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正交试验优选白芨多糖硫酸酯化工艺的研究
陈景耀1, 2, 吴国荣23 , 王建安2, 陆长梅2, 张卫明3, 蒋继宏1Ξ
(11 江苏省药用植物生物技术重点实验室, 江苏 徐州　221116; 21 南京师范大学生命科学学院,
江苏 南京　210097; 31 南京野生植物综合利用研究院, 江苏 南京　210042)
摘　要: 目的　优选白芨多糖硫酸酯化的最佳工艺。方法　采用氯磺酸2吡啶法合成白芨多糖硫酸酯。以取代度和
产物量为指标, 采用L 9 (34)正交设计对试剂比例、反应温度和反应时间进行优选。结果　吡啶和氯磺酸比例 6∶1,
反应温度 85 ℃, 反应时间 2 h 为比较适宜的工艺条件。结论　白芨多糖硫酸酯化优化的工艺条件方法可行, 为进一
步扩大试验提供了有价值的参数。
关键词: 白芨多糖; 硫酸酯化; 正交设计
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2005) 01 0043 04
Sulfa tion techn iques of B letilla s tr ia ta polysacchar ide by orthogona l design
CH EN J ing2yao 1, 2, W U Guo2rong2, W AN G J ian2an2, LU Chang2m ei2,
ZHAN G W ei2m ing3, J IAN G J i2hong1
(11 P rovincia l Key L abo rato ry of B io techno logy on M edicinal P lan ts, Xuzhou 221116, Ch ina; 21 Co llege of L ife Science,
N an jing N o rm al U niversity, N an jing 210097, Ch ina; 31 N anjing Inst itu te fo r Comp rehensive U tilizat ion
of W ild P lan ts, N an jing 210042, Ch ina)
Abstract: Objective　To op t im ize the su lfa t ion2condit ion s of B letilla stria ta po lysaccharide (BSPS) 1
M ethods　BSPS w as su lfa ted w ith ch lo rsu lfon ic acid2pyrid ine1 R eagen t p ropo rt ion, react ion temperatu re,
and react ion t im e w ere selected w ith sub st itu t ion degree and yield as index by L 9 (34) o rthogonal design1
Results　R esu lts show ed that the condit ion w ith 6∶1 vo lum e rat io of pyrid ine and ch lo rine su lfon ic acid,
react ion temperatu re of 85 ℃, react ion t im e of 2 h w as the op t im um 1 Conclusion 　T he op t im al m ethod
fo r su lfa t ion of BSPS is feasib le, and it p rovides valuab le param eters fo r fu rther en larged test1
Key words: B letilla stria ta (T hunb1) R eichb. f. po lysaccharide (BSPS) ; su lfa t ion; o rthogonal design
　　许多植物多糖具有提高免疫能力、抗病毒、抗肿
瘤、抗氧化、抗凝血等生物学活性, 因此对植物多糖
的研究越来越受到人们的重视, 其中带有酸性基团
的多糖, 特别是带有硫酸基的硫酸酯多糖由于其具
有抗H IV 等多种病毒的作用, 尤为受到关注[1, 2 ]。硫
酸酯多糖中硫酸基的取代度对其活性的影响较大,
通常取代度较大的抗病毒活性更强。研究植物多糖
包括硫酸酯化在内的化学修饰以增强和拓展其生物
·34·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004204206
基金项目: 国家科技部科研院所科技开发专项资金 (2002EG163191) ; 江苏省药用植物生物技术重点实验室开放基金 (KJS02118)
作者简介: 陈景耀 (1974—) , 男, 江苏泗阳人, 硕士研究生, 主要从事植物化学及天然活性物质的研究、新药开发。
T el: (025) 83598216　E2m ail: m usiclike@ 1631com3 通讯作者
学效应, 已成为当前实现中医药现代化的重要工作
之一。香菇多糖、牛膝多糖、高山红景天多糖、黄精多
糖的硫酸酯化的研究已经取得了一定的进展[3～ 5 ]。
　　白芨系兰科植物白芨B letilla stria ta (T hunb1)
R eichb1 f1 的干燥块茎。具有收敛止血、消肿生肌之
功效, 临床上广泛用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮
疡肿毒、肺结核咳血、溃疡病出血等症。白芨块茎中
含有丰富的白芨胶, 白芨胶的主要成分是中性白芨
杂多糖, 属吡喃型葡甘聚糖[6 ]。本实验选择来源丰富
的白芨多糖进行硫酸酯化修饰研究, 旨在寻找适用
高效的修饰方法, 以期找到高活性的修饰产物, 为多
糖的修饰及其构效关系的研究积累有价值的资料,
白芨多糖硫酸酯化的研究也将为充分利用白芨的药
用价值开辟新的途径。
1　材料与仪器
白芨块茎由南京野生植物综合利用研究院药材
基地提供, 并经该院张卫明研究员鉴定。葡聚糖凝胶
Sephadex G2100 为 Pharm acia 公司产品, 离子交换
纤维素D E252 为W hatm an 公司产品, 考马斯亮蓝
G2250 为 Sigm a 公司产品, T FA 为 F luka 公司产
品, 其他试剂均为国产分析纯。
　　冷冻干燥器 (日本岛津公司) , 3k30 低温高速离
心机 (Sigm a 公司) , R E—52 旋转蒸发仪 (上海青浦
沪西仪器厂) ,UV —754 分光光度计 (上海第二分析
仪器厂) , B IO 2RAD 低压色谱系统 (美国B IO 2RAD
公司) , H P1100 高效液相色谱仪 (美国H P 公司)。
2　方法与结果
211　白芨多糖的制备[6, 7 ]: 取干燥的白芨块茎, 粉
碎, 过 20 目筛, 干燥、称取 60 g 备用。10 倍蒸馏水
60 ℃浸提 4 h, 重复 3 次, 合并提取液, 滤过, 离心
(5 000×g ) 10 m in, 合并上清液, 旋转蒸发器浓缩,
3 倍无水乙醇沉淀, 离心 (5 000×g ) 8 m in, 取沉淀
真空冷冻干燥, 得白芨粗多糖。Sevag 法脱蛋白, 考
马斯亮蓝 G2250 法检测至无蛋白质被测出。以 3 倍
体积的无水乙醇沉淀, 离心, 收集沉淀用自来水透析
3 d, 再用蒸馏水透析 1 d, 真空冷冻干燥, 备用。经
D E252 阴离子交换纤维素, 仅得蒸馏水洗脱部位一
个单峰, 冷冻干燥后再上 Sephadex G2100 分子筛柱
色谱分离, 蒸馏水洗脱, 仍得一单峰, 为纯化白芨纯
多糖, 冻干备用。
212　白芨多糖的硫酸酯化[8 ]
21211　因素水平的确立: 试剂比例、反应温度、反应
时间对多糖硫酸酯化修饰的影响较大[6 ] , 因此选取
氯磺酸与吡啶的体积比 (A )、酯化温度 (B ) 和反应时
间 (C)作为因素, 见表 1。
表 1　因素水平表
Table 1　Factors and levels
水　平
因　　素
A Bö℃ Cöh
1 1∶2 45 2
2 1∶4 65 3
3 1∶6 85 4
21212　酯化试剂的制备: 因白芨多糖是一类吡喃型
多糖, 故采取氯磺酸2吡啶法进行酯化反应。在带有
搅拌装置和冷凝装置的三颈烧瓶中加入预冷的无水
吡啶, 并将烧瓶置于冰盐水浴中, 剧烈搅拌, 再将氯
磺酸于 40 m in 内逐滴加入。反应结束后, 撤去冰盐
水浴, 将酯化试剂于- 20 ℃封存, 备用。
21213　酯化工艺操作及结果: 精确称取经冷冻干燥
的白芨多糖 400 m g, 溶于 25 mL 无水甲酰胺中, 室
温下搅拌 30 m in, 加入酯化试剂, 置于水浴中搅拌
反应, 水浴温度及反应时间分别按照正交设计设定。
反应结束后冷却至室温, 反应液加入预冷的 100 mL
冰水中, 用 1 mo löL N aOH 中和至 pH 715。加入 3
倍体积的无水乙醇, 静置、离心, 将沉淀用自来水透
析 3 d, 蒸馏水透析 1 d。透析液经冷冻干燥得硫酸酯
化白芨多糖, 其呈白色纤维状。
　　采取硫酸钡比浊法测定硫酸基质量分数[9, 10 ]。
　　硫酸基取代度 (D S) = (1162×S% ) ö(32- 1102×S% )
式中 S 表示硫元素的质量分数
　　正交试验数据及结果分析[11 ]见表 2。
表 2　L 9 (34)正交试验结果
Table 2　Results of L 9 (34) orthogonal test
试验号 A B C D (误差) D S 产物量ög
1 1 1 1 1 1114 01516
2 1 2 2 2 0186 01605
3 1 3 3 3 0166 01598
4 2 1 2 3 0176 01701
5 2 2 3 1 1109 01703
6 2 3 1 2 1125 01768
7 3 1 3 2 0185 01498
8 3 2 1 3 1121 01460
9 3 3 2 1 1128 01651
D S
K 1 0189 0192 1120
K 2 1103 1105 0197
K 3 1111 1106 0187
R 0122 0114 0133
产物量
K 1 01573 01572 01581
K 2 01724 01589 01652
K 3 01536 01672 01600
R 01188 01101 01071
　　结果表明, 以取代度为指标, 由于时间因素的极
差大, 所以反应时间的影响较大, 各因素对取代度的
·44· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
影响程度依次为C > A > B , 即依次是反应时间、酯
化试剂比例、反应温度。最佳组合为A 3B 3C1。以产物
量为指标, 试剂比例因素的极差大, 试剂比例的影响
较大, 各因素对产物量的影响程度依次为A > B >
C, 即依次是酯化试剂比例、反应温度、反应时间, 最
佳组合为A 2B 3C 2。
　　对上述两个指标的结果分析进行方差分析, 各
因素对取代度影响差异不显著 (P > 0105) , 由表 3
的结果看试剂比例对产物量的影响显著 ( P <
0105) , 综合考虑取代度和产物量的情况下, 试剂比
例对取代度影响不显著, 对产物量影响显著, 故选择
1∶4。反应温度选择两者一致的 85 ℃, 从实际结果
和节省时间考虑, 反应时间选择 2 h。所以最佳组合
选择A 2B 3C 1, 即试剂比例 1∶4, 反应温度 85 ℃, 反
应时间 2 h, 取代度达到 1125, 产物量为 01768 g。该
反应组合在 9 个试验中产物量最高, 取代度与最高
的 1128 差异无显著性。
表 3　以产物量为指标的方差分析
Table 3　Var iance analysis based on y ield as index
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F 值 显著性
A 01059 4 2 01029 7 21149 P < 0105
B 0. 017 3 2 0. 008 7 6. 27
C 0. 008 2 2 0. 004 1 2. 95
D 01002 8 2 01001 4
　　F 0105 (2, 2) = 19100　F 0105 (2, 6) = 5114
213　酯化产物纯度鉴定: 色谱条件: Shodex OHpak
SB 2802HQ ( 300 mm × 718 mm ) , 流动相为 011
mo löL 磷酸盐缓冲液 (pH 618) , 体积流量为 015
mL öm in, 柱温为 45 ℃, H P1100 折光示差检测器。
精密称取样品适量, 用流动相配制成 3 m gömL 溶
液, 进样 20 ΛL , 见图 1。可见酯化产物为一个单一
峰, 即得到的样品是均一的多糖硫酸酯。
图 1　白芨多糖硫酸酯的 HPLC 图
F ig1 1　HPLC chromatogram of sulfa ted BSPS
214　工艺验证试验: 按照优化工艺条件制备 3 批样
品, 结果硫酸基取代度为 1127 (R SD = 1177% ) , 产
物质量为 01759 g (R SD = 1154% ) , 说明该工艺条
件下, 产物得率和取代度均较高, 明显优于正交试验
的其他组。
3　讨论
白芨多糖是吡喃型多糖, 实验结果表明采取氯
磺酸2吡啶法进行酯化效果较好。由于对多糖硫酸酯
化程度影响起主要作用的因素有酯化试剂比例、反
应温度和反应时间等。因此选择了这 3 个因素进行
考察, 采取了 3 因素 3 水平的正交设计试验。从实验
结果看, 如果以产物量考察的话, 最好的组合方式是
A 2B 3C 2, 同时也能看出, 酯化试剂的比例对产物得率
的影响已达显著水平。而如果单独以硫酸基取代度
为指标, 则最好的组合方式是A 3B 3C 1, 其中反应时
间对结果的影响较大, 但未达显著影响。综合考虑硫
酸基取代度和产物量的情况下选择A 2B 3C1 为最佳
组合。其后进行的工艺验证实验表明这 3 个参数对
酯化产物的取代度较高且稳定, 产物量亦高。对进一
步扩大实验有指导和参考价值。
　　白芨含有丰富的白芨胶——中性杂多糖, 对其
进行硫酸酯化的修饰, 旨在生产成本低廉、产物量
大、生物学活性高、应用广泛的白芨硫酸多糖, 为白
芨和白芨多糖的深度开发和其在医药方面的应用,
展示出深远的前景。
　　关于白芨硫酸多糖理化性质的测定和分析都已
完成, 细胞水平和动物学的生物学活性的实验及硫
酸酯化的白芨多糖和未酯化的白芨多糖生物学活性
的比较也都在顺利进行之中。
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不同炮制方法对泽泻中泽泻醇 B23-乙酸酯的影响
段　启1, 王少军2, 龚千锋1, 杨世林2, 曹　君1, 李创军1Ξ
(11 江西中医学院, 江西 南昌　330006; 21 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心, 江西 南昌　330077)
摘　要: 目的　探讨不同炮制方法对泽泻中泽泻醇B 232乙酸酯的影响。方法　采用 R P2H PL C 法。反相H ypersil
OD S C18柱 (200 mm ×416 mm , 5 Λm ) , 以乙腈2水 (70∶30)为流动相, 检测波长为 208 nm。结果　樟帮麸炒法的质
量分数为 01156 5% , 生品为 01155% , 而其他炮制品质量分数均低于生品。结论　不同炮制方法、辅料对泽泻各炮
制品中泽泻醇B 232乙酸酯含量有一定的影响。
关键词: 泽泻; 泽泻醇B232乙酸酯; 炮制; 高效液相色谱
中图分类号: R 28411; R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670 (2005) 01 0046 03
Effects of d ifferen t processings on a l isol B23-aceta te in A lism a or ien ta le
DUAN Q i1, W AN G Shao2jun2, GON G Q ian2feng1, YAN G Sh i2lin2, CAO Jun1, L I Chuang2jun1
(11 J iangx i Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, N anchang 330006, Ch ina; 21 N ational Pharm aceu tical
Engineering Center fo r So lid P reparat ion in Ch inese H erbalM edicine, N anchang 330077, Ch ina)
Abstract: Objective　To invest iga te the effects of d ifferen t p rocessing m ethods on aliso l B 232aceta te
in A lism a orien ta le1 M ethods 　 T he con ten ts of a liso l B 232aceta te w ere determ ined by R P2H PL C1
Ch rom atograph ic condit ion s included H ypersil C 18 co lum n, mob ile phase: aceton it rile2w ater ( 70∶30) ,
detect ing w avelength: 208 nm 1 Results　T he con ten t of a liso l B 232aceta te in p rocessing samp le st ir2baked
w ith b ran by the m ethod of Zhangbang w as 01156 5% , the crude samp le w as 01155% , and the con ten t of
a liso l B 232aceta te in o ther p rocessing samp les w as less than the crude samp le1 Conclusion 　D ifferen t
p rocessing m ethods and ajuvan ts show a certa in influence on the con ten ts of a liso l B 232aceta te in its
d ifferen t p rocessed p roducts1
Key words: A lism a orien ta le (Sam 1) Juzep; a liso l B 232aceta te; p rocessing; H PL C
　　泽泻为泽泻科植物泽泻 A lism a orien ta le
(Sam 1) Juzep 1 的干燥块茎, 味甘、性寒, 归肾、膀胱
经, 具有利小便、清湿热的功能, 主要用于小便不利、
水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、高血脂
等。泽泻经盐炙后可引药下行, 并能增强泻热作用,
利尿而不伤阴。经麸炒后寒性稍缓, 长于渗湿和脾,
降浊以升清, 且泽泻醇B 232乙酸酯在各主产区的泽
泻中质量分数较高[1 ] , 故以之作为控制泽泻质量的
指标性成分。近年来泽泻的研究多限于化学成分及
药理研究, 其炮制工艺研究则较少。本实验采用《中
华人民共和国药典》盐炙法、建昌帮盐炙法、樟帮盐
炙法、酒炒法、烘法、清炒法、樟帮麸炒法、盐麸法对
泽泻进行炮制, 测定其炮制品中泽泻醇B 232乙酸酯 的质量分数, 以期为探讨泽泻不同炮制品中有效成分变化的规律, 完善泽泻饮片质量标准提供参考。1　仪器与材料A gilen t 1100 高效液相色谱仪,A gilen t 1100 色谱工作站。M ET TL ER A E 240 电子天平, KQ 318T型超声波清洗仪。泽泻A 1 orien ta le (Sam 1) Juzep 1干燥块茎, 于 2003 年 2 月采收于江西广昌, 经本校鉴定教研室鉴定。泽泻醇B 232乙酸酯为本课题组自制, 经色谱分析纯度大于 98%。乙腈、甲醇为色谱纯, 丙酮, 醋酸乙酯为分析纯。2　样品的制备211　药典盐炙法泽泻: 先将食盐加适量的水溶解后, 滤过备用。取泽泻片, 加盐水拌匀, 闷透, 置锅内,
·64· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004204226