全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 1期，第 201-208页
Molecular Plant Breeding, 2010, Vol.8, No.1, 201-208
技术改进
Upgraded Technology
剑麻不同组织 RNA提取方法比较分析
张燕梅 周文钊 * 李俊峰
中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,湛江, 524091
*通讯作者, zwenzhao@163.com
摘 要 本研究以剑麻茎尖、花和成熟叶片为材料，比较了 SDSⅠ、SDSⅡ、CTABⅠ、CTABⅡ共 4种提取缓
冲液组成以及 Promega公司 RNA提取试剂盒、Qiagen植物 RNA分离试剂盒、改良 Trizol法、改良 SDSⅠ
法、改良 CTABⅠ法以及优化后的改良 CTABⅠ法等 6种 RNA提取方法提取 RNA的效果，结果表明：不同
缓冲液组成对实验结果影响很大，其中缓冲液 CTABⅠ提取的 RNA质量和产率均较理想。6种 RNA提取方
法提取的 RNA差异明显，其中优化后的改良 CTABⅠ法可同时适合于剑麻茎尖、花和成熟叶片 RNA的提
取，不仅产率高，而且 RNA的质量也较好，无 DNA污染，OD260/OD280分别为 1.87、2.04和 1.98，OD260/OD230分
别为 2.46、2.10和 2.15，产率分别为 84.7 μg/g FW、65.8 μg/g FW和 4 μg/g FW。用该方法提取的 RNA可满足
下一步文库构建及基因克隆等分子生物学研究。
关键词 剑麻, RNA提取,优化后的改良 CTABⅠ法,茎尖,花,成熟叶片
Comparative Analysis of Different RNA Isolation Methods for Dissimilar
Tissues of Sisal
Zhang Yanmei ZhouWenzhao * Li Junfeng
South Subtropical CropsResearch Institute, ChineseAcademyofTropical Agricultural Sciences, Zhanjiang, 524091
* Corresponding author, zwenzhao@163.com
DOI: 10.3969/mpb.008.000201
Abstract In this research, shoot-tip, flower and matured leaf of sisal were used as experiment materials for RNA
isolation. Effects on isolating RNA with four RNA isolation buffers, which are SDSⅠ , SDSⅡ , CTABⅠ , and
CTABⅡ, and six isolation methods including RNeasy Plant Mini Kit of Qiagen, SV total RNA isolation system of
Promega, modified Trizol reagent, modified SDSⅠ, modified CTABⅠ, and optimizing modified CTABⅠ are an-
alyzed and compared. The results showed that different RNA isolation buffers had great effect on the experimental
result, desirable yield and quality RNA can be extracted with CTABⅠ buffer, There were significant difference a-
mong the RNA isolated by using the six isolation methods. and the optimizing modified CTABⅠ was considered
to be the most favorable methods for RNA isolation from all shoot-tip, flower and matured leaf of sisa, RNA with
high yield and quality, and had not DNA contamination could be obtained, the OD260/OD280 of shoot-tip, flower and
matured leaf were 1.87, 2.04 and 1.98 respectively, OD260/OD230 were 2.46, 2.10 and 2.15, respectively, and the
yields of flower, shoot-tip and matured leaf were 65.8 μg/g FW, 84.7 μg/g FW, and 42.3 μg/g FW respectively.
RNA isolated by this method could be used to further study of molecular biology such as cDNA library construc-
tion and gene clone.
Keywords Sisal (Agaves sisalanae), RNA isolation, Optimizingmodified CTABⅠ, Shoot-tip, Flower,Matured leaf
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.008.000201
基金项目：本研究由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(sscri200802)、现代农
业产业技术体系建设专项(nycytx-19-E02)和 2007年公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-018)共同资助
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
剑麻是我国主要的热带纤维作物，叶片肥厚，含
有丰富的纤维、皂苷元、蛋白质以及多糖等，剑麻茎
尖和花含有丰富的蛋白质、多糖、多酚以及未知的次
生代谢物，在 RNA提取过程中，这些物质可与 RNA
共沉淀，严重影响了 RNA提取的质量和产率。目前，
国内外对剑麻的分子生物学研究开展不多，王蔚和
周文钊(2008)分别用改良 SDS法和改良 CTAB法对
剑麻 H.11648幼嫩叶片进行 RNA提取，结果表明两
者均可从剑麻叶片中成功提取 RNA，但改良 CTAB
法更适合于剑麻 H.11648幼嫩叶片 RNA提取，不仅
得率高而且无污染，并已用于剑麻 PAL基因的克
隆。魣vila-Fernández 等 (2007)采用 Bio-rad 公司的
RNA 提取试剂盒从蓝剑麻叶片中分离出完整的
RNA，并用于 1-SST基因的克隆。目前已报道的成功
提取植物 RNA 的方法很多，有试剂盒法 (魣vi-
la-Fernández et al., 2007)、改良 SDS/CTAB 法 (王蔚
和周文钊, 2008)、Trizol法、热硼酸法以及异硫氰酸胍
法(赵锦等, 2009)等，由于不同植物、同一植物不同组
织、同一组织的不同季节内含物成分不同，在具体的
操作过程中对 RNA提取方法要求也不一样，到目前
还没有普遍适用的植物 RNA分离方法。本研究以剑
麻茎尖、花和成熟叶片为材料，通过对 Promega RNA
提取试剂盒、Qiagen RNA提取试剂盒、改良 Trizol
法、改良 SDSⅠ法、改良 CTABⅠ法及优化后的改良
CTABⅠ法进行比较分析，建立了一套适合于剑麻茎
尖、花和成熟叶片 RNA提取的改良 CTABⅠ法，对下
一步开展剑麻分子生物学研究具有十分重要的意义。
1结果与分析
1.1 RNA提取缓冲液对 RNA质量的影响
实验比较分析表明(图 1;表 1)：丙酮的加入与否对
实验结果影响很大，在加入提取缓冲液前，先用丙酮
抽提可大大提高 RNA的质量和产率，并且可以减少
氯仿:异戊醇抽提的次数。未进行丙酮抽提的样品大
图 1不同缓冲液提取的 RNA电泳检测
注: A~H与表 4中相同; 1,2,3分别为剑麻花、茎尖和成熟叶片
Figure 1 Electrophoresis analysis of RNA isolated with different buffers
Note: A~H: See the table 4; 1,2,3 represent flower, shoot-tip and matured leaf of sisal, respectively
注: A~H:见表 1;“-”表示没有提到或产率很低; 1,2,3分别为
剑麻花、茎尖和成熟叶片
Note: A~H: See the table 1;“-”indicated low yield or no RNA;
1,2,3 represent flower, shoot-tip and matured leaf of sisal respec-
tively
表 1不同提取缓冲液提取的 RNA吸光度比值和产率
Table 1 The absorbance ratios and yields of RNA isolated with
different buffers
编号
Serial No.
A
B
C
D
E
F
G
H
组织
Tissue
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
OD260/OD280
1.87
2.05
2.04
1.88
2.04
1.96
2.01
1.95
2.00
1.74
2.00
1.18
1.89
1.77
2.10
1.54
1.62
1.78
1.74
1.83
1.18
0.99
1.52
0.86
OD260/OD230
2.04
2.11
2.25
2.11
2.21
2.11
2.21
2.21
2.06
0.63
2.21
0.65
2.29
2.55
1.79
1.79
2.38
2.27
0.62
1.63
0.65
0.71
0.84
0.52
得率(μg/g FW)
Yield (μg/g FW)
85.00
179.52
44.60
8.03
125.44
11.80
108.10
286.90
91.20
-
24.00
-
5.60
186.00
2.50
1.40
80.00
1.70
-
35.50
-
-
0.90
-
吸光度比值
Absorbance ratios
多数未能成功分离出完整的 RNA或产率太低，并且
加样孔有不同强度的荧光。同样的实验材料和方法，
不同的 RNA提取缓冲液间实验结果相差较大，其中，
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DOI: 10.3969/mpb.008.000201202
图 2不同提取方法 RNA电泳检测
注: A~F分别对应为 Promega RNA提取试剂盒、Qiagen RNA提取试剂盒、改良 Trizol法、改良 SDSⅠ法、改良 CTABⅠ法和优
化后的改良 CTABⅠ法; 1,2,3分别为剑麻花、茎尖和成熟叶片
Figure 2 Electrophoresis analysis of RNA isolated by five different methods
Note: A~F are SV total RNA isolatedion system (Promega), RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), modified Trizol，modified SDSⅠ, modi-
fied CTABⅠ and modified CTABⅠ after optimizing, respectively ; 1,2,3: Sisal flower, shoot-tip and matured leaf with different
buffers, respectively
表 4不同提取方法提取的剑麻 RNA吸光度比值和产率
Table 4 The absorbance ratios and yield of total RNA by six
RNA isolation methods
组织
Tissue
茎尖
Shoot-tip
花
Flower
成熟叶
Matured
leaf
提取方法
Isolation
method
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
OD260/OD280
2.09
2.07
1.86
2.05
1.92
1.87
1.91
1.92
1.80
1.87
2.01
2.04
1.64
1.98
1.84
2.04
2.00
1.98
OD260/OD230
2.23
2.31
1.60
2.11
2.24
2.46
0.03
1.93
1.14
2.14
2.21
2.10
0.24
2.03
0.95
2.25
2.26
2.15
得率(μg/g FW)
Yield (μg/g FW)
32.40
19.90
23.50
179.52
290.70
84.70
20.80
8.90
-
85.00
108.10
65.80
19.60
-
-
44.60
91.20
42.30
注: 1: Qiagen RNA提取试剂盒; 2: Promega RNA提取试剂盒;
3:改良 Trizol法; 4:改良 SDS法Ⅰ; 5:改良 CTAB法Ⅰ; 6:优
化后的改良 CTAB法Ⅰ
Note: 1: RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); 2: SV total RNA isola
tion system (Promega); 3: Modified Trizol; 4: Modified SDSⅠ; 5:
Modified CTABⅠ; 6: Optimizing modified CTABⅠ
吸光度比值
Absorbance ratios
用 CTABⅠ缓冲液和丙酮组合提取的 RNA质量和产
率较理想，OD260/OD280在 2.0左右，花、茎尖和成熟叶
片 RNA 产率分别为 108.1 μg/g FW，286.9 μg/g FW
以及 91.2 μg/g FW，其次是 SDSⅠ和丙酮组合，
OD260/OD280在 1.87~2.05之间，花、茎尖和成熟叶片
RNA 产率分别为 85 μg/g FW，179.52 μg/g FW 和
44.6 μg/g FW，SDSⅡ和丙酮组合，OD260/OD280 在
1.88~2.04之间，花、茎尖和成熟叶片 RNA产率分别为
8.03μg/gFW，125.44 μg/g FW和 11.8 μg/g FW，采用
CTABⅡ、CTABⅠ和无丙酮组合无法成功的从剑麻
花和成熟叶中分离出完整的 RNA。
1.2不同 RNA提取方法比较
本研究采用六种较常用的 RNA提取方法对剑
麻茎尖、花和成熟叶片分别进行 RNA提取和分析
(图 2;表 2)，结果表明：Qiagen RNA提取试剂盒可成
功从剑麻组织中提取 RNA，OD260/OD280和 OD260/OD230
也均在 2.0左右，但电泳检测有 DNA污染，加样孔
有残留，得率也相对较低。Promega RNA提取试剂盒
虽无 DNA污染，但得率太低，加样孔有残留，该试剂
盒未能成功的从剑麻叶片中分离出完整的 RNA。改
良 Trizol法可从茎尖中提取到 RNA，但有 DNA污
染，电泳检测 RNA已降解，实验过程中发现有大量
可见白色物质，该物质无法迅速溶解，并且
OD260/OD230均在 1.6左右，不适合于后续实验，产率
太低。该方法未能从剑麻花和叶片中分离到完整的
RNA。改良 SDSⅠ和改良 CTABⅠ可成功的从剑麻
组织中分离出完整的 RNA，OD260/OD280均在 2.0 左
右，OD260/OD230大于 2.0，而且产率也较高，但有不同
程度的 DNA污染。相对于改良 CTABⅠ而言，优化
后的改良 CTABⅠ法更适合于剑麻组织 RNA提取，
不仅质量好，产率也相对较高，并且无 DNA污染，可
直接进行下一步实验。并且比较发现，同一方法，剑
麻茎尖的 RNA产率较剑麻花和叶片要高，用优化后
的改良 CTABⅠ法提取三种剑麻组织的 RNA，产率
依次为 84.7g/g FW、65.8 g/g FW和 42.3 g/g FW。
剑麻不同组织 RNA提取方法比较分析
Comparative Analysis of Different RNA Isolation Methods for Dissimilar Tissues of Sisal 203
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
1.3不同影响因子对 RNA质量的影响分析
为了获得较高质量的 RNA，在实验过程中，用
改良 SDSⅠ和改良 CTABⅠ两种方法，以剑麻茎尖
为试材，对影响 RNA质量的主要影响因子进行优
化，结果如表 3所示：采用改良 SDSⅠ法在第一次 CI
抽提后再采用水饱和酚:氯仿:异戊醇抽提的效果比
采用 Tris饱和酚:氯仿:异戊醇和氯仿:异戊醇抽提的
效果要好，主要表现为 RNA的质量较高，但得率相
对较低，采用 Tris饱和酚:氯仿:异戊醇抽提得率较
高，但 OD260/OD230均小于 2.0，即 RNA中含有多糖杂
质，不适合后续实验。采用氯仿:异戊醇抽提 RNA质
量和得率均较为理想，但实验过程中发现，用氯仿:异
戊醇抽提时，前几次离心后界面分层不是很明显，不
利于上清的吸取，而且抽提次数也较多。采用改良
CTABⅠ法则在 CI抽提后用 Tris饱和酚:氯仿:异戊
醇抽提效果最好。另外在第一次 CI抽提后 PCI抽提
前加入 1/4体积无水乙醇和 0.11体积 5 mol/L醋酸钾
有利于多糖沉淀和蛋白质去除，但 RNA的得率反比
不加入时低。实验还发现，4℃与-20℃RNA沉淀效果
虽无明显差异，但-20℃沉淀效果整体上要优于 4℃
沉淀效果，建议在实验过程中采用-20℃沉淀。此外，
电泳检测结果显示所有优化组合均存在不同程度的
DNA污染，因此，为保证后续实验的顺利进行，在进行
LiCl沉淀后，用 DNaseⅠ处理 15 min以消除 DNA。
1.4剑麻不同组织 RNA提取方法的建立
通过对不同提取方法，不同缓冲液组成以及实验
过程中主要影响因子优化组合实验结果分析比较，组
合(13)提取的 RNA质量和产率较为理想，即在加入提
取缓冲液之前，用 70%丙酮抽提 2~3次，然后加入
65℃预热的 CTABⅠ缓冲液，65℃温浴 15~30 min，加
入等体积氯仿:异戊醇，彻底混匀后离心，取上清，然后
依次加入等体积的 Tris饱和酚:氯仿:异戊醇和氯仿:异
戊醇抽提 1~2次，取上清，加入 1/2体积 9 mol/L的
LiCl，充分混匀后-20℃沉淀 2 h，12 000 r/min，4℃离
心 20 min；按比例加入一定量的 DNaseⅠ、DNaseⅠ
Buffer和 RNA酶抑制剂，37℃温浴 15 min，用 ddH2O
补足 1 mL，依次加入等体积水饱和酚:氯仿:异戊醇和
氯仿: 异戊醇抽提 1次，12 000 r/min，4℃离心 10 min；
取上清，加入 2.5 倍无水乙醇和 1/10 体积 3 mol/L
NaAc，-20℃沉淀 2 h，12 000 r/min，4℃离心 20 min；
分别用 70%无水乙醇和无水乙醇各洗涤 1次，晾干
后用 40 μL 0.1% DEPC 水溶解沉淀，-80℃保存备
用。用该方法提取的剑麻茎尖、花和成熟叶片总
RNAOD260/OD280分别为 1.87、2.04和 1.98，OD260/OD230
分别为 2.46、2.10和 2.15，产率分别为 84.7 μg/g FW、
65.8 μg/g FW和 42.3 μg/g FW。
2讨论
获得高质量的 RNA是开展分子生物学研究的
基础和前提。尽管目前在许多植物中已成功分离出
高质量 RNA，并且有商业化的适合于植物 RNA提
取的试剂盒，但由于不同植物组织细胞内外成分的
复杂性和多样性，对 RNA提取要求也不一样。采用
试剂盒和 Trizol试剂提取 RNA操作简便，省时省
力，也成功的从许多植物中分离出高质量的 RNA
(赵锦等, 2009)，但并不适合剑麻组织 RNA的分离，
编号
Serial
No.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
(24)
提取缓冲液
Isolated buffer
改良 SDSⅠ
Modified
SDSⅠ
改良 CTABⅠ
Modified
CTABⅠ
表 3不同优化组合 RNA质量比较
Table 3 Comparative analysis of RNA isolated by different opti-
mizing combinations
OD260/OD280
2.04
1.94
1.98
2.04
2.02
2.05
2.04
2.04
1.35
1.72
2.06
2.04
1.95
1.89
1.81
1.99
1.98
1.92
1.57
2.03
1.85
2.01
1.78
1.91
OD260/OD230
1.58
1.61
1.45
2.28
2.07
2.11
1.69
2.23
1.40
2.31
2.25
2.12
2.21
2.20
2.15
2.18
2.33
2.24
1.62
2.20
0.88
2.00
2.57
1.80
得率(μg/g FW)
Yield (μg/g FW)
245.30
212.80
160.00
112.30
92.00
179.50
137.30
152.00
123.60
121.60
228.00
226.70
286.90
286.90
305.16
221.87
233.87
290.70
179.20
220.00
192.00
99.52
179.20
120.64
吸光度比值
Absorbance ratios
注: (1)~(24):见表 5
Note: (1)~(24): See the table 5
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DOI: 10.3969/mpb.008.000201204
改良 SDSⅠ和改良 CTABⅠ法在剑麻茎尖中可分离
出较高质量的 RNA，但并不适合剑麻花和成熟叶片
RNA的分离。因此，探索出适合于剑麻不同组织
RNA提取方法尤为重要。
本研究在综合相关研究的基础上，摸索出一种同
时适合于剑麻茎尖、花和成熟叶片 RNA提取的方法，
该方法的主要特点在于：(1)在液氮研磨时加入少量石
英砂和高浓度的 PVP40。石英砂可以使样品在短时间
内研磨更充分，更彻底，尤其是对于富含纤维的剑麻
叶片而言，更有利于组织破碎，PVP作为多酚化合物
的螯合剂，具有很强的结合酚类物质的能力，在核酸
提取过程中能有效地防止酚类等次生代谢物与 RNA
的结合，从而保证的 RNA 的质量(Emine and Sule,
2004)。(2)在加入提取缓冲液之前先用 70%丙酮和 2%
的 β-巯基乙醇抽提样品。有效去除蛋白质和多糖等
杂质一直是 RNA提取过程中的难点和重点，剑麻组
织尤其是剑麻茎尖富含丰富的蛋白质和多糖，在
RNA提取过程中，常常与 RNA共沉淀，从而影响
RNA的质量和产率。实验过程中发现，未经丙酮处理
的样品比较粘稠，在后续的氯仿:异戊醇抽提时，必须
抽提数次才能使界面清晰，而且提取的 RNA大多有
蛋白质污染，产率也较低，用丙酮处理的样品则相对
松散，RNA的产率和质量较高，而且还可以减少氯
仿：异戊醇抽提的次数。丙酮作为一种有机溶解，可
有效的去除多糖、多酚、蛋白质以及色素等次生代谢
物质，在进行提取之前先用 70%丙酮抽提，减少了其
对 RNA干扰的机会，保证了 RNA的质量和产率，并
且 β-巯基乙醇作为强还原剂能有效地防止酚类物
质与 RNA结合(Hu et al., 2002)。并且高浓度 PVP和
β-巯基乙醇协同作用，可能更有效抑制酚类物质的
干扰(张今今等, 2003)。肖洁凝等(肖洁凝等, 2003)提
取芒果子叶的 RNA时发现采用 70%丙酮处理后的
RNA质量和产率明显优于未经丙酮的样品。(3)在进
行酚:氯仿:异戊醇抽提之前，先用等体积的氯仿:异戊
醇抽提一次。并且实验结果也表明先用氯仿:异戊醇
抽提，然后再用酚:氯仿:异戊醇抽提的效果比直接用
酚:氯仿:异戊醇抽提的效果好。可能是因为先用氯仿:
异戊醇抽提有效降低了提取缓冲液中的盐类对酚:氯
仿:异戊醇抽提效果的干扰(Kam-Lock et al., 2007)。
(4)在用 LiCl沉淀后，用 DNaseⅠ处理 15~20 min，并
且用酚:氯仿:异戊醇和氯仿:异戊醇各抽提一次。目前
尽管许多方法报道说 LiCl可选择性沉淀 RNA，并且
低 pH值的饱和酚可有效将 DNA和 RNA分开，但
在本研究中，任何一种方法提取的 RNA均有不同程
度的 DNA污染，为了减少后续实验中 DNA对实验
结果的影响，在 RNA提取的过程中用 DNaseⅠ进
行处理，既保证了 RNA的质量，又方便省力。此外，
用酚:氯仿:异戊醇和氯仿:异戊醇各抽提一次，然后
加入 1/10 体积的 3 mol/L NaAc 和 2.5 倍无水乙醇
二次沉淀 RNA，既可以除去因 DNaseⅠ处理时引入
的杂质，同时也可进一步彻底去除第一次未完全除
去的杂质，从而保证了 RNA的质量。并且二次沉淀
可除去残留的 Li+和 Cl-对后续实验的干扰(王玉成
等 , 2002)。低浓度无水乙醇 (Tesniere and Vayda,
1991)和醋酸钾(Ainsworth, 1994)或者两者联合使用
可有效去除多糖，本研究也有相同的结果，但在保
证 RNA质量的前提下，考虑到 RNA 的产率，将此
步骤省略。
一般地，RNA提取缓冲液的主要成分有去污剂
(如 SDS, CTAB 等)及一些盐类(如 EDTA, NaCl 和
Tris-Cl等)，去污剂主要作用是使蛋白质变性，破坏
膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，使核酸游离
出来，盐类则是提供一个良好的裂解环境并维持核
酸结构的稳定，防止核酸酶在裂解过程中对核酸的
破坏。实验结果表明，不同缓冲液成分对 RNA的提
取结果影响较大，SDSⅠ、SDSⅡ、CTABⅠ、CTABⅡ
四种缓冲液 RNA 提取效果依次为 CTABⅠ优于
SDSⅠ，SDSⅠ优于 SDSⅡ，而 CTABⅡ几乎未能提
出完整的 RNA。CTAB和 SDS均具有较好的裂解去
污作用，并且已成功的从许多植物中分离出高质量的
RNA,并应用于分子生物学研究(Kansal et al., 2008;
Louime et al., 2008)，但本研究认为 CTAB效果更好，
更适合于剑麻组织的 RNA提取，实验结果与王蔚和
周文钊(2008)的基本一致，初步推测可能与植物组织
内含物成分有关。研究还发现，SDSⅠ的效果优于
SDSⅡ，可能是因为硼酸的氢上有四个键比盐酸的氢
离子上多了三个键,更容易和多糖结合，从而减少了
多糖对 RNA的干扰, 并且在香蕉果实总 RNA提取
时也发现，用 Tris-硼酸替代Tris-盐酸，更容易去除
多糖(陈弟等，2008)。Fang等(1992)认为提高缓冲液
中 NaCl浓度也可有效去除多糖，Louime等(2008)利
用缓冲液 CTABⅡ成功的从 Muscadine grape culti
vars (Vitis Rotundifoli Michx) 叶片中分离出完整的
RNA，并成功的克隆了葡萄查尔酮合成酶基因的部
分序列。但本研究中采用 CTABⅡ缓冲液均未获得
理想的结果。
鉴于此，尽管目前提取 RNA的方法很多，也有
很多成功的例子，但对特定的实验材料而言，必须根
剑麻不同组织 RNA提取方法比较分析
Comparative Analysis of Different RNA Isolation Methods for Dissimilar Tissues of Sisal 205
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
据具体情况做适当的调整，并且尽可能的减少
RNase对核酸的干扰。
3材料与方法
3.1 植物材料
剑麻 H.11648茎尖、花以及成熟叶片，其中茎尖
和花分别于三月底和七月初采自广西山圩农场，成熟
叶片于八月中旬采自南亚热带作物研究所剑麻种质
资源圃，所取材料经液氮速冻后于-80℃保存备用。
3.2实验试剂
试剂盒为 Qiagen和 Promega公司植物 RNA提
取试剂盒，Trizol试剂购自 Invitrogen公司。改良 SDS
提取缓冲液Ⅰ：50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.15 mol/L
Tris，0.575 mol/L硼酸，0.5 mol/L NaCl，4% SDS，2%
β- 巯基乙醇；改良SDS 提取缓冲液Ⅱ：50 mmol/L
EDTA (pH 8.0)，0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)，1.4 mol/L
NaCl，2%SDS，2%β-巯基乙醇。改良 CTAB提取缓冲
液Ⅰ：2% CTAB，100 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1.4 mol/L
NaCl，20 mmol/L EDTA (pH8.0)，2% β-巯基乙醇；改
良 CTAB 提取缓冲液Ⅱ：2% CTAB，100 mmol/L
Tris-Cl (pH 8.0)，2.0mol/LNaCl，2%PVP40，25 mmol/L
EDTA，0.5g/L Spermidine，3% β-巯基乙醇。β-巯基
乙醇用前加入。在研磨时加入 10%的 PVP40。
提取 RNA所用试剂及耗材均用 0.1% DEPC水
处理过夜，然后高压灭菌。不能用 DEPC处理的试剂
用灭菌的 DEPC水配置。研钵及玻璃器皿 180℃烘烤
6 h。所有试剂配置方法均参考分子克隆第三版(萨姆
布鲁克等, 2002)，所有操作均在超净工作台上进行。
3.3 RNA提取方法
试剂盒提取：具体操作按试剂盒说明书进行。
改良 Trizol法：取 1 g样品加入 0.1 g PVP40，迅
速用液氮研磨成粉末，加入 4 mL 70%丙酮(2% β-
巯基乙醇)，充分混匀，8 000 r/min，10℃离心 3 min，
重复 1~2次。然后加入 4 mL Trizol裂解液，室温放
置 5 min，加入 800 μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混
匀后 12 000 r/min离心 10 min，取上清，加入 800 μL
氯仿:异戊醇(24:1)抽提，最后加入 2 mL异丙醇室温静
置 30 min以沉淀核酸，沉淀经 70%乙醇和无水乙醇各
洗涤 1次后用 ddH2O溶解，并于-80℃保存备用。
改良 SDS法和改良 CTAB法：改良 SDS法参照
肖洁凝等(2003)芒果子叶 RNA提取方法并略做改进。
改良 CTAB法在王蔚和周文钊(2008)的方法上做适当
改进。首先以剑麻茎尖、花和成熟叶片为试材，对丙酮
的有无和 SDSⅠ、SDSⅡ、CTABⅠ、CTABⅡ 4 种
RNA提取缓冲液进行初步筛选(表 4)，选取 RNA提取
效果较好的缓冲液作为下一步 RNA提取的缓冲液。
同时结合已报道的其它植物 RNA成功提取的方法，
用改良 SDSⅠ和改良 CTABⅠ两种方法，以剑麻茎尖
表 4 RNA提取缓冲液组合
Table 4 RNA isolated buffer
编号
Serial No.
A
B
C
D
E
F
G
H
加入 /不加入丙酮
Acetone(plus/free)
加入丙酮
Add acetone
不加入丙酮
Acetone free
提取方法
Isolated method
改良 SDSⅠ
Modified SDSⅠ
改良 SDSⅡ
Modified SDSⅡ
改良 CTABⅠ
Modified CTABⅠ
改良 CTABⅡ
Modified CTABⅡ
改良 SDSⅠ
Modified SDSⅠ
改良 SDSⅡ
Modified SDSⅡ
改良 CTABⅠ
Modified CTABⅠ
改良 CTABⅡ
Modified CTABⅡ
缓冲液组成
Buffer composition
50 mmol/L EDTA (pH 8.0), 0.15 mol/L Tris, 0.575 mol/L boric acid,
0.5 mol/L NaCl, 4% SDS, 2% β-Mercaptoethanol
50 mmol/L EDTA (pH 8.0), 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.4), 1.4 mol/L
NaCl, 2% SDS, 2% β-Mercaptoethanol
2%CTAB, 0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L
EDTA(pH 8.0), 2% β-Mercaptoethanol
2% CTAB, 2% PVP40, 0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0), 2.0 mol/L NaCl,
25 mmol/L EDTA, 0.5 g/L Spermidine, 3% β-Mercaptoethanol
50 mmol/L EDTA (pH 8.0), 0.15 mol/L Tris, 0.575 mol/L boric acid,
0.5 mol/L NaCl, 4% SDS, 2% β-Mercaptoethanol
50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)，1.4 mol/L
NaCl, 2% SDS, 2% β-Mercaptoethanol
2% CTAB, 0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0), 1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L
EDTA(pH 8.0)，2% β-Mercaptoethanol
2% CTAB, 2% PVP40, 0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0), 2.0 mol/L NaCl,
25 mmol/L EDTA, 0.5 g/L Spermidine, 3% β-Mercaptoethanol
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.008.000201206
为试材，对操作过程中的一些影响因子进行不同组合
的比较和优化(表 5)。
3.4 RNA检测
用 Eppendorf Biophotometre核酸蛋白分析仪测
定 OD230、OD260、OD280以及 OD320的值，用 OD260/OD280，
OD260/OD230检测 RNA的纯度。用 1×TAE，1%琼脂糖
凝胶检测 RNA的完整性。RNA得率=A260×N(稀释
倍数)×40 μg/mL×V (体积)/样品重(g)。
致谢
样品采集和实验过程中分别得到广西山圩农场
表 5剑麻茎尖总 RNA提取方法优化
Table 5 Optimizing of total RNA isolated methods for sisal shoot-tip
编号
Serial No.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
(24)
方法
Methods
改良 SDSⅠ
Modified SDSⅠ
改良 CTABⅠ
Modified CTABⅠ
加入等体积 PCI (pH 7.8)抽提
Additional equal-volume PCI (pH 7.8) extraction
加入等体积 PCI (pH4.5)抽提
Additional equal-volume PCI (pH4.5) extraction
加入等体积 CI抽提
Additional equal-volume CI extraction
加入等体积 PCI (pH 7.8)抽提
Additional equal-volume PCI (pH 7.8) extraction
加入等体积 PCI (Ph 4.5)抽提
Additional equal-volume PCI (pH 4.5) extraction
加入等体积 CI抽提
Additional equal-volume CI extraction
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
注: A:不加入 1/4体积无水乙醇和 0.11体积 5 mol/L醋酸钾; B:加入 1/4体积无水乙醇和 0.11体积 5 mol/L醋酸钾; 1: 4℃,1/2
9 mol/L 氯化锂沉淀 2 h; 2: -20℃, 1/2 9 mol/L 氯化锂沉淀 2 h; PCI (pH 7.8), Tris 饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1, v/v/v); PCI
(pH 4.5), 水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1, v/v/v); CI:氯仿:异戊醇(24:1, v/v)
Note: A: Ethanol and KAc free; B: Additional 1/4 volumes 100% ethanol, 0.11 volumes 5mol/L KAc; 1: 1/2 volumes 9 mol/L LiCl, in-
cubated 2 h at 4℃; 2: 1/2 volumes 9 mol/L LiCl, incubated 2 h at-20℃; PCI (pH 7.8), Tris-saturated phenol: chloroform: isoamyl alcohol
=25:24:1 (v/v/v); PCI (pH 4.5), water-saturated phenol: chloroform: isoamyl alcohol=25:24:1 (v/v/v); CI: chloroform: isoamyl alcohol
=24:1(v/v)
影响因子
Effect factors
工作人员、同事张浩和实验室工作人员梁辉的帮助，
在此表示感谢。
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