD；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：R282．7 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2006)Od一058805
Analysisofgeneticd versityandaffinityrelationshipsamong13 pecies
ofDendrobiumSw．byRAPD
WANGHui—zhong，LUJiang—jie，SHINong—nong．YINGQi—eai
(KeyLaboratoryofHangzhouCityforBiochemistryandMolecularBiology，HangzhouNormalCo lege，
Hangzhou310036，China)
Abstract：ObjectiveG neticd versityandaffinityrelationshipsamong13speciesofDendrobiumSw．
wereanalyzed．theresult1aida solidfoundationforthebetteruseofthisresources．MethodsRandom
amplifiedpolymorphieDNA(RAPD)techniquewasusedtoanalyzegeneticd versity，andthedendrogram
wasconstructedbyUPGMA．ResultsTenRAPDprimerswereappliedtodorandomamplification．A
totalof188DNAbandswasdetected，180amongwhichwerepolymorphic，theaveragerateof
polymorphiebandswas95．74％．TheresultofclusteranalysisbyusingUPGMAmethodshowedthat13
genotypescouldbeclassifiedintothreetypesingeneticd stance0．63．Thisoutcomewascorrespondingto
theresultbyusingtraditionalclassification．ConclusionItisconcludedthatRAPDmarkerscanbeused
onthestudiesofgeneticrelationshipsandcla sificationofspeciesofDendrobiumSw．sensitively．
Keywords：DendrohiumSw．；RAPD；geneticdiversity；geneticrelationships
兰科(Orchidaeeae)石斛属(DendrobiumSw．)
植物除了观赏之外，不少还是珍贵的药用植物。国内
外学者已对石斛属37种植物进行了化学成分分析，
从中分离鉴定出生物碱类、多糖类、倍半萜类、菲醌
类、联苄类、芴酮类、香豆素类以及挥发油等多种化
学成分，并对其药理活性进行了研究⋯。目前有关石
鉴量是警i筹翌善誓朵科学摹金(3。【4。6)，浙江省。】5】．和抗期市。131，A才基金资助项目
作者简介：王慧中(1962)，男．教授，博士，主要从事植物分子生物学研究。Tel：(0571)28865198Email：whz62@163．c。m
万方数据
铁皮石斛RNA提取及RT-PCR检测
作者： 李标， 王伯初， 唐坤， 刘毅， 戴传云， 段传人， LI Biao， WANG Bo-chu， TANG Kun
， LIU Yi， DAI Chuan-yun， DUAN Chuan-ren
作者单位： 李标,王伯初,唐坤,LI Biao,WANG Bo-chu,TANG Kun(重庆邮电学院生物信息学院,重庆
,400065;重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆,400044)， 刘
毅,LIU Yi(重庆邮电学院生物信息学院,重庆,400065)， 戴传云,段传人,DAI Chuan-
yun,DUAN Chuan-ren(重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆
,400044)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(4)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200604041.aspx